גירוי חשמלי טראנס כרונית והקלטה Intracortical בחולדות

Summary

פרוטוקול מפורט זה מתאר טראנס גירוי אלקטרודה השמה על העצם הטמפורלית במטרה לחקור קצר - ארוכת ההשפעות של גירוי חשמלי טראנס ב בחופשיות העברת חולדות.

Abstract

גירוי חשמלי של טראנס (מלון טס) היא גישה פשוטה יחסית ועוצמתי diffusely להשפיע על פעילות המוח באופן אקראי או באופן המופעלות אירוע לולאה סגורה. למרות מחקרים רבים מתמקדים היתרונות האפשריים ואת תופעות הלוואי של מלון טס במוח פיפטות ובריאה, יש עדיין הרבה שאלות פתוחות הבסיסית לגבי מנגנון הפעולה של הגירוי. לכן ברור הצורך שיטה לשחזור ועמיד לבדוק חריפה ואפקטים כרונית של מלון טס בחולדות. מלון טס יכול להיות משולב עם טכניקות התנהגותיות, אלקטרופיזיולוגיות, הדמיה רגיל לחקור רשתות עצביים בתוך vivo. ההשתלה של אלקטרודות גירוי טראנס אינו כופה אילוצים נוספים על הנבחנים תוך שהיא מציעה כלי רב-תכליתי גמיש לתמרן את פעילות המוח. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט, צעד אחר צעד כדי להמציא משתילים אלקטרודות גירוי טראנס להשפיע על פעילות המוח בצורה מוגבלת במשמורת במשך חודשים.

Introduction

גירוי חשמלי של טראנס (מלון טס) היא גישה מתודולוגי חשוב להשפיע על פעילות המוח בצורה מוגבלת חנותם. בהתאם לגודל מיקום האלקטרודות גירוי, מלון טס יכול להשפיע על אמצעי אחסון מוח גדולה, entrain אוכלוסיות עצביים diffusely^1,2,3. טראנס זרם ישיר גירוי מבחינה רפואית כבר אושרה לטיפול של הפרעת דיכאון^4,5ומחקרים רבים מתמקדים מציג את השפעת טראנס גירוי קוגניטיבי בני^{6 , 7}. יתר על כן, מבטיח דווח על תוצאות לגבי הפוטנציאל של מלון טס בשליטה התקפים אפילפטיים^8,9.

למרות המחקר אינטנסיבית, ישנם עדיין הרבה שאלות פתוחות לגבי מנגנון מפורט של פעולה, תופעות לוואי פוטנציאליות, התוצאה ארוכת הטווח של החלת זו שיטה^10,11,12. לכן, חשוב באופן קריטי יש פרוטוקול חזקות, לשחזור כדי לחקור את ההשפעות של מלון טס במודלים של בעלי חיים. בהתחשב בכך הפרעות רבות (למשל, אפילפסיה ומצבי דיכאון סכיזופרניה) יכול רק בהרחבה ייחקרו בבעלי חיים ערה, הטבע של מצבים רפואיים אלה בדרך כלל מחייבים טיפול ארוך טווח, אנו מספקים עבור פרוטוקול כרונית השרשה של טראנס אלקטרודות בחולדות. השיטה המוצגת כאן יכול לשמש למחקרים התנהגותיים או יכול להיות משולב עם ההשתלה של אלקטרודות הקלטה (קרי, חוטים, סיליקון הגששים, אלקטרודות juxtacellular) או עם windows הגולגולת כרונית לניסויים אלקטרופיזיולוגיות והדמיה מחקרים, בהתאמה. בהתאם לעיצוב הניסיונית, העיתוי של הגירויים יכול להיות אקראי או המופעלות אירוע סימנים התנהגותיים ספציפיים, או את מבוקשם אלקטרופיזיולוגיות של המוח מסוים הברית (התקפים, תנודות תטא)^{8, 11 , 13}.

חשוב לציין כי בניגוד הגישה האנושית משמש כיום, אשר משתמשת התגלמות אלקטרודות על העור, הנה אנחנו מראים שיטה מעסיקה נכון השתלה תת עורית על פני השטח של העצם הטמפורלית, מאז חולדות בקושי יסבול מניחים על העור שלהם, אשר הינו נגיש בקלות באמצעות את כפותיהם.

בקנה אחד עם העקרונות של החלפת, הפחתת עידון, בשל אופיו כרונית של ההשתלה, שיטה זו מסייעת להפחית את מספר בעלי חיים, מאז כל בעל חיים יכול להיות גויסו בתנאי ניסוי שונים במשך חודשים, המאפשר שימוש בעלי פחות לבחון השערות שונות.

במחקר הנוכחי, אנו מספקים פרוטוקול מפורט, צעד אחר צעד של טראנס אלקטרודה גירוי ייצור (איור 1 א'-ב'), להפגין ההשתלה כרונית של האלקטרודות מעל עצמות הרקה של חודש בן שש חולדה זכר רב-אוונס.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן הם לפי הוראות המועצה האירופית קהילות (86/609 ECC), אושרו על ידי הוועדה האתית לחקר בעלי חיים אלברט Szent-Györgyi רפואי, פרמצבטיקה מרכז של האוניברסיטה סגד (הארבעה עשר 218 2016).

1. ייצור של האלקטרודות גירוי

1. כדי לגרום גירוי אחד אלקטרודה, לחתוך שש חתיכות ארוך 10 ס מ של חוטים להתחבר מיניאטורי, להסיר 2 ס מ של חיפוי בקצה אחד, 1 ס מ בצד השני.
2. טוויסט שני כבלים יחד, לכל אותם על הצד קלופים קצר יותר.
3. רוכשים רצועה 3 קלטת האריזה של כל מעגל משולב עם התיק אויל-353.
4. לתפור את החוטים מעוות דרך החורים שלושה של החבילה. קטע קלופים עוד החוטים צריך להיות החללים של החבילה. מקם את הכבלים כך סוף הבידוד עולה בקנה אחד עם הקצה של החורים.
5. לשים את הבטון שיניים על החורים כדי לתקן את החוטים.
   התראה: הבטון שיניים חייבים להיות צפוף מספיק כדי להימנע דולף לתוך החלל של החבילה.
6. לאחר הבטון הקרושה (מינימום 10 דקות), הפוך את החבילה ולשים שכבה דקה של דבק מגע לתוך החור כדי ליצור את הבתולין לכיוון הבטון נקבובי. למנוע הדבקת את החוטים קלופים.
7. לסובב את כבלי יחד בצד קלופים קצר יותר, לכל אותם (איור 1 א').
8. תפוס על יותר מקולף קטע החוטים עם קצה פינצטה בסדר, לגלגל אותם מסביב, לעטוף אותם לחללים (איור 1B). חותכים כבל עודף, במידת הצורך.

2. ייצור של האלקטרודות הקלטה

1. כדי להקליט אחד ראה שלישיה אלקטרודה (איור 1C-D), לחתוך חתיכה ארוכה ס מ אחד של צינור נירוסטה באמצעות רוטרי במהירות גבוהה. הסר את הסנפיר מקצות הצינור עם מחט חדה ולהבטיח כי הצינור הוא נקי של פסולת ובלתי חדיר לחלוטין.
   הערה: אין להשתמש צבת, כפי שהם יעוות את הצינור.
2. כיפוף סיכה מרווח לוח מצופה זהב באורך מינימלי של 3 ס מ כדי ליצור בעל J-צורה. חתך את הרגל יותר של הצורה "J", הלחמה זה ביחד כדי לקבל בחזרה את הצורה המקורית כדי להפוך ג'וינט ניתן להפרדה בין חלק ליניארי ארוכה, שייערך על ידי המכשיר stereotaxic, הצורה 'U', אשר מחזיק האלקטרודה, לשמש נקודת עגינת . הדבק את הצינור והרגל קצר יותר של בעל "J" ביחד. הדבק בכמה ברים ארוך של 1 ס מ נוספים, במידת הצורך, יציבות.
3. לחתוך 3 חתיכות של 2.5 ס מ חוטים אלקטרודה ארוכה עם פלדה אל חלד, מספריים חדה במיוחד. ודא כי זה חתך ברורה וחדה, הבידוד לא נפגע על פני השטח המעגלית של הכבל אלקטרודה. כמו כן, ודא כי הטיפ לחתוך אינו כפוף בשל הכוח מוחל. בנד 1 או 2 מ מ בקצה אחד של כל אחד החוטים בזוויות שונות (למשל, כדור ישר שמאלה, אחד 45 ° ו מאונכים אחד) כדי להפוך אותם ניתן להבחנה.
4. ממלאים את הצינור עם החוטים, לבחור הריווח המתאים בין האלקטרודות לניסוי (למשל, קורטיקלית שדה מקומי פוטנציאליים (LFP) והרשמה הנוכחי מקור צפיפות (CSD), תיתכן המומלצת הטיפים של חוטי החשמל היוצאים פתיחה של הצינור: 4.5 מ מ, מ מ 4.1 ו 3.7 מ מ, בהתאמה). הערה איזה כבל מתאים לאיזה עומק לשמירה על הזמנת הערוץ המתאים.
5. ברגע החוטים ישר לימין אחד ליד השני ולא מקבילות עם הצינור, כדי לתקן את החוטים אלקטרודה, במקום טיפה אחת של דבק מגע נוזלי בשני קצותיו של הצינור עם מחט חדה. ודא כי הדבק זורם לתוך הצינורית עקב האפקט נימי, אך לא לכיוון של אתרי הקלטת בקצוות בולטות.
6. להכין לוח ממשק אלקטרודה עם microconnector תקין תואם עם מערכת הקלטה כדי לשמש.
7. להציג את קצות החוטים הלא-הקלטה, כפופות לתוך החורים של הלוח ממשק אלקטרודה המתאימה ערוץ ההקלטה הרצוי. כאשר כל החוטים הם בעמדה, לדחוף את סיכות זהב לתוך החורים עם פינצטה.
   הערה: ניתן לתקן סיכות זהב במקום באמצעות מלט שיניים, אך ברוב המקרים, הוא יציב מספיק גם בלי שלב זה בטיחות.

3. הרדמה

1. למקם את החיה בתוך תא אינדוקציה הרדמה אטום ולמלא את זה עם 4-5% של איזופלוריין באוויר רפואי 2 ל'/min.
2. כאשר העכברוש שכיבה, להסיר את החיה מן החדר ומניחים אותו בתוך מסגרת stereotaxic עם כלי האף של אוורור מתאים.
3. קבע את רמת איזופלוריין 2%, למרות שיעור זרימת האוויר יישאר זהה. בדוק את רמת ההרדמה. אם יש חוסר רפלקס הנסיגה כפת בתגובה צובט, המשך, אחרת להגדיל את עומק ההרדמה.
4. לפקח ולשמור על טמפרטורת הגוף של החולדה-37 ± 0.5 ° C עם מערכת ניטור homeothermic. Droplet של פרפין משחה למרוח את העיניים כדי למנוע לייבוש של הקרנית. חזור על הליך זה במהלך הניתוח כמה פעמים, אם יש צורך בכך.
5. Subcutaneously להזריק אטרופין 0.3 מ"ג/ק"ג כדי למנוע היווצרות ליחה את דרכי הנשימה. חזור על פעולה זו כל 4 שעות במקרה של ניתוחים ארוך יותר. לפקח על נשימה ולהתאים מאדה, במידת הצורך.

4. ההשתלה של גירוי, הקלטה אלקטרודות

הערה: תא לחץ כל הדרוש כירורגי כלים ולעקוב בקפידה את כללי ה asepsis ו א במהלך כל התהליך. להימנע מלגעת אזורים nonsterile מחוץ לאזור הניתוח. לטבול האלקטרודות ב ספירט אתיל (70%) במשך 30 דקות לפני ההשתלה.

1. הסר את רוב השיער הקרקפת עם שיער clipper. להחיל קרם depilatory על הקרקפת, להפיץ את זה באופן שווה על פני השטח, המתן מספר דקות. השתמש במרית להסיר בעדינות את הקצפת ואת השיער הנותר. יש לשטוף את העור עם מים, ואז עם חומר חיטוי.
2. להזריק לידוקאין 1-2% (לא יעלה על מנה הכוללת של 7 מ"ג/ק"ג) subcutaneously כדי להקהות את העור. החל טיפת הוטרינר משחה לעיניים (למשל, פרפין).
3. להפוך יסודי, חתך ארוך (~ 2 ס מ) הסאגיטלי האמצע עם איזמל, מן המצח בצוואר. לנתח את רקמות כולל קרום העצם מהגולגולת, ולאחר מכן באמצעות פינצטה מפסלת או שן לנקות את האזור שבין cristae של שתי עצמות הרקה. שמור את הגולגולת נחשף על-ידי היציבה ביתור העור בעזרת ארבעה בולדוגס.
4. בעדינות מקום בסדר פינצטה קצה העצם הטמפורלית תלול בין השרירים ולהפריד ביניהם. לבצע תנועות זיגינג לחשוף כל כך הרבה של פני השטח גדולים של העצם הטמפורלית ככל האפשר, רצוי מהקצה של עצם העורף למישור הפרונטליים, ללא פגיעה בשרירים.
5. במקום רטרקטורים bitemporally כדי לשמור על עצמות הרקה חשוף.
6. יש לשטוף פני השטח של הגולגולת עם 1-2 מ ל 3% H₂O_2, ואז לשטוף את זה עם 1-2 מ ל מים.
7. מילה נהדרת השטח של עצמות הרקה בזהירות רבה, תנגבי את הלחות עם מקלות עינית. בדוק אם האלקטרודות גירוי מתאים על גבי משטח נקי אנכי הגולגולת (הקצה העליון של האלקטרודה גירוי צריך להיות בקו אחד עם קצה crista של העצם הטמפורלית). הבולדוגס להתאים מחדש את רטרקטורים או לעצב האלקטרודות גירוי עם מספריים, במידת הצורך.
8. למלא החללים של הגירוי אלקטרודות עם electroconductive ג'ל ולשים שכבה דקה של דבק על גבי השפה של האלקטרודות.
9. במקום האלקטרודה גירוי על המשטח יבש של העצם הטמפורלית עם תנועה מדויקת אחת, מחזיק אותו בחוזקה במקום למשך דקה אחת עם פינצטה משובחים. ודא כי אין לחות הוא בקשר עם הדבק. תנגבי עם מקלות עינית, במידת הצורך
   שים לב: במקרה כל יציבות של האלקטרודה מנוסה, להסיר אותה. לאחר ניקוי העצם, חזור על שלב זה עם אלקטרודה לגירוי החדש.
10. לשים מלט שיניים על הקצוות של האלקטרודה גירוי, ואילו הלחות דולף של הרקמות הוא ברציפות התייבש עם מקלות עינית. מכסים האלקטרודה גירוי שלם עם מלט.
11. לאחר הבטון לחלוטין מוקשה, חזור על שלבים אלה על הצד contralateral.
12. לקדוח חורים בכל הגולגולת על עיגון ברגים. כונן ממוזערת ברגים לתוך החורים ולשים בטון שיניים מעליהם. שימוש בקוטר קטן יותר ~ 10% תרגיל הראש בהשוואה קוטר בורג.
13. בהתאם למטרת הניסויים, הלחמה מחבר בקצוות של הכבלים, למקם אותו על פני השטח, ו כיסוי עם מלט, או להמשיך השתלת אלקטרודות הקלטה של סיבים אופטיים או להכין חלון הגולגולת על הגולגולת. במקרה זה האחרון, הלחמה המחברים, לעגן אותם כדי הבונה רק בסוף. במקרה של צורך לטווח ארוך בו זמנית הקלטות מלון טס ו- LFP, שתל השלישייה אלקטרודה הנ ל במקום חוטים יחיד.
    הערה: תוכנית התקנה זו מאפשרת הסרת מצב נפוץ גירוי חפצי⁸. לקבלת הפרטים של הקלטה אלקטרודה השרשה, ראה הפרוטוקולים הקודמים^14,15.
14. לשטוף את רקמות חשופות בשפע עם חומר חיטוי. להזריק לידוקאין 1-2% (לא יעלה על מנה הכוללת של 7 מ"ג/ק"ג) subcutaneously.
15. הרקמה המתה קצוות הפצע וסגור אותם בתפרים קטעה פשוטה סביב השתל/המחבר. לחטא את הפצע עם povidone יוד.
16. להזריק 5 מ"ג/ק"ג carprofene subcutaneously. חזור על פעולה זו במידת הצורך.
    הערה: כל משככי כאבים אחרים עשוי לשמש תואמים את הדרישות שנקבעו על-ידי הוועד המקומי הרשאה אתית.
17. להשעות הרדמה, לשחרר את earbars ואת nosepiece, לשים את החיה בכלוב ההחלמה לאחר הניתוח להכרה.
18. ודא כי החיה תחת פיקוח צמוד במהלך השעות הראשונות לאחר הניתוח. נמשיך לעקוב אזור השתל מעת לעת.
    הערה: החיה לא אמורים להישאר ללא השגחה עד זה שהכרתו מספיק כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות. בית החיות בנפרד לפני התאוששות מלאה מן ההליך.

תוצאות

ההשתלה של גירוי כרוני אלקטרודות (איור 1B) יכול להיות משולב עם ההשתלה נוספים של הקלטה אלקטרודות (איור 1C-D). הגדרות כאלה מתאימים ליצור הקלטה לפי דרישה ומערכות גירוי להתערב עם פעילויות מוחיות ספציפיות. כאן אנו מציגים תוצאות נציג של זיה...

Discussion

השלב הקריטי ביותר של פרוטוקול זה הוא מדביק החבילה אלקטרודה על פני עצם. במקרה של איטום לקוי, נוצר פער בין האלקטרודות העצם, רקמה צלקתית המשני יכול לגדול לתוך הפער הזה, שמפחית את האיכות של גירוי. משטח העצם חייב להיות יבש לחלוטין במהלך השלבים של דבק על החבילה, במקרה של חווה חוסר היציבות של האלקט?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cyanoacrylate liquid	Henkel	Loctite 401
Cyanoacrylate gel	Henkel	Loctite 454
Wire for stimulation electrodes	Phoenix Wire Inc.	36744MHW - PTFE Microminiature Hook-Up Wire
Board spacer	E-tec Interconnect	SP1-020-S378/01-55
Connector	E-tec Interconnect	P2510I-02
Tape packaging for stimulation electrodes	Nexperia	74HC1G00GW	Tape packaging of any integrated circuit with SOT-353 case can be used
Grip Cement Industrial Grade	Caulk Dentsply	675571 (powder) 675572 (solvent)
Electroconductive gel	Rextra	ECG Gel
Recording electrode wire	California Fine Wire Co.	.002 (50 micron) Tungsten 99.95% (CFW Material #: 100-211), HMl-Natural, cut to 3.0 inch pieces, Round, Cut length piece wire
Ultrafine scissors	Hammacher Instrumente	Stainless HSB 544-09
Stainless steel tube	Vita Needle Company	29 RW, 304SS Tubing, T.I.G. Welded and Plug
High speed rotary saw	Dremel	Model # 395
Rotary saw holder	Dremel	Model # 220
Rotary saw cut-off wheel	Dremel	Model # 409
Ocular sticks	Lohmann-Rauscher	Pro-ophta Ocular Sticks
Wet disinfectant	Egis	Betadine
Dry disinfectant	Wagner Pharma	Reseptyl-urea
Drilling machine	NSK-Nakanishi United Kingdom	Vmax35RV Pack
Anchoring screws	Antrin Miniature Specialties, Inc.	000-120x1/16 SL BIND MS SS