만성 Transcranial 전기 자극 및 쥐 Intracortical 녹음

요약

이 상세한 프로토콜 transcranial 전기 자극 자유롭게 이동 하는 쥐에서의 단기 및 장기 효과 조사 하기 위하여 측 뼈에 transcranial 자극 전극 배치를 설명 합니다.

초록

Transcranial 전기 자극 (TES)은 무작위로 또는 폐쇄 루프 이벤트 트리거 방식으로 만들어진다 두뇌 활동에 영향을 강력 하 고 비교적 간단한 방법입니다. 많은 연구는 가능한 혜택 및 건강 하 고 pathologic 두뇌에서 TES의 부작용에 초점을 맞추고 있습니다, 하지만 여전히 자극의 행동의 메커니즘에 관한 많은 근본적인 오픈 질문이 있습니다. 따라서, 거기는 분명 강력 하 고 재현할 수 메서드는 급성 테스트 및 설치류에서 TES의 만성 효과 대 한 필요. TES는 신경 네트워크 비보조사 일반 행동, electrophysiological 및 이미징 기술을 결합할 수 있습니다. 뇌 활동을 조작 하는 다양 하 고 유연한 도구를 제공 하는 동안 transcranial 자극 전극 이식 실험 설계에 추가 제약을 부과 하지 않습니다. 여기 우리가 조작 하 고 몇 달 동안 일시적으로 제한 된 방식으로 두뇌 활동에 영향을 transcranial 자극 전극 이식 상세한, 단계별로 프로토콜을 제공 합니다.

서문

Transcranial 전기 자극 (TES)은 일시적으로 제한 된 방식으로 두뇌 활동에 영향을 가치 있는 방법론 접근 이다. 크기와 자극 전극의 배치에 따라 TES 큰 두뇌 볼륨에 영향을 미칠 수 있고 신경 인구를 끌고가 다 만들어진다^1,2,3. Transcranial 직류 자극은 이미 의학적으로 주요 우울증 장애^4,5, 그리고 인간⁶ transcranial 자극의 인지 효과 보여주는에 많은 연구 초점의 치료에 대 한 승인 ^{, 7}. 또한, 유망한 결과 간 질 발작^8,9제어 TES의 잠재력에 관한 보도 했다.

집중적인 연구에도 불구 하 고 여전히 많은 관련 작업, 잠재적인 부작용 및 적용이 방법을^10,,1112의 장기 결과의 상세한 메커니즘에 관한 질문 있습니다. 따라서, 그것은 동물 모델에서 TES의 효과 조사 하기 위해 강력 하 고 재현 가능한 프로토콜을 매우 중요 하다입니다. 우리에 대 한 프로토콜을 제공 하는 많은 장애 (예, 우울증, 간 질, 및 정신 분열 증)을 깨어 동물에 광범위 하 게 조사 될만 하 고 이러한 의료 조건의 본질 일반적으로 장기 치료를 필요로, 만성 transcranial 전극 쥐에 이식 여기에 제시 된 방법 행동 연구에 사용할 수 있습니다 또는 기록 전극 (즉, 전선, 실리콘 프로브, juxtacellular 전극)의 주입 또는 만성 두개골 윈도우 electrophysiological 실험에 대 한 결합 될 수 있다 그리고 이미징 연구, 각각입니다. 실험 설계에 따라 자극의 타이밍 일 수 있다 무작위 이벤트 트리거 특정 행동 신호, 또는 특정 한 두뇌 상태 (발작, 세타 진동)^8, 의 electrophysiological 특징 ^{11 , 13}.

그 피부에 전극의 구체화를 사용 하 여, 현재 사용 된 인간의 접근 달리 여기 우리가 표시 메서드를 사용 하 여 피하 주입 오른쪽 측 뼈의 표면에 쥐부터 거의 언급 하는 것이 중요 하다 그들의 발을 사용 하 여 쉽게 접근할 수 있는 그들의 피부에 아무것도 용납.

이식의 만성 특성상 교체, 감소, 및 교양의 원칙에 따라이 방법은 이후 각 동물 사용할 수 달, 동안에 다른 실험 조건에 채용 될 수 있는 동물의 수를 줄일 수 다양 한 가설을 테스트 하는 적은 동물.

현재 연구에서 우리는 transcranial 자극 전극 제조 (그림 1A-B)의 상세한, 단계별로 프로토콜을 제공 하 고 이러한 전극의 만성 이식 6 개월의 측 뼈 통해 입증 남성 긴 에반스 쥐입니다.

프로토콜

여기서 설명 하는 모든 메서드는 유럽 공동체 위원회의 지침에 따라 (86/609 ECC) 앨버트 Szent-Györgyi 의료 및 제약 센터의 대학에서 동물 연구에 대 한 윤리 위원회에 의해 승인 세게 드 (14 세/218/2016)입니다.

1입니다. 자극 전극의 제조

1. 한 자극을 전극, 미니어처 훅 업 와이어의 6 10 cm 긴 조각을 잘라 한쪽 끝에 피복 및 다른 쪽 끝에 1 cm의 2 cm를 제거 합니다.
2. 2 개의 케이블을 함께 트위스트과 짧은 벗 겨 옆에 그들을 솔더.
3. SOT-353 케이스 어떤 집적 회로의 세 가지 테이프 포장의 스트립을 획득 합니다.
4. 패키지의 3 개의 구멍을 통해 트위스트 와이어 바느질. 전선의 이상 벗 겨 세그먼트 패키지 구멍에 있어야 합니다. 단열재의 끝 구멍의 가장자리에 맞춰 되도록 케이블을 배치 합니다.
5. 전선을 해결 하기 위해 구멍에 치과 시멘트를 넣어.
   주의: 치과 시멘트 패키지의 캐비티에 누출 되지 않도록 충분히 조밀 되어야 합니다.
6. 시멘트는 응고 (최소 10 분), 일단 패키지를 플립 하 고 superglue의 얇은 층으로 다공성 시멘트 방수 물개를 형성 하기 위하여 구멍에 넣어. 벗 겨 와이어 접착 하지 마십시오.
7. 짧은 벗 겨 쪽에 케이블을 함께 트위스트과 솔더 그들 (그림 1A).
8. 고급 핀셋 끝으로 철사의 더 이상 벗 겨 세그먼트, 롤 주위에, 그들을 충 치 (그림 1B)에 그들을 포장. 필요한 경우 초과 케이블을 잘라.

2입니다. 기록 전극의 제조

1. 한 녹음을 triplet 전극 (그림 1C-D), 스테인레스 스틸 튜브를 사용 하 여 고속 회전에의 한 cm 긴 조각 잘라 보았다. 튜브의 끝에서 날카로운 바늘으로는 지 느 러 미를 제거 하 고 튜브 파편의 깨끗 하 고 완전히 투과 확인 하십시오.
   참고: 튜브를 왜곡 하는 것으로, 플라이어를 사용 하지 마십시오.
2. J 자형 홀더를 3cm의 최소 길이와 골드 도금 보드 스페이서 핀을 벤드. 'J' 모양의 긴 다리를 잘라 그리고 함께 돌아가 긴 선형, stereotaxic 장치에 의해 개최 됩니다 부분과 사이 'U' 모양, 전극, 개최 하 고 앵커 포인트 역할 분리 가능한 합동을 원래 모양 그것을 납땜합니다 . 튜브와 'J' 보유자의 짧은 다리를 함께 접착제. 필요한 경우, 안정성에 대 한 몇 가지 추가 1 cm 긴 막대를 붙입니다.
3. 스테인레스 스틸, ultrafine가 위 2.5 cm 긴 전극 와이어의 3 조각 잘라. 그것은 명확 하 고 날카로운 컷, 그리고 단 열 전극 와이어의 원형 표면에 그대로 있는지 확인 합니다. 또한 컷된 팁 적용 되는 힘으로 인해 구부러지거나 되지 있는지 확인 합니다. 벤드 1 또는 2 m m (예를 들어, 한 왼쪽된 직선, 한 45 °, 및 한 직각) 그들을 구별할 수 있도록 다른 각도에서 전선의 각각의 1 개의 끝에.
4. 전선 관, 실험에 대 한 전극의 적절 한 간격을 선택 (예를 들면, 대뇌 피 질의 로컬 필드 가능성 (LFP)와 현재 소스 밀도 (CSD) 등록, 전선에서의 팁 권장된 돌출은 튜브의 열: 4.5 m m, 4.1 m m 및 3.7 m m, 각각). 참고 적절 한 채널 순서를 유지 하는 깊이에 해당 하는 와이어.
5. 일단 전선이 서로 오른쪽 정렬 되며 튜브와 함께 병렬, 전극 와이어를 해결 하기 위해 장소 액체 superglue 한 방울 튜브의 양쪽 끝에 날카로운 바늘으로. 접착제는 모 세관 효과 튀어나온 끝에 녹음 사이트를 향해 하지 튜브에 흐르는 지 다는 것을 확인 하십시오.
6. 적절 한 microconnector 녹음 시스템을 사용할 수와 호환 되는 전극 인터페이스 보드를 준비 합니다.
7. 원하는 녹음 채널에 해당 하는 전극 인터페이스 보드의 구멍에 전선의 비 녹음, 구부러진 끝을 소개 합니다. 모든 와이어 위치에 있을 때, 핀셋으로 구멍에 골드 핀을 밀어.
   참고: 골드 핀 치과 시멘트를 사용 하 여 장소에 고정 될 수 있습니다 하지만 대부분의 경우, 그것은 충분히 안정적이 안전 단계 없이.

3입니다. 마 취

1. 봉인 된 마 취 유도 실에서 동물을 놓고 2 L/min 의료 공기에서 isoflurane의 4-5%로 그것을 채우십시오.
2. 쥐 휴식 때 상공에서 동물을 제거 하 고 적절 한 환기 코 조각으로 stereotaxic 프레임에 배치.
3. 공기의 속도 동일 하 게 유지 해야 하지만 2 %isoflurane 수준을 설정 합니다. 마 취의 수준을 확인 합니다. 곤란에 발 철수 반사의 결핍이 있는 경우에, 계속, 그렇지 않으면 마 취의 깊이 증가.
4. 모니터링 하 고 37 ± 0.5 ° C homeothermic 모니터링 시스템에서 쥐의 체온을 유지 한다. 각 막의 건조를 방지 하기 위해 눈에 파라핀 연 고의 방울을 적용 합니다. 반복이 절차는 수술 하는 동안 여러 번, 필요한 경우.
5. 기도에 점액 형성을 피하기 위해 0.3 mg/kg 아트로핀 주사 피하. 이 더 이상 수술의 경우 4 시간 마다 반복 합니다. 호흡을 모니터링 하 고 필요한 경우 기화 기, 조정.

4. 자극 및 기록 전극의 주입

참고: 압력솥 수술 필요한 모든 계기 및 전체 절차 동안 무 균 상태와 antisepsis의 일반 규칙에 따라 신중 하 게. 외과 영역 외부 nonsterile 영역을 만지지 마십시오. 주입 하기 전에 30 분 동안 에틸 알콜 (70%)에 전극을 담가.

1. 머리 깎기로 두 피에서 머리의 대부분을 제거 합니다. 두 피에 depilatory 크림을 적용, 표면에 균일 하 게 확산 하 고 몇 분. 부드럽게 크림 및 나머지 머리를 제거 하는 주걱을 사용 합니다. 다음 살 균 제와 물으로 피부를 씻어.
2. 1-2 %lidocaine 주사 (7 mg/kg의 총계 복용량을 초과 하지 않도록) 피부 감각을 피하. (예를 들어, 파라핀) 눈에 대 한 연 고 수 의사의 한 방울을 적용 합니다.
3. 목에이 마에서 메스와 함께 중간에는 철저 하 고 긴 (~ 2 cm) 화살 절 개를 확인 합니다. 다음 두 개의 측 뼈의 cristae 사이의 영역을 청소 끌 또는 치아 핀셋을 사용 하 여 두개골에서 포함 하 여 조직 해 부. 4 롯데를 사용 하 여 해 부 피부를 제거 하 여 노출 하는 두개골을 유지.
4. 부드럽게 측 뼈의 가파른 가장자리와 근육 사이의 정밀한 핀셋 놓고 그들을 분리 합니다. 근육 손상 없이 가능한 코로나 봉합의 평면에 후 두 뼈의 가장자리에서 선호 측 뼈의 큰 표면에 많이 노출 하 지 그 춤을 추는 움직임을 확인 합니다.
5. 견인 기 bitemporally 노출 측 뼈를 유지 장소.
6. 린스와 함께 1-2 mL 3% H₂O_2, 두개골의 표면 다음 1-2 mL 물으로 그것을 씻어.
7. 매우 신중 하 게 측 뼈의 표면을 건조, 눈 막대기와 습기를 청소. 테스트 경우 자극 전극 (자극 전극의 위쪽 가장자리 측 뼈의 crista의 가장자리 라인에 있어야 함) 청소 수직 두개골 표면에 적합 합니다. 다시 롯데와는 브래킷으로 조정 하거나 필요한 경우가 위, 자극 전극 모양.
8. Electroconductive와 전극 젤과 전극의 가장자리에 접착제의 얇은 층을 넣어 자극의 구멍을 채우십시오.
9. 한 정확한 운동, 측 뼈의 건조 표면에 자극 전극을 놓고 단단히 제자리에 고정 1 분 고급 핀셋으로 합니다. 아무 습기는 접착제와 접촉 하 여 있는지 확인 합니다. 청소 하십시오 눈 막대기, 필요한 경우.
   주의: 전극의 어떤 불안정성을 경험 하는 경우에 그것을 제거 합니다. 뼈를 청소 후 새로운 자극 전극으로이 단계를 반복 합니다.
10. 조직의 새 수 분은 지속적으로 눈 막대기로 건조 하는 동안 자극 전극의 가장자리 위에 치과 시멘트를 넣어. 시멘트로 전체 자극 전극 커버.
11. 시멘트 완전히 경화 된 후, contralateral 측면에서이 단계를 반복 합니다.
12. 고정 나사에 대 한 두개골 전체 일부 구멍을 드릴 합니다. 미니어처 나사 구멍에 운전 하 고 그들을 통해 치과 시멘트를 넣어. ~ 10% 더 작은 직경 드릴 나사 직경에 비해 머리에 사용 합니다.
13. 실험의 목적에 따라 솔더 커넥터는 케이블의 끝에, 표면, 및 시멘트, 커버에 배치 또는 계속 기록 전극 및 광학 섬유, 이식 하거나 두개골에 두개골 창 준비 합니다. 이 후자의 경우 커넥터를 납땜 하 고 끝에만 구조에 앵커. 장기 동시 TES와 LFP 녹음의 필요한 경우 단일 와이어 대신 상기 전극 쌍 둥 이식.
    참고:이 설치는 일반적인 모드 자극 유물⁸의 제거에 대 한 수 있습니다. 전극 이식 기록의 세부 사항에 대 한 이전 프로토콜^14,15를 참조 하십시오.
14. 워시 살 균 제와 풍부 하 게 노출 된 조직. 1-2 %lidocaine 주사 (7 mg/kg의 총계 복용량을 초과 하지 않는) 피하.
15. 상처 가장자리를 debride 하 고 간단한 중단된 봉합 커넥터/임 플 란 트 주위와 그들을 닫습니다. Povidone-요오드와 상처를 소독.
16. 5 mg/kg carprofene 피하 주사. 필요한 경우이 반복 합니다.
    참고: 다른 진통제 사용할 수 있습니다 일치 하는 로컬 윤리적 권한 위원회에 의해 설정 요구 사항.
17. 마 취를 중단 하 고 earbars 및 nosepiece, 의식 회복 수술 후 회복에에서는 동물을 넣어.
18. 첫 수술 후 시간 동안 가까운 감독 하에 동물 인지 확인 합니다. 임 플 란 트 영역을 정기적으로 모니터링을 계속 합니다.
    참고: 동물 하지 맡겨야 한다 무인 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지. 집 전체 복구 절차에서까지 개별적으로 동물.

결과

만성 자극 전극 (그림 1B)의 주입 전극 (그림 1C-D) 기록의 추가 주입 결합 될 수 있다. 이러한 설정은 요청 시 녹음 및 특정 뇌 활동 방해 자극 시스템에 적합 합니다. 여기는 폐쇄 루프 간 질 탐지 및 긴-에반스 쥐 표현 자발적인 발작 (그림 2A)⁹에 적용 된 개입 시스템의 대표적?...

토론

이 프로토콜의 가장 중요 한 단계는 뼈 표면에 전극 패키지의 접착제로. 부적 절 한 씰링, 경우 전극과 뼈 사이 간격이 형성 되 고 보조 흉터 조직 자극의 품질을 줄이는이 간격으로 성장할 수 있다. 뼈 표면, 패키지에의 단계 동안 완전히 건조 해야 하며 전극의 불안정을 발생 하는 경우 그것은 제거 되어야 하며 최상의 결과 얻기 위해 새로운 패키지와 함께 대체.

이 방법의 제...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cyanoacrylate liquid	Henkel	Loctite 401
Cyanoacrylate gel	Henkel	Loctite 454
Wire for stimulation electrodes	Phoenix Wire Inc.	36744MHW - PTFE Microminiature Hook-Up Wire
Board spacer	E-tec Interconnect	SP1-020-S378/01-55
Connector	E-tec Interconnect	P2510I-02
Tape packaging for stimulation electrodes	Nexperia	74HC1G00GW	Tape packaging of any integrated circuit with SOT-353 case can be used
Grip Cement Industrial Grade	Caulk Dentsply	675571 (powder) 675572 (solvent)
Electroconductive gel	Rextra	ECG Gel
Recording electrode wire	California Fine Wire Co.	.002 (50 micron) Tungsten 99.95% (CFW Material #: 100-211), HMl-Natural, cut to 3.0 inch pieces, Round, Cut length piece wire
Ultrafine scissors	Hammacher Instrumente	Stainless HSB 544-09
Stainless steel tube	Vita Needle Company	29 RW, 304SS Tubing, T.I.G. Welded and Plug
High speed rotary saw	Dremel	Model # 395
Rotary saw holder	Dremel	Model # 220
Rotary saw cut-off wheel	Dremel	Model # 409
Ocular sticks	Lohmann-Rauscher	Pro-ophta Ocular Sticks
Wet disinfectant	Egis	Betadine
Dry disinfectant	Wagner Pharma	Reseptyl-urea
Drilling machine	NSK-Nakanishi United Kingdom	Vmax35RV Pack
Anchoring screws	Antrin Miniature Specialties, Inc.	000-120x1/16 SL BIND MS SS