Kronik Transkraniyal elektriksel stimülasyon ve Sıçanlarda Intracortical kayıt

Özet

Bu ayrıntılı protokolünü transkranyal uyarım elektrot yerleştirme temporal kemik üzerinde kısa ve uzun vadeli etkileri Transkraniyal elektriksel stimülasyon fareler serbestçe hareket araştırmak için açıklar.

Özet

Transkraniyal elektriksel stimülasyon (TES) diffüz beyin aktivitesi rasgele ya da kapalı döngü olayı tetikleyen bir şekilde etkilemek için güçlü ve nispeten basit bir yaklaşımdır. Birçok çalışma olası yararları ve sağlıklı ve patolojik beynindeki TES yan etkileri üzerinde duruluyor olsa da, hala stimülasyon etki mekanizması ile ilgili birçok temel açık sorular vardır. Bu nedenle, ortada açık bir akut test etmek için sağlam ve tekrarlanabilir bir yöntem ve TES kronik etkileri Rodents için gerekir. TES nöronal ağları içinde vivoaraştırmak için normal davranış, Elektrofizyolojik ve görüntüleme teknikleri ile kombine edilebilir. Beyin aktivitesi işlemek için çok yönlü ve esnek bir araç sunarken transkranyal uyarım elektrotlar implantasyonu deneysel tasarım ilave kısıtlamalar empoze değil. Burada biz imal ve beyin aktivitesi ay geçici kısıtlı bir şekilde etkilemek için transkranyal uyarım elektrotlar implant için ayrıntılı, adım adım bir protokol sağlar.

Giriş

Transkraniyal elektriksel stimülasyon (TES) beyin aktivitesi geçici kısıtlı bir şekilde etkilemek için değerli bir metodolojik yaklaşımdır. Boyut ve yerleşim stimülasyon elektrot bağlı olarak, TES büyük beyin birimleri etkiler ve nöron popülasyonları muhasebeleşmiş trene binmek^1,2,3. Transkraniyal doğru akım stimülasyon zaten tıbbi major depresif bozukluk^4,5ve transkranyal uyarım bilişsel etkileri insanların⁶ ' da gösterilen birçok çalışmalar odaklanmak tedavisi için onaylanmıştır ^{, 7}. Ayrıca, sonuçları Epileptik nöbetler^8,9kontrolünde TES potansiyeli ile ilgili rapor umut verici.

Yoğun araştırma rağmen hala birçok açık sorular ile ilgili eylem, olası yan etkileri ve bu yöntem^10,11,12uygulama uzun vadeli sonucu detaylı mekanizması vardır. Bu nedenle, eleştirel hayvan modellerinde TES etkilerini araştırmak için sağlam ve tekrarlanabilir bir protokol olması önemlidir. Birçok bozuklukları (örneğin, depresyon, epilepsi ve şizofreni) sadece kapsamlı bir şekilde uyanık hayvanlarda araştırılması ve doğa bu tıbbi koşullar genellikle uzun süreli tedavi gerektiren göz önüne alındığında, biz için bir protokol sağlar kronik Transkraniyal elektrotlar Sıçanlarda implantasyonu. Burada sunulan yöntem veya davranış çalışmaları için kullanılabilir veya kronik kafatası windows Elektrofizyolojik deneyler için kayıt elektrotlar (Yani, teller, silikon sondalar, juxtacellular elektrotlar) implantasyonu ile kombine edilebilir ve çalışmalar, sırasıyla görüntüleme. Deneysel tasarımına bağlı olarak, rasgele veya belirli davranış ipuçları veya belirli beyin Birleşik (nöbetler, teta salınımlarını)^8, Elektrofizyolojik işaretlerinden tetiklenen olay zamanlama uyaranların olabilir ^{11 , 13}.

Deri üzerine yerleştirilen elektrotlar bir şekillenme kullanan, şu anda kullanılan insan yaklaşımı aksine, işte subkutan implantasyon sağ temporal kemik yüzey üzerinde istihdam fareler beri çok az bir yöntemi göstermektedir ki söz önemlidir onların paws kullanarak kolayca erişilebilen kendi cilt üzerinde yerleştirilen bir şey tahammül.

İmplantasyon kronik doğası gereği yerine, azaltma ve arıtma, ilkelerine uygun, bu yöntem her hayvan kullanımı sağlayan farklı deneysel koşullarda ay, işe bu yana hayvanlar, sayısını azaltmak için yardımcı olur daha az sayıda hayvan çeşitli hipotezler test etmek için.

Bu da çalışmanın, biz transkranyal uyarım elektrot (şekil 1A-B) üretim ayrıntılı, adım adım bir protokol sağlar ve bu elektrotlar kronik implantasyonu altı aylık temporal kemik üzerinde göstermek erkek uzun-Evans sıçan.

Protokol

Burada açıklanan tüm Avrupa Toplulukları Konsey direktifleri doğrultusunda yöntemlerdir (86/609 ECC) ve Albert Szent-Györgyi tıbbi ve eczacılık Merkezi'nde Üniversitesi hayvan araştırma Etik Komitesi tarafından onaylanmış olan Szeged (XIV/218/2016).

1. stimülasyon elektrotlar imalatı

1. Elektrot, minyatür kancayı teller, altı 10 cm uzun parçalar koparıp bir stimülasyon yapmak kaplama bir ucunda ve diğer ucunda 1 cm 2 cm kaldırın.
2. İki kablo birlikte büküm ve onları vasıl belgili tanımlık kısa soyulmuş yan lehim.
3. Üç bant ambalaj SOT-353 durumda herhangi bir entegre devrenin bir şerit elde etmek.
4. Paketi üç deliklerden bükümlü tel dikiş. Kablolar soyulmuş artık bu segmentin paket boşluklar içinde olmalıdır. Yalıtım kenarına delikler doğrultusunda sonudur kabloları konumlandırın.
5. Diş çimento teller düzeltmek için üzerinde delik açarım.
   Dikkat: Diş çimento paket boşluğuna sızıntı önlemek için yoğun olması gerekir.
6. Çimento katılaşmış (en az 10 dk), paket flip ve deliğe doğru gözenekli çimento su geçirmez mühür oluşturmak için yapıştırıcı ince bir tabaka koy. Soyulmuş Teller yapıştırma kaçının.
7. Kabloları birlikte daha kısa soyulmuş tarafında büküm ve onları (şekil 1A) lehim.
8. Artık bu soyulmuş segment tellerin iyi cımbız ucunu yakala, onları etrafında rulo ve onları boşluklar (şekil 1B) sarın. Fazla kablo kesmek.

2. kayıt elektrotları imalatı

1. Tek bir kayıt yapmak için üçlüsü elektrot (şekil 1 c-D), paslanmaz çelik boru yüksek hızlı döner kullanarak bir cm uzun parçası kesilmiş gördüm. Fin tüp ucunun bir keskin iğne ile kaldırın ve tüp enkaz temiz ve tamamen geçirgen olduğundan emin olun.
   Not: tüp tahrif edecek pense, kullanmayın.
2. Altın kaplama tahtası spacer PIN en az bir J-şekil tutucu oluşturmak için 3 cm uzunluğu ile viraj. 'J' şeklinin daha uzun bacak kesme ve birlikte geri almak stereotaksik aygıt tarafından yapılacak, uzun doğrusal bölümü ve "U" şekli, elektrot tutan ve bir bağlantı noktası olarak hizmet arasında ortak bir çıkarılabilir yapmak orijinal şekli için lehim . Tüp ve daha kısa bacak 'J' sahibinin Tutkalla. Bazı ek 1 cm uzun barlar, gerekirse istikrar için tutkal.
3. 3 adet 2,5 cm uzun elektrot teli paslanmaz çelik, süper ince makas ile kesme. Bir net ve keskin kesim ve yalıtım elektrot tel dairesel yüzeyde sağlam olduğundan emin olun. Ayrıca kesme ipucu uygulanan kuvvet nedeniyle eğildi değil emin olun. 1 veya 2 mm bir ucunda her farklı açılarda (örneğin, bir sol düz, bir 45 ° ve bir dik açı) ayırt olmaları için tellerin viraj.
4. Tüp teller ile doldurun, elektrot deneme için uygun bir aralık seçin (örneğin, kortikal yerel alan potansiyel (LFP) ve geçerli kaynak yoğunluğu (CSD) kayıt, önerilen çıkıntı teller ipuçları için tüp açma: 4.5 mm, 4,1 mm ve 3.7 mm, sırasıyla). Not hangi tel uygun kanal sırasını korumak için hangi derinlik karşılık gelir.
5. Kez teller birbirine yakın sağa hizalamak ve tüp ile paralel, elektrot teller düzeltmek için sıvı yapıştırıcı tek bir damla tüp her iki ucunda keskin iğne yerleştirin. Tutkal Kapiler etkisi nedeniyle, ancak kayıt siteleri çıkıntılı ucunda doğru değil tüp içine akan emin olun.
6. Uygun microconnector kullanılmak üzere kayıt sistemi ile uyumlu bir elektrot arabirimi kurula hazırlayın.
7. İstenen kayıt kanala karşılık gelen elektrot arabirimi yönetim kurulu deliklere kaydı olmayan, bükülmüş tellerin uçları tanıtmak. Tüm kabloların yerlerini, altın pimleri deliklere cımbız ile itmek.
   Not: Altın iğne yerine diş çimento kullanarak sabit, ancak çoğu durumda, yeterince kararlı olduğundan bu Emanet adım olmadan da.

3. anestezi

1. Hayvan mühürlü anestezi indüksiyon odasında koyun ve isoflurane 2 L/dak tıbbi havada % 4-5 ile doldurun.
2. Fareyi yaslanmış olduğunda, hayvan odasından çıkarın ve uygun havalandırma uç parçası ile stereotaksik çerçevesindeki yerleştirin.
3. Hava akımı oranı aynı kalmalıdır rağmen isoflurane düzeyini % 2'ye ayarlayın. Anestezi düzeyini kontrol edin. Pençe çekilme refleks pinching karşılık olmayışı ise, devam, aksi takdirde anestezi derinliği artıracak.
4. İzlemek ve sıçan vücut sıcaklığı 37 ± 0,5 ° C homeothermic izleme sistemi ile korumak. Bir damlacık parafin merhem göze kurutulma kornea önlemek için geçerlidir. Bu yordamı ameliyat sırasında birkaç kez, gerekirse yineleyin.
5. Subkutan solunum yolları oluşumunda mukus önlemek için 0.3 mg/kg atropin enjekte et. Bu dört saatte uzun ameliyatları durumunda işlemi yineleyin. Nefes izlemek ve gerekirse Buharlaştırıcı, ayarlayın.

4. stimülasyon ve kayıt elektrotları implantasyonu

Not: Otoklav cerrahi gerekli tüm aletleri ve asepsis ve antisepsis genel kuralları tüm prosedürü sırasında dikkatle izleyin. Cerrahi alan dışında nonsteril alanlarda dokunmaktan kaçının. Elektrotlar etil alkol (% 70) 30 dk önce implantasyon için bırakın.

1. Saç kesme makinesi ile kafa derisi saç çoğunu kaldırın. Kafa derisi üzerinde depilatory krem uygulamak, yüzeyde eşit olarak yayılmış ve birkaç dakika bekleyin. Bir spatula yavaşça krem ve kalan saç kaldırmak için kullanın. Cilt sonra dezenfektan ile su ile durulayın.
2. % 1-2 lidokain enjekte (bir toplam 7 mg/kg doz fazla olamaz) subkutan deri uyuşturmak için. Bir damla bile veteriner merhem gözler (örneğin, parafin) için geçerlidir.
3. Orta hat üzerinden boyun alın bir neşter ile eksiksiz ve bir uzun (~ 2 cm) sagittal kesi yapmak. Kapaklarini kafatası üzerinden de dahil olmak üzere dokularda incelemek, sonra bir keski veya diş cımbız kullanarak iki temporal kemik cristae arasındaki alanı temiz. Disseke deri dört bulldogs kullanarak geri çeker tarafından maruz kafatası tutun.
4. Yavaşça dik kenar temporal kemik ve kaslar arasındaki ince cımbız yerleştirin veya ayırabilirsiniz. Temporal kemik tercihen koronal sütür uçak oksipital kemiğe kenarından itibaren mümkün olduğunca geniş yüzeyi daha fazla kas zarar vermeden ortaya çıkarmak için ayrı oturtma hareketleri yapmak.
5. Traktör bitemporally maruz temporal kemik tutmak için yerleştirin.
6. Durulama ile 1-2 mL % 3 H₂O_2, kafatası yüzeyini sonra 1-2 mL su ile yıkayın.
7. Temporal kemik yüzeyine çok dikkatli bir şekilde kuruması, oküler sopa ile nem kadar paspas. Stimülasyon elektrotlar (stimülasyon elektrot üst kenarını crista temporal kemik kenarına paralel olarak olmalıdır) temizlenmiş dikey kafatası yüzeyine sığıyorsa sınayın. Bulldogs ve traktör yeniden ayarlamak veya stimülasyon elektrotlar makasla, gerekirse şekil.
8. Elektrotlar ile electroconductive jel ve elektrotlar RIM tutkal ince bir tabaka koymak dürtme boşlukları doldurun.
9. Stimülasyon elektrot bir doğru hareketi ile temporal kemik kuru yüzeyine yerleştirin ve sıkıca yere bir dakikalığına iyi cımbız ile tutun. Yok nem ile temas yapıştırıcı olduğundan emin olun. Oküler sopalarla gerekirse paspasla.
   Dikkat: elektrot herhangi bir istikrarsızlık yaşanır diye, bunu çıkarın. Kemik temizlendikten sonra yeni bir stimülasyon elektrot ile bu adımı yineleyin.
10. Sızıntı nem dokuların sürekli oküler sopalarla kurumuş diş çimento stimülasyon elektrodu, kenarları koymak. Bütün stimülasyon elektrot çimento ile kapak.
11. Çimento tamamen sertleştirilmiş sonra kontralateral tarafında bu adımları yineleyin.
12. Ankraj vidaları için kafatasının her yerinde bir delik. Minyatür vidayı deliklere sürücü ve diş çimento koydu. Kullanım ~ %10 daha küçük çaplı Vida çapı göre kafa matkap.
13. Deneyler amacına bağlı olarak bir bağlayıcı kabloların uçları lehim, yüzey ve çimento ile kapak yerleştirin veya kayıt elektrotları ve optik lifler Reproduction devam veya kafatası bir pencere üzerinde kafatası hazırlamak. Bu ikinci durumda konektörler lehim ve onları sadece vasıl belgili tanımlık son yapýsý için çapa. Uzun vadeli eşzamanlı TES ve LFP kayıtları ihtiyaç durumunda, söz konusu elektrot üçüz tek tel yerine implant.
    Not: Bu kurulum ortak modu stimülasyon eserler⁸kaldırılması için izin verir. Elektrot implantasyon kayıt ayrıntıları için bkz: önceki iletişim kuralları^14,15.
14. Dezenfektan maruz kurcalayarak bol yıkayın. % 1-2 lidokain enjekte (bir toplam 7 mg/kg doz fazla olamaz) subkutan.
15. Yarayı yara kenarları ve bağlayıcı/implant etrafında basit kesintiye uğramış dikiş ile kapatın. Povidone-iyot yarayla dezenfekte.
16. 5 mg/kg carprofene subkutan enjekte et. Bu gerekirse işlemi tekrarlayın.
    Not: Yerel etik izin Kurulu tarafından gereksinimlerine uyan herhangi bir diğer ilaçlar kullanılabilir.
17. Anestezi askıya alma, earbars ve yangın gövdeler bırakın ve hayvan kendine gelmek için ameliyat sonrası kurtarma kafese koyun.
18. Hayvan ilk ameliyat sonrası saat sırasında yakın gözetimi altında olduğundan emin olun. İmplant alan periyodik olarak izlemeye devam edin.
    Not: sternal recumbency korumak için yeterli kendine geldi kadar hayvan katılımsız bırakılmamalıdır. Ev yordamdan gelen tam kurtarma kadar tek tek hayvan.

Sonuçlar

Kronik stimulasyon elektrotlar (şekil 1B) implantasyon elektrotlar (şekil 1 c-D) kayıt ek implantasyon ile kombine edilebilir. Bu ayarlar isteğe bağlı kayıt ve belirli beyin faaliyetleri ile girişimine stimülasyon sistemleri oluşturmak uygundur. Burada bir kapalı çevrim epilepsi algılama ve müdahale sistemi, spontan nöbetler (şekil 2A)⁹ifade Lo...

Tartışmalar

Bu iletişim kuralı en kritik adım kemik yüzeyindeki elektrot paketinin yapıştırma var. Uygunsuz mühürleme, durumunda elektrotlar ile kemik arasında bir boşluk oluşur ve ikincil skar dokusu stimulasyon kalitesini azaltır bu boşluğu büyüyebilir. Kemik yüzey üzerinde paket yapıştırma adımları sırasında tamamen kuru olmalıdır ve istikrarsızlık elektrot yaşıyor olması durumunda, bu gerekir kaldırılması ve en iyi sonuçları elde etmek için yeni bir paket ile değiştirilmesi.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cyanoacrylate liquid	Henkel	Loctite 401
Cyanoacrylate gel	Henkel	Loctite 454
Wire for stimulation electrodes	Phoenix Wire Inc.	36744MHW - PTFE Microminiature Hook-Up Wire
Board spacer	E-tec Interconnect	SP1-020-S378/01-55
Connector	E-tec Interconnect	P2510I-02
Tape packaging for stimulation electrodes	Nexperia	74HC1G00GW	Tape packaging of any integrated circuit with SOT-353 case can be used
Grip Cement Industrial Grade	Caulk Dentsply	675571 (powder) 675572 (solvent)
Electroconductive gel	Rextra	ECG Gel
Recording electrode wire	California Fine Wire Co.	.002 (50 micron) Tungsten 99.95% (CFW Material #: 100-211), HMl-Natural, cut to 3.0 inch pieces, Round, Cut length piece wire
Ultrafine scissors	Hammacher Instrumente	Stainless HSB 544-09
Stainless steel tube	Vita Needle Company	29 RW, 304SS Tubing, T.I.G. Welded and Plug
High speed rotary saw	Dremel	Model # 395
Rotary saw holder	Dremel	Model # 220
Rotary saw cut-off wheel	Dremel	Model # 409
Ocular sticks	Lohmann-Rauscher	Pro-ophta Ocular Sticks
Wet disinfectant	Egis	Betadine
Dry disinfectant	Wagner Pharma	Reseptyl-urea
Drilling machine	NSK-Nakanishi United Kingdom	Vmax35RV Pack
Anchoring screws	Antrin Miniature Specialties, Inc.	000-120x1/16 SL BIND MS SS