Хронический транскраниальной электростимуляции и Intracortical запись в крыс

Резюме

Этот подробный протокол описывает транскраниальной стимуляции электрода размещение на височной кости для того, чтобы исследовать кратко - и долгосрочные эффекты транскраниальной электростимуляции в свободно перемещающихся крыс.

Аннотация

Транскраниальной электростимуляции (ТЭС) является мощным и относительно простой подход к диффузно влияние активность мозга, случайно или событийные образом замкнутого цикла. Хотя многие исследования сосредоточены на возможные преимущества и побочные эффекты ТЭС в здоровых и патологического мозги, есть еще много основных нерешенных вопросов, касающихся механизма действия стимуляции. Таким образом, существует явная необходимость надежных и воспроизводимых метод для тестирования острые и хронические эффекты TES грызунов. TES может сочетаться с регулярные поведенческих, электрофизиологических и тепловизионные методы расследовать нейрональных сетей в vivo. Имплантация электродов транскраниальной стимуляции не налагают дополнительные ограничения на экспериментальный дизайн хотя он предлагает универсальный и гибкий инструмент для манипулирования активность мозга. Здесь мы предоставляем подробный, шаг за шагом протокол в изготовлении и имплантировать электроды транскраниальной стимуляции влиять активность мозга в духе височно ограниченных для месяцев.

Введение

Транскраниальной электростимуляции (ТЭС) является ценным методологический подход к влияние активность мозга в височно ограниченных образом. В зависимости от размера и размещения электродов стимуляции, пес может повлиять на объемы большого мозга и увлекают нейрональных популяций диффузно^1,2,3. Постоянного тока транскраниальной стимуляции уже медицински одобрен для лечения большого депрессивного расстройства^4,5, и многие исследования фокус на показ когнитивных эффектов транскраниальной стимуляции в людей^{6 , 7}. Кроме того, обещая результатах сообщалось о возможностях TES в контроле эпилептические припадки^8,9.

Несмотря на интенсивные исследования есть еще много нерешенных вопросов, касающихся детальный механизм действий, возможных побочных эффектов и долгосрочный результат применения этого метода^10,,1112. Таким образом критически важно иметь надежный, воспроизводимые протокол к исследовать эффекты ТЭС в животных моделях. Учитывая, что многие расстройства (например, депрессии, эпилепсии и шизофрении) могут быть широко исследованы в просыпаются животные и природа этих медицинских условий обычно требуют длительного лечения, мы предоставляем протокол для хронических Имплантация электродов транскраниальной крыс. Представленные здесь метод может использоваться для исследования поведенческих или могут быть объединены с имплантация электродов записи (то есть, провода, силиконовые зонды, juxtacellular электроды) или с хроническими черепной windows для электрофизиологических экспериментов и изображений исследования, соответственно. В зависимости от экспериментальный дизайн сроки стимулов может быть случайных или событиями для конкретных поведенческих подсказки или электрофизиологических клейма в частности мозга государств (припадки, тета колебания)^{8, 11 , 13}.

Важно отметить, что в отличие от используемых в настоящее время человека подход, который использует воплощение электродов, расположенных на коже, здесь мы показываем метод, который использует подкожной имплантации права над поверхностью височной кости, с крысы едва терпеть что-нибудь на их кожи, которые легко доступны, используя их лапы.

В соответствии с принципами замены, сокращение и утонченности, вследствие хронического характера имплантации этот метод помогает уменьшить количество животных, поскольку каждое животное могут быть набраны в различных экспериментальных условиях для месяцев, что позволяет использовать меньшее количество животных для тестирования различных гипотез.

В настоящем исследовании мы предоставляем подробный, шаг за шагом протокол транскраниальной стимуляции электрода производства (Рисунок 1A-B) и продемонстрировать хронического вживления эти электроды над височной кости 6 месячного мужчина долго-Эванс крыса.

протокол

Все методы, описанные здесь, в соответствии с директивами Совета европейских сообществ (86/609 ECC) и были утверждены Этический Комитет для исследования животных на Альберт Szent-Дьерди медицинский и фармацевтический центр университета Сегед (XIV/218/2016).

1. Изготовление электродов стимуляции

1. Чтобы сделать одну стимуляция электрода, вырезать шесть 10 см длинные куски миниатюрные подключение проводов, удалите 2 см обшивки на одном конце и 1 см на другом конце.
2. Поверните два кабели вместе и паять их на стороне короче очищенный.
3. Приобрести полосы три упаковки ленты любого интегральной схемы с корпус SOT-353.
4. Стежка скрученные провода через три отверстия пакета. В полостях пакета должно быть больше очищенные сегмент провода. Расположите кабели так, чтобы конец изоляции соответствует краю отверстия.
5. Положите стоматологического цемента на отверстия, чтобы исправить провода.
   Предупреждение: Стоматологического цемента должны быть достаточно плотным для того, чтобы избежать утечки в полость пакета.
6. Как только цемент затвердевших (минимум 10 мин), флип пакет и положить тонкий слой суперклея в отверстие в форме водонепроницаемые уплотнения к пористой цемента. Избегайте клея очищенные провода.
7. Перекручивайте кабели вместе на стороне короче очищенные и паять их (рис. 1A).
8. Захватить больше очищенные сегмент провода с кончик тонкой пинцет, раскатать их вокруг и обернуть их в полости (рис. 1B). Отрежьте излишки кабеля, при необходимости.

2. Изготовление электродов записи

1. Чтобы сделать одну запись триплет электрода (Рисунок 1 c-D), вырезать один см длинный кусок трубки из нержавеющей стали с использованием высокоскоростной роторный видел. Удалить ребра из концов трубки с резким игольчатые и убедитесь, что трубка очистить от мусора и полностью проницаемые.
   Примечание: Не используйте плоскогубцы, как они будут исказить трубка.
2. Согните распорку pin-позолоченные платы с минимальной длиной 3 см для формирования J-образный держатель. Вырезать больше нога «J» формы и паять его вместе, чтобы получить обратно первоначальную форму сделать съемный стык между давно линейной части, которая будет проводиться стереотаксического устройством, и форме «U», которые проведет электрода и служить в качестве точки привязки . Склейте трубки и короткие ноги «J» держателя. Клей некоторые дополнительные 1 см длинные полосы, при необходимости, для обеспечения стабильности.
3. Вырежьте 3 куски провода 2,5 см длиной электрода с нержавеющей стали, ультрадисперсных ножницы. Убедитесь, что это четкое и резкое сокращение, и изоляция повреждена на поверхности круговой электродной проволоки. Кроме того, убедитесь, что вырезать кончик не согнута благодаря усилие. Изгиб 1 или 2 мм на одном конце каждого из проводов под разными углами (например, один левый прямой, один 45 ° и один прямой угол) чтобы сделать их отличить.
4. Заполнить трубу с проводами, выберите соответствующий интервал электродов для эксперимента (например, корковых местах потенциал (LFP) и текущий источник плотности (КУР) регистрации, рекомендованные выступ наконечников проводов от Открытие трубки: 4,5 мм, 4,1 мм и 3,7 мм, соответственно). Обратите внимание, какие провода соответствует какой глубины для поддержания правильного канала порядка.
5. Провода по правому рядом друг с другом и параллельно трубе, чтобы исправить электродных проволок, место одной капли жидкого суперклея на обоих концах трубки с острые иглы. Убедитесь, что клей поступает в трубу за счет капиллярного эффекта, но не к записи сайтов на выступающих концах.
6. Подготовьте электрода интерфейсная плата с надлежащей microconnector совместим с системой записи для использования.
7. Внедрение-запись, изогнутые концы проводов в отверстия электрода интерфейсная плата соответствует требуемой записи канала. Когда все провода находятся в положении, вставьте золотой булавки в отверстия с помощью пинцета.
   Примечание: Золотой булавки могут устанавливаться в месте, с использованием стоматологического цемента, но в большинстве случаев, это достаточно стабильным даже без этого шага безопасности.

3. анестезия

1. Поместите животное в камере индукции запечатанном анестезии и заполнить его с 4-5% изофлюрановая медицинского воздуха 2 Л/мин.
2. Когда крыса лежачие, удалите животное из камеры и поместите его в Стереотаксическая рама с соответствующей вентиляции носа кусок.
3. Установите уровень изофлюрановая 2%, хотя скорость воздушного потока должен оставаться одинаковым. Проверьте уровень анестезии. Если есть отсутствие рефлекс вывод лапы в ответ на щипать, продолжить, в противном случае увеличение глубины анестезии.
4. Контролировать и поддерживать температуру тела крыс на 37 ± 0,5 ° C с гомойотермных системой мониторинга. Примените капли парафина мазь на глаза, чтобы предотвратить истощение роговицы. Повторите эту процедуру во время операции несколько раз, если это необходимо.
5. Подкожно вводить атропина 0,3 мг/кг, чтобы избежать образования слизи в дыхательных путях. Повторите эту процедуру каждые четыре часа в случае больше кабинетов. Контролировать дыхание и настроить испарителя, при необходимости.

4. Имплантация стимуляции и записи электродов

Примечание: Автоклав все необходимые хирургические инструменты и тщательно соблюдать общие правила асептики и антисептики в течение всей процедуры. Не прикасайтесь нестерильной районы за пределами области хирургического. Погружайте электродов в этиловый спирт (70%), за 30 мин до имплантации.

1. Удалите большую часть волос из головы с клипер волос. Применить депиляционный крем на кожу головы, равномерно на поверхности и подождите несколько минут. Лопаточкой аккуратно удалить крем и оставшиеся волосы. Промывайте кожу водой, затем с дезинфицирующим средством.
2. Придать 1-2% лидокаин (не превышает общую дозу 7 мг/кг) подкожно, чтобы ошеломить кожи. Применение одной капли ветеринар мазь для глаз (например, парафин).
3. Сделайте тщательный и длинные (~ 2 см) Сагиттальный разрез в срединной линии с помощью скальпеля, от лба к шее. Вскрыть тканей, включая надкостницы от черепа, а затем с помощью стамески или зуб пинцета очистить район между макул двух височных костей. Держите черепа, предоставляемые втягивания расчлененных кожи, используя четыре бульдогов.
4. Аккуратно место тонкой пинцет между крутыми края височной кости и мышцы и разделить их. Сделайте отсадки движений, чтобы разоблачить столько большой поверхности височной кости как можно скорее, предпочтительно от края затылочной кости к плоскости корональный швов, без повреждения мышц.
5. Место bitemporally ретракторы сохранить височной кости подвергаются.
6. Промойте поверхность черепа с 1-2 мл 3% H₂O_2, затем промойте его с 1-2 мл воды.
7. Очень тщательно просушите поверхности височных костей, вытирать влагу с глазные палочки. Тест, если электроды стимуляции помещается на поверхности очищаемой вертикальных черепа (верхний край электрод стимуляции должны соответствовать края Криста височной кости). Подрегулировать бульдоги и втягивающие или фигуру электроды стимуляции с помощью ножниц, при необходимости.
8. Заполнение полости стимуляция электродов с электропроводящих гель и нанесите тонкий слой клея на обод электродов.
9. Поместите электрод стимуляции на сухой поверхности височной кости с одним точным движением и держите его твердо в месте в течение одной минуты штрафа пинцетом. Убедитесь, что нет влаги находится в контакте с клеем. Швабра с глазные палочки, в случае необходимости.
   Предупреждение: В случае, если любая нестабильность электрода опытные, удалите его. После очистки костей, повторите этот шаг с новым электрод стимуляции.
10. Положите стоматологического цемента за края электродов стимуляции, в то время как течь влага тканей постоянно иссяк с глазные палочки. Покрывают весь стимуляции электрод с цементом.
11. После того, как полностью затвердевшего цемента, повторите эти действия на контралатеральную сторону.
12. Некоторые отверстия по всему черепа для крепления винтов. Драйв миниатюрных винты в отверстия и положить стоматологического цемента над ними. Использование меньшего диаметра ~ 10% сверлить головы, по сравнению с диаметр винта.
13. В зависимости от цели экспериментов либо припой соединителя на концы кабелей, поместите его на поверхность и крышка с цементом, или продолжить вживления электродов записи и оптических волокон или подготовить черепной окно над черепа. В этом последнем случае паять разъемы и привязать их к конструкции только в конце. В случае необходимости долгосрочной одновременных записей TES и LFP имплантат вышеупомянутых электрода тройни вместо одиночных проводов.
    Примечание: Эта настройка позволяет для удаления общего режима стимуляции артефакты⁸. Для записи электрода имплантации детали см. предыдущий протоколы^14,15.
14. Вымойте подвергаются ткани обильно с дезинфицирующим средством. Придать 1-2% лидокаин (не превышает общую дозу 7 мг/кг) подкожно.
15. Предотвращать края раны и закрыть их с простыми швами Прерванный вокруг имплантата соединителя. Лечить рану повидон йод.
16. Придать carprofene 5 мг/кг подкожно. При необходимости, повторите это.
    Примечание: Любые другие болеутоляющие средства могут использоваться соответствия требованиям, установленным Советом местных этические разрешение.
17. Приостановить анестезии, выпуск earbars и Стволы пожарные и положить животное в клетке послеоперационного восстановления, чтобы восстановить сознание.
18. Убедитесь, что животное находится под тщательным наблюдением во время первых послеоперационных часов. Продолжать периодически контролировать области имплантата.
    Примечание: Животное не следует оставлять без присмотра до тех пор, пока он сознание достаточно для поддержания грудной recumbency. Дом животное индивидуально до полного восстановления от процедуры.

Результаты

Имплантация электродов хронической стимуляции (рис. 1B) могут быть объединены с дополнительным имплантации записи электродов (Рисунок 1 c-D). Такие параметры подходят для формирования систем стимуляции мешать деятельности конкр...

Обсуждение

Наиболее важным этапом этого протокола является приклеивание пакет электродов на поверхности кости. В случае ненадлежащего уплотнения, образуется зазор между электродами и кости, и вторичного рубцовой ткани может вырасти в этот разрыв, который уменьшает качество стимуляции. Кость по?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cyanoacrylate liquid	Henkel	Loctite 401
Cyanoacrylate gel	Henkel	Loctite 454
Wire for stimulation electrodes	Phoenix Wire Inc.	36744MHW - PTFE Microminiature Hook-Up Wire
Board spacer	E-tec Interconnect	SP1-020-S378/01-55
Connector	E-tec Interconnect	P2510I-02
Tape packaging for stimulation electrodes	Nexperia	74HC1G00GW	Tape packaging of any integrated circuit with SOT-353 case can be used
Grip Cement Industrial Grade	Caulk Dentsply	675571 (powder) 675572 (solvent)
Electroconductive gel	Rextra	ECG Gel
Recording electrode wire	California Fine Wire Co.	.002 (50 micron) Tungsten 99.95% (CFW Material #: 100-211), HMl-Natural, cut to 3.0 inch pieces, Round, Cut length piece wire
Ultrafine scissors	Hammacher Instrumente	Stainless HSB 544-09
Stainless steel tube	Vita Needle Company	29 RW, 304SS Tubing, T.I.G. Welded and Plug
High speed rotary saw	Dremel	Model # 395
Rotary saw holder	Dremel	Model # 220
Rotary saw cut-off wheel	Dremel	Model # 409
Ocular sticks	Lohmann-Rauscher	Pro-ophta Ocular Sticks
Wet disinfectant	Egis	Betadine
Dry disinfectant	Wagner Pharma	Reseptyl-urea
Drilling machine	NSK-Nakanishi United Kingdom	Vmax35RV Pack
Anchoring screws	Antrin Miniature Specialties, Inc.	000-120x1/16 SL BIND MS SS