세포질 구성 요소를 식별 하는 간단한 형광 기반 기자 분석 결과 리 독 소에 필요한 체인 (RTA) 효 모에 인신 매매

요약

원고, 우리는 밀매에 관여 하 고 식물 독 소 리 (RTA)의 소 단위는 세포 독성의 프로세스를 죽이고 세포 구성 요소를 식별 하는 효 모 기반 형광 기자 분석 결과 사용 하 여를 설명 합니다.

초록

박테리아 및 식물 A B 독 소는 cytosol에서 그들의 세포내 별로 도달 하 고 궁극적으로 죽 진 핵 세포에서 자연 밀매 경로 악용 /. 이러한 A / B 독 소는 효소 활성의 Asubunit (예를 들어, 신은 독 소 (RTA)) 및 하나 이상의 셀 바인딩 Bsubunit(s) 독 소에 특정 바인딩 세포 표면 수용 체에 대 한 책임은 일반적으로 구성. 어떻게 우리의 현재 지식 A / B 독 소 효율적으로 endocytosis 및 세포내 단백질 높은 진 핵 세포에서 정렬 같은 기본적인 세포질 기계 장치를 이해 하기 도움이 셀 과학자를 취하게 할 수 있다. 의료의 관점에서 그것은 마찬가지로 환자에 대 한 적절 한 치료 솔루션을 찾을 수 또는 결국 암 치료에 대 한 치료 독 소-기반 응용 프로그램 개발에 주요 독 소 밀매 경로 식별 하는 것이 중요.

A의 게놈 넓은 분석 이후 / B 독 소 포유류 세포에서 인신 매매는, 시간이 걸리는, 복잡 하 고 비싼, A에 여러 연구 / B 독 소 전송 효 모 모델 유기 체 Saccharomyces cerevisiae에서 수행 되었습니다. 효 모와 더 높은 진 핵 세포에서 덜 복잡 하 고, 기본적인 세포질 과정 임에도 불구 하 고 비슷한과 효 모에 얻은 결과 매우 자주 포유류 상황에 전송할 수 있습니다.

여기, 우리 누 룩에서 RTA의 세포내 매매 분석을 신속 하 고 사용 하기 쉬운 기자 분석 결과 설명 합니다. 새로운 분석 결과의 필수적인 이점을 cytosol에 뿐만 아니라 RTA 복고풍-전 바인딩과 그물 (응급실)에서 조사를 기회 이지만 오히려 endocytosis 퇴행 성 독 소 수송 원형질 막에서 응급실에. 분석 결과 vivo에서 번역 후 녹색 형광 단백질 (GFP)의 형광 방출 통해 RTA 독성의 간접 측정을 허용 하는 기자 플라스 미드의 사용. RTA 28S rRNA depurination에 의해 효율적으로 단백질 생 합성의 개시를 방지, 이후이 분석 결과에서 수 있습니다 호스트 세포 단백질의 식별을 변경의 검색을 통해 세포내 RTA 전송에 관련 된 형광 방출.

서문

독 소를 생산 하는 박테리아에 의해 감염에서 고통 받는 환자 효율적인 치료 치료는 여전히 크게 실종 이후 특히 각 사회 의료 시스템에 대 한 심각한 의료 및 금융 부담을 나타냅니다. 새로운 치료 전략, 의학 관련 A의 복잡 한 중독 메커니즘 개발 / B 독 소 콜레라 독 소, 시가 독 소, 또는 리 등 완벽 하 게 구현할 수 있는 새로운 강력한 분석 실험에 따라 분자 수준에서 이해 될 필요가.

최근 몇 년 동안 여러 연구 A를 분석 하려고 / 효 모 및 방사성 독 소 같은 시간이 소요 되 고 비용 집약적인 메서드를 사용 하 여 포유류 세포에서 B 독 소 운송 라벨 siRNA 기반 심사로^{1,2 3을}접근 한다. 경우에 따라 독 소 매매 시각 있다 vivo에서 형광 현미경 검사 법에 의해 fluorophores, 양자 점, 또는 형광 단백질^4,5소 단위 개별 독 소의 화학 그리고/또한 유전 결합 후. 불행히도, 이러한 수정 종종 비활성 또는 변경 된 독 소의 자연 속성으로 이어질. 다양 한 과학적인 질문에 직접 답변을 또 다른 우아한 방법은 이다 lacZ, luciferase 등 형광 단백질 효소에 따라 기자 시스템의 사용 (예: GFP 또는 Discosoma sp. 빨간 형광 성 단백질 ( dsRed))입니다.

이 원고는 S. cerevisiae에 extracellularly 적용된 RTA의 세포내 수송에 필요한 세포질 구성 요소를 식별 하는 간단한 프로토콜 설명 합니다. 따라서, GFP 뒤 응급실 가져오기 N 맨끝 신호를 포함 하는 형광 기자 플라스 미드 GFP 형광 방출 후에 vivo에서 RTA 중재 단백질 번역 억제를 직접적으로 측정 하는 단백질 생 합성 센서 역 번역⁶. 경우는 RTA endocytosis 및 세포내 매매 부정적인 (또는 긍정적인) 영향을 야생-타입에 비해 특정 효 모 삭제 돌연변이에이 GFP 형광 방출⁶증가 (또는 감소)를 통해 감지할 수 있습니다.

지금까지, 모든 방법을 분석 하는 효 모 세포에서 RTA 전송 RTA의 응급실 cytosol 복고풍 전 프로세스에 제한 되었습니다. 이러한 인공 시스템에서 RTA는 응급실 가져오기 신호를 포함 하는 자살 형^1,7에 결과 유도할 수 있는 발기인에서 표현 된다. 셀 리의 B 소 단위 바인딩 마찬가지로이 원고에 설명 된 실험 설정에서 누락 된 고, 따라서, 완전히 나타내지 않는 신은 holotoxin 중독⁸의 자연 상황, 독 소 전송 플라즈마에서 응급실에 Golgi 기구 통해 막이 소설 분석 결과와 밀접 하 게 유사 될 수 있습니다. 흥미롭게도, 파일럿 연구에서 얻은 예비 결과 RTA에서 사용 하는 밀매 경로 신은 holotoxin의 중독 경로와 눈에 띄는 유사성을 공개를 나타냅니다.

요약, 설명된 방법 RTA endocytosis에 선택한 세포 단백질 및 효 모에 인신 매매의 특정 역할을 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또한,이 실험적인 체제 생산과 다양 한 효 모와 세균 종 zymocin 또는 시가 독 소를 분 비 하는 독 소를 비활성화 다른 리보솜에 쉽게 적응 될 수도 있습니다.

프로토콜

참고: 일반 실험 작업 과정에 대 한 개요는 그림 1에 묘사 된다.

주의: RTA 인 간에 대 한 매우 독성이 있다. 안전 연구소 권한 S2 (biosafety 수준 2에 해당)이 필요 합니다. 전체 실험 동안 장갑을 착용 합니다.

1. 분리 표현의 대장균 에서 RTA의 태그

1. 대장균 세포 식 플라스 미드 pET24-RTA_{(그의) 6} 또는 표준 electroporation 프로토콜^9,10를 사용 하 여 빈 벡터 pET24a⁽⁺⁾ 로 변환 합니다. 셀 빈 플라스 미드를 포함 하는 부정적인 컨트롤 역할을 합니다.
2. 대 포함 (µ g/100ml) 파운드 플레이트에 긍정적인 클론의 선택, RTA 식 플라스 미드 또는 5 mL 파운드_칸 매체 (파운드 매체 대의 100 µ g/mL와 함께)에 빈 벡터를 포함 하는 세포를 접종 하 고 37 ° C와 24 h에 대 한 220 rpm에서 품 어.
3. 5 mL 사전 문화 1 L 파운드_칸 매체를 보충 하 고 셀에는 0.8-1.0 (대략 3-4 h)의 OD₆₀₀ 에 도달 했습니다 때까지 37 ° C 그리고 220 rpm에서 세포를 품 어. 그 후, 문화 온도 28 ° C를 줄이고 1 M H₂o. 이소프로필-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 재고 솔루션의 준비
4. 1 m m의 최종 농도에 IPTG을 추가 하 여 대장균 의 RTA 식 유도.
5. 3.5 h 28 ° C 그리고 220 rpm 10000 x g와 10 분, 4 ° C에서 원심 분리 하 여 수확 셀 후 씻어 두 번 바인딩 버퍼 (500 mM NaCl, 10mm 이미, 및 20 m m KH₂포₄ 의 5 mL와 펠 릿 pH = 7.4) 10000 x g와 10 분, 및 5 mL 바인딩 버퍼 펠 릿 resuspend 4 ° C에서.
   참고: 프로토콜이이 단계에서 일시 중지 될 수 있습니다 고 셀 몇 일 동안 80 ° C에 저장 될 수 있습니다.

2. 정화 친화성 크로마토그래피를 통해 그의 태그 RTA의

1. 얼음 다음 프로토콜을 사용 하 여 셀 sonicate: 15 s 펄스 (20 미크론), 30 s 일시 중지. 5 번이이 단계를 반복 합니다.
2. 세포 lysate 21000 x g와 15 분 동안 4 ° C에서 원심 고 상쾌한 멸 균 주사기 필터 시스템 (0.2 µ m 기 공 크기)를 사용 하 여 필터링 합니다.
   참고: 성공적으로 sonicated 샘플의 펠 릿 셀 투명 한 테두리를 표시합니다.
3. Ni^{2 +}5 mL를 갖춘 자동된 정화 시스템을 사용 하 여-는 살 균 필터링 대장균 표면에 뜨는에서 그의 태그 RTA 분수 정화 선호도 열을 기반으로. 일반적으로, 1 mL/min의 속도 차입 사용 하 고 효율적인 비 독 소 바인딩 및 독 소 활동의 손실을 방지 하기 위해 전체 정화 시스템을 냉각.
   참고: 효율적인 RTA 정화에 대 한 매개 변수는 표 1에 나열 됩니다. 베 커 외를 참조 하십시오. 대 한 자세한 내용은⁹.
   1. 간단히, 바인딩 버퍼 저장소 버퍼 제거의 20 mL와 선호도 열 equilibrate. 주사기를 사용 하 여 선호도 열에 상쾌한 살 균 필터링을 적용 합니다.
   2. 열 바인딩 버퍼 열에서 언바운드 단백질 제거 하의 25-35 mL 씻으십시오. 세척 단계를 수행 하는 280에서 UV 흡 광도까지 nm 초기 UV 값은.
   3. 20-35 ml 차입 버퍼의 바운드 RTA 분수 elute (이미 500 m m, 500 m m NaCl, 20mm KH₂포₄, pH = 7.2) 얼음 (그림 2A , 그림 2B)에 샘플을 계속 하 고.
      참고: RTA 분수의 차입 증가 UV 흡수에 의해 표시 된다. 일반적인 바인딩 단백질 오염을 방지 하기 위해이 분수를 독점적으로 수집을 note 하십시오.
   4. Eluted 샘플 20 µ L를 사용 하 여 수행 Coomassie 파란 얼룩이¹¹ 또는 서쪽 오 점 분석^12,13 (선택 사항). 사용 하 여 기본 반 그의 항 체 (1:1, 000) 보조 안티-mouse-IgG-HRP (1:10, 000) RTA를 감지 하 여 샘플 순도 (그림 3)를 확인 합니다.
   5. 5 mL 염 열에 eluted RTA 분수 desalt 고 0.8 M 톨에 샘플을 equilibrate.
      1. 염 열에 의해 정화 시스템의 선호도 열을 장착 하 고 처음 0.8 M sorbitol의 20 mL와 함께 열을 equilibrate.
      2. 주사기를 통해 열에 eluted RTA 분수를 적용 합니다. 0.8 M sorbitol의 100 mL와 열 세척 하 고 즉시 UV 흡수 증가 (그림 2C)를 시작으로 15 mL 튜브에 desalted RTA 분수 elute.
      3. 4 ° c.에 eluted RTA 분수를 저장
         참고: 직접 전도도 증가 소금 오염을 피하기 위하여 때 RTA 분수 샘플링을 중지 합니다. 염 절차에 대 한 매개 변수는 표 1에 나열 됩니다.
4. 10000 x g와 4 ° C 10 kDa 컷오프 스핀 열 1-2 mL의 최종 볼륨을 사용 하 여 30-180 분 eluted RTA 분수를 집중 하 고 3-4 주 4 ° C에서 샘플을 저장할.
   주의: RTA 활동의 완전 한 손실에 대 한 단서를 동결 이후 샘플을 동결 하지 않습니다.
5. 단백질 농도 기존의 단백질 결정 키트를 사용 하 여 결정 합니다. 단백질 농도 1-1.5 mg/mL의 범위에 있어야 합니다.
   참고: RTA 단백질 농도가 너무 높은 경우를 침전 하는 경향이 있다 (> 5 mg/mL).

3. 효 모 세포 벽 제거 및 변환

1. 야생-타입 또는 선택 된 효 모 삭제 돌연변이는 GFP 기자 플라스 미드 pRS315-K28_SP-GFP⁶ 표준 리튬 아세테이트 변환 방법¹⁴를 사용 하 여 변환. 셀 신 드롭 아웃 (d/o)를 품 어 긍정적인 클론 선택에 대 한 2-3 일 동안 30 ° C에서 포도 당 플레이트 (2% 포도 당, 한 천 1.5%, 0.5% 염화 황산 염, 0.17% 효 모 질소 기지 (YNB), 및 0.087 %d / o 혼합 신 없이).
2. 각 접시에서 3 다른 효 모 클론을 선택 하 고 220 rpm 및 30 ° C OD₆₀₀ ~ 신 d/o 유 매체 (2% 유, 황산 암모늄 0.5%, 0.17 %YNB, 0.087 %d / o 신 없이 혼합) 100 mL에 클론을 접종 = 1.0-2.0 (2-4 x 10⁷ 셀/mL)입니다.
   참고: 다른 효 모 삭제 긴장의 세포 성장이 다르다. 모니터 세₆₀₀ 는 분 광 광도 계를 통해입니다.
3. OD₆₀₀ 값을 계산 하려면 OD₆₀₀ 샘플 희석 0.1-0.3 = (1:5 1:10 희석) OD₆₀₀ 는 분 광 광도 계에서 측정. 참고로, H₂O 신 d/o raffionose 매체의 해당 금액으로 보완을 사용 합니다.

마지막으로, resuspend OD₆₀₀ = 살 균 물 (5 x 10⁸ 셀/mL) 5 mL에 125.

10000 x g에 5 분 동안 25 ° C에서 세포를 원심, 세척, 살 균 물 5 mL로 두 번 셀 및 셀 50 mL spheroplasting 버퍼에 resuspend (0.8 M sorbitol, 10 mM Tris HCl (pH 7.5), 10 m m CaCl₂, 2 m m dithiothreitol (DTT), 그리고 200 µ g/mL 용균성 효소).

50 mL 문화 100 rpm 및 90 분 선택 사항에 대 한 30 ° C를 품 어: 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 spheroplast 형성 15 분 마다 모니터링. 현미경, 어두운 반투명 회색 셀에 있어야 합니다. 브라이트 (refractile) 세포는 충분히 소화 하지, 반면 귀신 (창백한 회색, 있으면, 내부 구조와 셀) 소화 이상.

각 샘플에 대 한 spheroplast 준비 효능을 확인 하십시오.

1. 마무리 단계 3.5, 496 µ L spheroplasting 버퍼 (약 2 × 10⁶ spheroplasts) spheroplasted 50ml 문화 4 µ L를 혼합 하 고 400 x g에서 10 분 원심 후.
2. Resuspend 펠 릿 10 mL H₂O에서에서 증 류, 소용돌이 샘플 30 s, 및 10 µ L 신 d/o 포도 접시 (2% 포도 당, 한 천 1.5%, 0.5% 염화 황산, 0.17 %YNB, 및 신 없이 0.087 %d / o 혼합)에 샘플의 밖으로 접시.
3. 30 ° c.에 3 일에 대 한 셀을 품 어 접시에 성장된 셀 식민지의 총 수를 계산 합니다. 데이터 평가 사용 하 여 샘플만 효율 98% 이상 (총 셀 식민지 수 < 40 식민지/접시).

원심 분리기 안정화 단계 400 g x 5 mL로 두 번 10 분 및 세척 셀 4 ° C에서 3.5에서에서 셀 신 d/o 유 미디어 (0.8 M sorbitol, 2% 유, 황산 암모늄 0.5%, 0.17 %YNB과 신 없이 0.087% 탈락 믹스). 5 mL 안정된 신 d/o 유 매체 (1 x 10⁸ 셀/mL)에 셀 resuspend 고 직접 GFP 기자 분석 결과 측정 (제 4)에 대 한 셀을 사용 합니다.

4. GFP 96 잘 접시에 기자 시험 측정

1. 효 모 세포 spheroplasts 96 잘 접시 (200 µ L/잘)로 3.7 단계에서 얻은 개 씨.
2. 70 µ L 안정된 신 d/o 유 매체 부정적인 컨트롤 포함을 추가 (eluate의 Ni^{2 +}-선호도 순화 된 세포 lysate 빈 벡터 표현 IPTG 유발 대장균 세포에서) 또는 5 µ M (최종 RTA 농도에 RTA를 정화 RTA 160 g/l에 해당)에 각 잘.
3. 30 µ L 안정 갈 락 토스 솔루션 (30% 갈 락 토스, 0.8 M sorbitol) GFP 식 유도 이후에 측정을 시작 하는 즉시 추가 합니다.
   참고: 실험 당 적어도 3 기술 복제를 수행 하 고 효 모 스트레인 당 3 생물 복제 합니다.
4. 마무리 샘플 준비 (단계 4.1 4.3), 후 형광 판독기에 96 잘 접시를 넣어 하 고 측정을 시작 합니다. GFP 형광 검출에 필요한 설정 475/509 nm 필터를 사용 합니다. 30 ° C, 120 rpm에서 20 h (10 분 간격으로 측정)의 시간 창에 1mm의 동요 직경 측정을 수행 합니다.
   참고: GFP 필터 집합은 일반적으로 모든 리더 시스템에서 사용할 수 있는. 온도, 시간 창, 간격, 및 RTA 농도 측정 자신의 필요를 위해 조정할 수 있습니다. 대표 결과 그림 4에 나와 있습니다.
5. 선택 사항: 측정에 추가 내부 컨트롤을 사용 하 여 품질 관리에 대 한. 30% 갈 락 토스 (GFP 유도 없음) 대신 30 µ L 안정된 신 d/o 유 매체를 추가 하 여 부정적인 제어를 준비 합니다. 또한, 0.8 M sorbitol 안정 G418 솔루션 (300 µ g/mL)의 70 µ L를 추가 합니다. 그것은 효 모에 GFP 식 방지 단백질 번역 억제제 G418 단백질 억제에 대 한 긍정적인 제어로 제공 합니다.
6. 다음 방정식에 따르면 h는 20 시간 포인트에 대 한 % 상대 GFP 형광 계산 ( 그림 4A참조): 어디 NC는 부정적인 컨트롤
   1. 각 측정 지점에 대 한 상대적인 GFP 형광 또는 결정 (이 경우 10 분에서 참고 단계 4.4) 위의 수식을 사용 하 여. 그림 4B같이 시간 (x 축)에 GFP 형광 강렬 (y 축)를 blotting으로 그래프를 만듭니다.

결과

이 원고에 설명 된 프로토콜의 일반적인 워크플로 그림 1, 대략 성공적인 RTA 정화 및 후속 GFP 기자 분석 결과 실험에 대 한 단일 단계 요약에 나와 있습니다. 각 개별 단계에 대 한 더 자세한 설명은 프로토콜에서 찾을 수 있습니다. 그림 2 는 친화성 크로마토그래피 (그림 2A)와 빈 벡터 제어 (

토론

위의 프로토콜을 수행할 때 실험의 성공적인 결과 달성 하기 위해 다음 제안 사항을 권장 합니다.

분리 단백질 식, 1 mM의 IPTG 농도 초과 하지 중요 하다. IPTG 농도 > 1mm 억제 발기인 유도 RTA 표현과 독 수익률 낮은 리드. 또한, 셀 수 없습니다 재배 포함 체 형성, 비효율적인 폴딩, 및 독 소 비활성화를 방지 하기 위해 28 ° C 보다 높은 온도에서. RTA 식 (예를 들어, 20-28 ° C)...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacterial and yeast strains
E. coli BL21 DE3(Gold)	Aligent Technologies	230130
S. cerevisiae BY4742	Euroscarf	Y10000
S. cerevisiae BY4742 deletion mutants	Dharmacon	YSC1054	whole collection
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmids used in this protocol
pET24a(+) (Novagen)	Millipore	69772-3
pET-RTA(His6)	Becker et al. (2016)3
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Zymolyase 20T	USBio	Z1000.250	lytic enzyme for cell wall removal
LB broth medium	Thermo Scientific	10855021	15 g agar was added for plate production
YNB	Thermo Scientific	DF0335-15-9
Ammonium sulfate	Sigma-Aldrich	A4418-100G
Yeast drop-out mix supplemts without leucine	Sigma-Aldrich	Y1376-20G
Agar	Sigma-Aldrich	05040-100G
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G
DTT	Sigma-Aldrich	10197777001
D-raffinose	Sigma-Aldrich	83400-25G
D-sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876-1KG
D-galactose	Sigma-Aldrich	G0750-10MG
G418	Thermo Scientific	11811031
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758-1G
Imidazole	Roth	3899.1
PAGE ruler prestained	Fermentas	26616	protein ladder used for Western analysis
Name	Company	Catalog Number	Comments
Material for RTA purification, desalting and reader measurements
Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro	Amersham
Soniprep 150	MSE		old model, other models available
Fluoroskan Ascent	Thermo Scientific	5210470	old model, not available anymore
ÄKTAPurifier	Thermo Scientific	28406266	Product is discontinued and replaced
HisTRAP HP column	GE Healthcare	17-5248-02
HiTRAP desalting column	GE Healthcare	11-0003-29
Midisart sterile filter	Sartorius	16534K	0.2 µm pore size
BCA protein assay kit	Pierce	23225
660 nm assay kit	Thermo Scientific	22660
96 well plates	Thermo Scientific	260860
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies (optional)
Anti-Tetra-His	Qiagen	34670	primary antibody; 1:1,000 dilution
Anti-mouse-HRP	Sigma-Aldrich	A9044-2ML	secondary antibody, 1:10,000 dilution