JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה מתאר את ההכנה והערכה של חבל הטבור spheroids מטריקס-derived בתאי גזע mesenchymal עם דגם פגם הדו-צדדיים גיד ברך בחולדה. מודל זה היתה משויכת תחלואה מקובל היה למצוא כדי לזהות הבדלים בין הגידים אינו מטופל ומטופל ו בין שני הטיפולים נבדק.

Abstract

רפואה רגנרטיבית מספק חלופות הרומן לתנאי זה אתגר טיפולים מסורתיים. שכיחות התחלואה של tendinopathy על פני מינים, בשילוב עם סגולות הריפוי מוגבלת של רקמה זו, תתבקש החיפוש אחר טיפולים הסלולר והם יהיו. לדחוף את התפתחות ניסיוניות ללמוד את יעילותם. חבל הטבור מטריקס-derived בתאי גזע mesenchymal (UCM-MSC) הם מועמדים מושך כי הם בשפע, קל לאסוף, לעקוף את החששות אתית ואת סכנת היווצרות טרטומה, עדיין דומים בתאי גזע עובריים פרימיטיביים יותר מקרוב יותר עניין MSCs. משמעותיות רקמות-derived מבוגרים התמקדה משקם כאסטרטגיה כדי לשפר את המאפיינים של MSCs דרך היווצרות ספרואיד. זה טכניקות פרטים נייר כדי לבודד UCM-MSCs, להכין spheroids בסרט משקם, לנתח את השפעת היווצרות ספרואיד על פני השטח סמן ביטוי. כתוצאה מכך, יצירת מודל פציעת גיד ברך הדו-צדדיים בחולדות מתואר ויוו השרשת UCM-MSC spheroids שנוצר בסרט משקם. סיבוך לא נצפתה במחקר לגבי תחלואה, הלחץ בעליה אפקטים או זיהום ברקמות. הציון פונקציונלי של החולדות המופעלים על 7 ימים היה נמוך מזה של חולדות רגילה, אך חזר להיות תקין תוך 28 ימים לאחר הניתוח. עשרות היסטולוגית ריפוי רקמות אישרו הנוכחות של קריש ב פגמים שטופלו מוערכים ב 7 ימים, היעדר התגובה גוף זר, ואת מתקדמת הריפוי 28 ימים. מודל פגם זה גיד פיקת הדו-צדדיים שולט הבין-וריאציה באמצעות יצירת פקד פנימי בתוך כל עכברוש, היה הקשורים עם תחלואה מקובל, והתירו גילוי של ההבדלים בין הגידים לא מטופל וטיפולים.

Introduction

פציעה בגיד הוא אחד הגורמים השכיחים ביותר של ניוון שרירים וכאב משמעותי על פני מינים1. ברפואה וטרינרית, פציעות גיד רצועה הם עניין מיוחד בסוסים, כפי 82 אחוז פציעות כל סוסי מרוץ לערב מערכת השלד, 46% של אלה משפיעים על הגידים והרצועות2,3. היווצרות רקמה צלקתית משפיע על תכונות ביו-מכני של הגידים נרפא ומסביר הפרוגנוזה שמרו על החזרה לשימוש אתלטיק לאחר פציעות גיד כופף; re-פגיעה מתרחשת תוך שנתיים ב עד 67% של סוסים שמרני4. רפואה רגנרטיבית מספק חלופות הרומן תנאי כי האתגרים טיפולים מסורתיים. טיפול בתאי גזע עצמיים הפיק מספר5,מעודד תוצאות6 אבל הוא מוגבל על ידי התחלואה המשויך אוסף רקמה המינהל מתעכב בשל התכנות/עיבוד של תאים, השפעת מצב הבריאות של המטופל (כמו גיל) על המאפיינים של גזע תאים7,8. מגבלות אלה מספקות תירוץ חוקרת תאי גזע allogeneic כחלופה מדף. תאים עוברית נגזר adnexa הם מועמדים מושך כי הם לעקוף את החששות אתית ואת סכנת היווצרות טרטומה הקשורים בתאי גזע עובריים. בין adnexa עוברי, חבל הטבור מטריקס (יו), גם בשם וורטון, הוא שופע וקל לאסוף.

ללא קשר למקור תא, שיפור stemness הוא חיוני להקים בנק תא עבור רפואה רגנרטיבית allogenic. מבחינה תפקודית, stemness ניתן להגדיר את פוטנציאל התחדשות עצמית, שושלת היוחסין מרובה בידול9. עדות stemness מסתמך על התפשטות ובידול מבחני, יחד עם ביטוי של גנים סמנים Oct4, Sox2, ו Nanog9. אסטרטגיה אחת כדי לשפר את stemness מסתמך על השימוש biomaterials לשמש חלל ומרק ונושאי שיפור התפשטות ובידול של UCM MSCs. גישה זו מבטלת חששות לגבי מניפולציה של גורמים תעתיק לתכנת התאים בוגרים לתוך תאים pluripotent המושרה. בין biomaterials נחשב ספקים פוטנציאליים עבור תאי גזע, משקם הוא מושך את התאימות שלו, degradability10. Aminopolysaccharide הטבעי הזה נוצר על ידי אלקליין deacetylation של כיטין, הפנימי רב טבעי-סוכר השני הנפוץ ביותר, בעיקר מתקבל subproduct של רכיכה10. יש קודם לכן חקר אינטראקציות בין MSCs משקם פיגומים, ואנו נצפתה היווצרות של spheroids11,12,13,14,15, 16. גם דיווחנו על העליונות של chondrogenesis ב משקם מטריצות12,13,14,15,16,17, 18. לאחרונה, שני מחקרים עצמאיים שתיאר spheroids היווצרות רקמת שומן, רקמת השליה נגזר MSCs תרבותי משקם הסרט19,20. צורה זו של spheroids לא רק משופרת stemness, אך גם השתפר השמירה של תאי גזע אחרי ויוו השרשה20.

השכיחות ותחלואה של tendinopathy על פני מינים חייב עודדה ההתפתחות של ניסיוניות לימוד הפתופיזיולוגיה של tendinopathies ולבדוק טיפולים חדשים כגון הזרקת תאי גזע. סוסים, המושרה collagenase tendonitis הוא דגם נפוץ כדי להדגים את היעילות באמצעות MSCs תיקון גיד21. הרלוונטיות של גישה זו היא מוגבלת, שכן זריקות לגרום לשינויים דלקתית חריפה, ואילו tendinopathies קלינית הם בדרך כלל תוצאה של כרונית מאולצת22,23. בנוסף, אינדוקציה כימי של גיד המחלה גורמת לתגובה הריפוי, לא לשכפל את תהליך הריפוי לקוי קיימים מקרים קליניים22,23. כריתה של קטע של הגיד כופף דיגיטלי שטחית תואר כמודל כירורגי של דלקת גידים סוסים24. לאחרונה, בגישה פולשנית שימש כדי להגביל את הנזק טראומטי הליבה המרכזית של גיד כופף דיגיטלי שטחית25. ניתוח מודלים לא לדמות את מנגנון עייפות עשוי להוביל למחלות גיד טבעי, נוטים חוסר הפארמצבטית בהיקף הנזק שנוצר25. ללא תלות המודל, תחלואה, העלות המשויכת אקווין מודלים של גיד המחלות הן מגבלות נוספות, אשר להצדיק את עניין במודלים מכרסמים כצעד ראשון ויוו הערכה של טיפולים חדשניים.

אחד היתרונות העיקריים של גרסאות ניסיוניות בחולדות מורכב העלות ואת היכולת לשלוט ההשתנות הבין-אישי. מכרסמים יכול להיות מוגדר ביחס גורמים פיזיולוגיים שונים בשל שיעורי צמיחה מהירה שלהן, קצרים יחסית תוחלת חיים, הגבלת המקורות של וריאציה, לכן להפחית את מספר בעלי החיים הנדרשים כדי לזהות הבדלים. אסטרטגיות כדי לגרום מחלות גיד בחולדות יש הסתמכה על אינדוקציה כימיים, אלא גם על יצירה כירורגית של גיד חלקית פגמים21. ניתוח מודלים עשויים לדמות יותר דגמים כימיים טבעיים tendinopathies, אך יכול לגרום תחלואה גבוהה כשל קטסטרופי של הגיד הפגוע. במובן הזה, חולדות נראה טוב יותר מועמדים מאשר עכברים לדגמים אלה, שכן גודלם מאפשרת יצירה של פגמים גדולים יותר, ובכך להקל הערכה של רקמת ריפוי. חולדות ספראג-Dawley השתמשו במחקרים ניסיוני של tendinopathies ארבע קבוצות גיד מרכזי: מסובבי הכתף, כופף, אכילס, הגידים ברך26. בין אלה, מודלים המערבים הגיד ברך הם במיוחד מושך בשל גודל גדול יותר של גיד הזה וקלות גישה זה27. הגיד ברך מייחסת את השריר הארבע ראשי tibial tuberosity. בתוך מנגנון זה פושט, עצם הפיקה היא ויוצרת זה מנחה את הפעולה של הארבע ומגדיר את היקף proximal הגיד ברך. הנוכחות של עוגנים גרמית ב extents הפרוקסימלית ו דיסטלי של הגיד ברך מקלה על בדיקות ביו-מכני. מודלים המערבים הגיד ברך כלל להסתמך על פגמים כירורגי חד צדדית, עם גיד ללא פגע contralateral הגשה28,שליטה29. המודל הנפוץ ביותר של פגם גיד ברך כרוך excising את החלק המרכזי (1 מ מ רוחב) של הגיד ברך מהקודקוד דיסטלי של עצם הפיקה כדי החדרת tibial tuberosity, בעוד הגיד ברך contralateral הוא נותר ללא פגע. מדדי תוצאות כללו היסטולוגיה, שאינו הרסני בדיקה ביו-מכני או בדיקות ביו-מכני כשל, אולטראסאונד הדמיה, שמחוץ פלורסצנטיות הדמיה, התבוננות ברוטו של בדיקות פונקציונליות28,30 ,31. מודלים חד צדדית אינן מאפשרות השוואה של הטיפול המוצע עם ניהול שמרני של פציעה דומה בתוך אותה חיה. באופן דומה, השוואה בין מספר טיפולים מחייב בעלי חיים נפרדים. מודל דו צדדיים לחסל את לזו וההבדלים בין ולהפחית את מספר החיות הדרושים עבור המחקר32. עם זאת, פציעות דו-צדדי עשוי להגדיל את התחלואה, צליעה הדו-צדדי יכול לעכב טיפול הערכה. מעט מחקרים דווח בקצרה השימוש של פגמים גיד ברך הדו-צדדיים חולדות אך המוקד על ההשפעות של טיפולים יותר מאשר פרי-סוכן ניהול ותחלואה של33,דגם34.

המטרה לטווח ארוך של מחקר זה היא לפתח אסטרטגיה כדי לשפר את ההישרדות stemness וב -vivo של UCM-MSCs שנועדו השתלת allogenic. כדי להשיג מטרה זו, אנו דיווחו לאחרונה stemness משופר של יו-MSCs על ידי היווצרות של spheroids על הסרט משקם, דגירה תחת סביבת ובשפתיים35. מאפיינים אלה במבחנה שויכו משופרת biomechanical מאפיינים מולדים גיד ברך שטופלו UCM ממוזגים-MSCs. בהתבסס על תוצאות אלו, המודל פגם גיד ברך הדו-צדדיים עכברוש. נשמע מתאים לבדוק את המועמד טיפולים עבור פציעות גיד36. מטרת המחקר דיווח הנה לספק נתונים היסטוריים פרוטוקולים עבור בידוד ואפיון של יו-MSCs, הכנת מערכת ביולוגיים עבור תאי גזע, יצירת וטיפול צלחית הדו-צדדיים גיד פגמים, ובעל שלאחר הניתוח שחזור והערכה של רקמת ריפוי בתוך הליקויים.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של ווסטרן אוניברסיטת למדעי הבריאות.

1. בידוד והרחבה של MSCs חברת מטריקס אקווין חבל הטבור

  1. להשיג את השליה מארה למבוגרים (בהריון) לאחר שנצפה foaling ואת גילוח ורחיצה כירורגית לבודד את חבל הטבור מן השליה. שמור את חבל הטבור buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) עם 1% פניצילין-סטרפטומיצין (P/S) ב 4 ° C במהלך העברה עד עיבוד.
  2. לשטוף את חבל הטבור פעמיים עם טמפרטורת החדר PBS עם 1% P/S בשפופרת 50 מ ל. חתך חבל הטבור לחלקים 2-inch-ארוכת על צלחת 150 מ מ, שטיפת הטמפרטורה בחדר PBS עם 1% P/S בשפופרת 50 מ ל שתיים או שלוש פעמים, עד רוב הדם שוטפים החוצה.
  3. חותכים את חבל הטבור longitudinally לחשוף כלי. הסר את כלי, כולל 2 עורקים, וריד על גבעול allantoic מן החוט בעזרת מלקחיים ומספריים. לאסוף את חבל הטבור מטריקס (וורטון), אשר הוא כלי שמסביב כמו ג'לי מטריקס, על צלחת 150 מ מ על ידי גירוד עם אזמל, מינצ הריבה חתיכות משובחים.
  4. וורטון המקום מרסיסים הטבור 2 – 3 (כ 12-15 גרם) בשפופרת 50-mL עם 15 מ"ל של 0.1% (w/v) collagenase פתרון מסוג IA PBS. דגירה ב 37 ° C עם טלטול עדין עבור 3-4 h עד התפרקה.
  5. צנטריפוגה רקמות מתעכל ב g 300 x למשך 15 דקות, תשאף תגובת שיקוע. Resuspend רקמה מתעכל ב-15 מיליליטר בטמפרטורת החדר PBS עם 1% P/S, לערבב על ידי pipetting צנטריפוגה-g 150 x עבור 5 דקות, תשאף תגובת שיקוע (שטיפה). חזור על לשטוף פעמיים נוספות.
  6. Resuspend שטף את התאים ב-15 מיליליטר בטמפרטורת החדר PBS עם 1% P/S, לערבב על ידי pipetting, זן מאת עם 100 מיקרומטר תא מסננת, צנטריפוגה ב g 150 x למשך 5 דקות, תשאף תגובת שיקוע.
  7. הכן תרבות בינוני (ס מ) על ידי ערבוב נמוך הגלוקוז Dulbecco של בינוני הנשר ששינה (LG-DMEM) עם סרום שור עוברית (FBS) ו 1% P/ס לעקר את המדיום על-ידי סינון.
  8. Resuspend מאומצות בתאים 10 מ"ל של ס מ מראש התחמם עד 37 ° C, לערבב על ידי pipetting, להעביר לתוך בקבוקון 25 ס מ2 תרביות רקמה, דגירה 5% CO2 ב-90% לחות ו 37.0 ° C. שינוי ס"מ כל 3 ימים עד התרבות מגיע למפגש 70 – 80%, כאשר התרבות להיות passaged.
  9. המעבר לתרבות, תשאף ס מ את הבקבוק, לשטוף עם 5 מ של טמפרטורת החדר PBS פעמיים ועל ניתוק עם 3 מ"ל של 0.25% טריפסין/ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
  10. לנטרל טריפסין/EDTA עם 6 מ של ס מ מראש חימם את 37.0 ° C, לערבב באמצעות pipetting, להעביר לתוך צינור 15 מ"ל, צנטריפוגה ב g 150 x למשך 5 דקות, תשאף תגובת שיקוע. Resuspend תאים מנותק מ ל 1 ס מ, לערבב על-ידי pipetting. לספור את התאים קיימא באמצעות trypan blue ו- hemocytometer. זרע מחדש לתוך בקבוקון תרביות רקמה 25 ס מ2 -תאים/ס מ 5,0002, דגירה 5% CO2 ב-90% לחות ו 37.0 ° C.

2. הכנת Spheroids עם UCM-MSCs תרבותי על סרטים משקם

  1. כדי להכין 100 מ של 1% (w/v) משקם פתרון, להוסיף 1 גר' משקם 99 מ ל מים מזוקקים (dH2O) ומערבבים היטב עם פגים.
  2. להוסיף 670 µL של חומצה אצטית ולהמשיך לערבב עד משקם מתמוסס והופך צמיגה. זה בדרך כלל לוקח 3-4 שעות.
  3. להוסיף 500 µL של פתרון משקם לבאר כל צלחת תרביות רקמה 12-ובכן, מערבולת את הצלחת כדי להפיץ משקם פתרון אחיד ולכסות את כל המשטח התחתון.
  4. יבש את הצלחת פתרון מצופה משקם תחת זרימה שכבתית ארון ללא כיסוי במשך הלילה במשך 24 שעות ביממה. ברגע מיובש, סרט דק נוצר ואת דבקה צלחת.
  5. לנטרל משקם הסרט על-ידי הוספת 1 מ"ל של 0.5 N הידרוקסיד הנתרן (NaOH) פתרון טוב לכל, תקופת דגירה של 2 h בטמפרטורת החדר. האחות NaOH מכל קידוח ולשטוף כל טוב עם 1 מ"ל של dH2O 3 פעמים. לשטוף כל טוב עם 1 מ"ל אתנול 70% (EtOH) פעם אחת.
  6. כדי לעקר את הסרט משקם, להוסיף 1 מ"ל של 70% EtOH לתוך כל טוב ואני דגירה בין לילה בארון זרימה שכבתית. האחות EtOH הנותרים מכל קידוח ביום המחרת. לשטוף כל טוב עם 1 מ"ל של PBS סטרילי שלוש פעמים. לעקר את משקם הסרט באור אולטרה סגול תחת זרימה שכבתית ארון בן לילה ללא כיסוי.
  7. טופס spheroids של יו-MSCs, זרע מורחבת, passaged תאים לבאר כל-תאים/ס מ 5,0002, ולהעביר דגירה 5% CO2 ב-90% לחות ו 37.0 ° C.
    הערה: יכול להיות מודגרות תאים תחת היפוקסיה או normoxia, תלוי האינטרס של החוקר.

3. הבעה של סמני פני נותחו באמצעות Cytometry זרימה

  1. הכנת השעיה תא בודד
    1. צלחת רגילה
      1. הסר בינוני מכל קידוח, לשטוף פעמיים עם טמפרטורת החדר PBS.
      2. ניתוק תאים עם 500 µL של ריאגנט דיסוציאציה תא לתוך כל טוב של צלחת 12-ובכן למשך 5 – 10 דקות בטמפרטורת החדר.
      3. לאחר דגירה, מוסיפים 1 מ"ל של צביעת מאגר (PBS המכילה 0.5% BSA) לבאר כל ומערבבים על ידי pipetting כדי לנתק את התאים.
      4. העברת תא ההשעיה לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל, צנטריפוגה ב 150 x g למשך 5 דקות.
    2. משקם את הצלחת
      1. לאסוף את כל spheroids על-ידי מדיום שואבת באמצעות פיפטה עם טיפ 1,000 µL. העברת בינוני שנאספו לתוך צינור חרוטי 15-mL. לאחר איסוף בינוני, לשטוף היטב על-ידי הוספת 1 מ"ל ל- PBS, להעביר PBS שטף לתוך הצינור חרוט באותה 15 מ"ל.
      2. תגובת שיקוע צנטריפוגה spheroids-g x 150 עבור 5 דקות והסר.
      3. להוסיף 500 µL מהתרכובת דיסוציאציה תא (למשל, accutase), תקופת דגירה של 5 – 10 דקות בטמפרטורת החדר. מערבבים באמצעות pipetting טיפ 1 מ"ל עד spheroids מביצועם אינן גלויות.
      4. להוסיף 1 מ"ל של מאגר מכתימים לתוך תא בודד ההשעיה צנטריפוגה ב 150 x g למשך 5 דקות.
  2. שטיפת התאים
    1. להסיר את תגובת שיקוע מהצינור חרוט והשהה מחדש את התאים 3 מ"ל של קור מכתים מאגר. לשמור תאים על קרח לאורך כל הניסוי שלב זה.
    2. צנטריפוגה ב g x 300 במשך 5 דקות (כביסה).
    3. לשטוף פעמיים.
  3. צביעת תאים
    1. תגובת שיקוע צנטריפוגה-300 גרם x עבור 5 דקות והסר.
    2. לספור התאים קיימא באמצעות trypan blue hemocytometer. עונה 1 פרק 106 תאים מחדש להשעות חסימת µL 50 מאגר (PBS המכיל 10% הסוס סרום), תקופת דגירה של 30 דקות על קרח.
    3. להוסיף 10 µL fluorescein isothiocyanate (FITC) מצומדת נוגדנים (CD44, CD90, CD105, CD34, histocompatibility הגדולות מורכבות (MHC) class II או isotype פקד עבור כל נוגדן) ו- µL 40 של צביעת המאגר ולאחר מכן דגירה מוגנים מפני אור עבור h 1 על קרח.
    4. להוסיף 3 מ"ל של קור מכתים מאגר לערבב, צנטריפוגה-g 300 x עבור 5 דקות ואני תשאף תגובת שיקוע (כביסה).
    5. חזור על לשטוף פעמיים.
    6. מחדש להשעות בגדר תא ב- 0.5 מ של צביעת מאגר
    7. להוסיף 5 µL של 7-מ (הכדאיות צבען) ולאחר תקופת דגירה של 30 דקות על הקרח
    8. לנתח דגימות תאים מוכתם על ידי זרימה cytometer. אל תכלול פסולת על ידי האס ו FSC שלהם קטן יותר, לזהות את התאים קיימא עם ספיגת התחתון של 7-מ. מגרש FL1 ו- FL2 על y - ו x-הצירים, בהתאמה. השתמש בפקד isotype כדי ליצור שער מעל קו אלכסוני. למדוד את אחוז תאים מוכתם באופן חיובי באזור. ספירת לפחות 20,000 אירועים/המדגם (משלים איור 1).
    9. למדוד את אחוז תאים מוכתמת עם נוגדנים gating התאים קיימא ו- auto-זריחה, להפחית אחוז תאים מוכתם עם פקד isotype.

4. דו צדדיים גיד ברך דגם פגם בחולדה

  1. בחר חולדות ספראג-Dawley (למבוגרים זכר, 4-5 חודשים, משקל הגוף 350-375 גרם). שימו לב גדול יחסית לגודל החולדות בשימוש עבור דגם זה.
  2. עזים ומתנגד ולהחיל עין מלאכותית חומר סיכה העכברוש עם 8% sevoflurane 2 ל'/min 100% חמצן מועברת באמצעות מסכה, עד העלמות רפלקס קמצוץ-הבוהן בבית הבליעה אינדוקציה.
  3. לנהל זריקה תוך שרירית של Meloxicam (1 מ"ג/ק"ג) כמו מונעת כאבים.
  4. מקם את החולדה בין שני בקבוקי חצי ליטר מים מלא במים חמים ומכוסה מטלית כדי לשמור על טמפרטורת הגוף והמיקום, תוך מניעת פגיעה בעור. סרט הדבקה בכל קצה השולחן. כדי לצמצם את הסיכון של היפותרמיה, לכסות את הגוף עם פלסטיק בועות (איור 1).
  5. לשמור על הרדמה עם זרימה רצופה של 5% sevoflurane בתערובת 1 ליטר 100% חמצן דרך האף קונוס, עם החיה על recumbency הגבי על כרית חימום מים.
  6. כדי למנוע טראומה לעור, לא קליפ האתרים כירורגי. במקום זאת, להחיל קרם מסיר שיער מעל שני stifles. השתמש לוחץ הלשון כדי להסיר את קרם והשיער.
  7. שפשפי באתר כירורגית עם chlorhexidine digluconate סקראב, לשטוף עם אתנול 70% 3 פעמים.
  8. פצעים וחתכים בעור עם להב #15 האזמל עקר כיוון proximal כדי הדיסטלי, על ההיבט craniomedial של חנוק. . תתחיל לחתוך כ-1 ס מ proximal לרמה של עצם הפיקה, ותעלה כ 5 מ מ דיסטלי tubercle הטיביאלי.
  9. משקפים על העור כדי לחשוף את הגיד ברך על-ידי שחרור הרקמה התת עורית הבסיסית עם להב #15 ומהדקים.
  10. באמצעות הלהב #15 אזמל, בלו השלישי המרכזי של כל גיד ברך (1 מ מ) מן ההיבט דיסטלי של עצם הפיקה tibial tuberosity.
    1. יישר חוט קוטר מ מ 0.99 קירשנר נגד הגיד כתבנית כדי לתקנן את הגודל של הפגם ב כל איבר (איור 2).
    2. לעשות חתכים מלא-עובי 2 בכל צד של החוט קירשנר עם להב האזמל #15 מס לבודד את החלק המרכזי של הגיד (איור 3). נכרות החלק המרכזי הציר הקרוב, יש עם איריס בסדר מספריים (איור 4).
    3. לפני סגירת fascia של חנוק, הכנס את הקריש (מעורבות לתאים ההשעיה, ACP) עבור הקבוצות הטיפול המתאים כמתואר ב- 5.5. סגור fascia עם דפוס צולבת ועור עם דפוס intradermal בעזרת 5-0 polyglactin 910 תפרים (איור 5).
  11. חזור על הפעולות על חנוק contralateral.
    הערה: חיסרון אחד מוקצה באופן אקראי לקבל טיפול (גזע תאים ממוזגים על משקם או תרבותי על לוחות סטנדרטיים). הפגם contralateral נותר ריק כדי לשמש בקרה פנימית.
  12. לאחר הניתוח, לנהל 4 טבליות של enrofloxacin (2 מ"ג/לוח, אורלית, ופעם ביום) ו לוח של meloxicam (2 מ"ג/לוח, דרך הפה, פעם ביום) במשך 7 ימים. אלה מנות מומלצות על-ידי וטרינר חיות מעבדה ואושר בפרוטוקול IACUC.

5. משלוח של MSCs בתוך הפגם גיד ברך

  1. עזים ומתנגד עכבר בריא אשר לא משמש ליצירת פגם גיד ברך עם 8% sevoflurane 2 ל'/min 100% חמצן מועברת באמצעות מסכה, עד העלמות רפלקס קמצוץ-הבוהן בבית הבליעה אינדוקציה.
  2. לאסוף מ ל דם על ידי ניקוב לב מהחולדה ספראג-Dawley anesthetized (למבוגרים זכר, 4-5 חודשים, משקל הגוף 350-375 גרם), במזרק 5 מ עם מחט 20 גרם המכיל 1 מ ל חומצה-ציטראט-dextrose (5:1 v/v).
  3. המתת חסד העכברוש לאחר דקירה בלב, איסוף דם, על ידי הזרקת פנטוברביטל (100 מ"ג/ק"ג), בעוד תחת ההרדמה באותו intracardial.
  4. Centrifuge המדגם-350 גרם x למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. להעביר את תגובת שיקוע ולאחסן aliquots (120 µL כל) ב-20 ° C עד השימוש.
  5. מיד לפני ההשתלה ויוו , להפשיר את aliquot הנ ל, לערבב µL 20 עם 0.5 x 10 MSCs6 (מ- 1.9 או 3.1.2.1) מנותקת צלחות רגיל באמצעות טריפסין/EDTA, או לאסוף משקם צלחות על ידי שטיפה (עם PBS/בינוני).
  6. 6 µL של 10% סידן כלורי (2CaCl) להוסיף µL 100 הנותרים של פלסמה המופשרים בטוב של 96-ובכן צלחת כדי להפעיל הפלזמה, זירוז היווצרות קריש דם (מופעל פלזמה ממוזגים: ACP).
  7. לערבב תא ההשעיה (20 µL) ו- ACP (µL 100) ליצירת קריש דם (איור 6). מקם את קריש הדם בתוך הפגם גיד ברך שנוצרו לפני סגירת fascia של חנוק (ראה שלב 4.10.3).

6. התוצאה הפונקציונלית

  1. לפקח על חולדות פעמיים ביום, סימנים של כאב, בהתבסס על37,38 סולם (RGS) גרימיס עכברוש ונפיחות מעל ההשתלה.
    הערה: שיטת הניקוד (0-6) פותחה כדי להעריך את הפונקציה אמבולטורי מבוסס על 3 פעילויות, כולל עמידה הגפיים האחוריות מתוזמן עם forelimbs נתמך (0-3), בעיתוי הגפיים האחוריות שזורמים בעמידה (0-2), ואת היכולת לטפס (קיר (0-1) כלוב פלסטיק של 17 ס"מ טבלה 1).
  2. הערכת חולדות על הפעילות עומד שתי הגפיים האחוריות בבוקר ובערב של כל נקודת זמן לחישוב ציון ממוצע.
  3. הערכת חולדות על היכולת בהצלחה לטפס על קיר כלוב פלסטיק 17 ס"מ עם שני הגפיים האחוריות שנגיע לפסגה.

7. גרוס המראה ואת Histopathology של הגיד ברך

  1. המתת חסד חולדות ב 7 ימים (כדי להעריך דלקת) או 28 ימים (כדי להעריך ריפוי רקמות) פוסט הטיפול על-ידי intracardial הזרקת פנטוברביטל (100 מ ג/ק ג) תחת הרדמה עם 8% sevoflurane ו 2 ל' 100% חמצן מועברת באמצעות המסכה.
  2. לקצור עצם הפיקה-גיד-שוקה tuberosity יחידות על ידי סכין ומספריים לאחר המתת חסד. הסרת רקמות רכות והרצועות סביב חנוק, חוץ הגיד ברך.
  3. לבחון כל הדגימה מראה גולמי, עיבוי של הגיד (איור 7).
  4. אוריינט הדגימה על ידי הנחת קשר של המנתח של 5.0 Polydioxanone על ההיבט הפרוקסימלית ואת לרוחב של הגיד. לתקן את הדגימה כל 10% הפתרון נייטרלי פורמלין במאגר ולקבל מקטעים רוחבי (5 מיקרומטר) החלק באמצע של כל גיד.
  5. כתם הסעיפים באמצעות hematoxylin אאוזין, ואת Trichrome של מאסון מכתים בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים.
  6. נבחן מקטע כדי לזהות הנוכחות של שטף דם בתוך הפגם, וכן שינויים פתולוגיים כגון דלקת.
  7. להעריך את הציון היסטולוגית של מקטעים באמצעות מערכת התוצאות שפורסמו בעבר, המבוססים על קולגן כיתה, מידת אנגיוגנזה, סחוס היווצרות (טבלה 2)39.

תוצאות

במחקר הנוכחי, התוצאות מוצגים אומר ± SD (סטיית תקן). התאים הם בודדו אותנו מהמתרחש חבלים חבל הטבור של 6 סוסות, אחוז שורות תאים מבודדים לבטא כל סמן תא השטח תחת מיזוג רגיל או משקם הושוו עם מבחן פרידמן, כמו ניתוח השונות פרמטרית עם חזר אמצעים. ליצירת דגם של גיד פגם, חולדות 8 שימשו להע...

Discussion

תאים לסוסים נבחרו עבור פרויקט זה, כי בסופו של דבר אנחנו מתכוונים לבחון את המועמדים גישות ניהול של tendinopathies טבעי אצל סוסים. ואכן, פציעות גיד אצל סוסים הם מושך כמודלים הטבעי של tendinopathy באדם עקב הדמיון ביולוגי בין הסוסים כופף דיגיטלי שטחית גיד אכילס בני41. תא השטח סמני CD44, CD90, CD105, CD34 ו...

Disclosures

המחברים יש אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

המחברים רוצה להכיר את ד ר סו, PhD, אותה לניתוח סטטיסטי של הנתונים. המחברים גם תודה ד ר מקלור, לוטרינריה, DACLAM, לה עצות על ההרדמה, כאב ניהול פרוטוקולים השתמשו במחקר. פרויקט זה נתמך על ידי מענקים ממשרד מדעי אוניברסיטת ווסטרן לבריאות של סגן עבור מחקר (12678v) וקרנות 1433 סעיף USDA (2090).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
PBS 10xHycloneSH30258.01Consumable
Collagenase type IAWorthingtonLS004197Consumable
DMEM low glucoseHycloneSH30021.FSConsumable
Fetal Bovine SerumHycloneSH30910.03Consumable
Penicillin/Streptomycin 100xHycloneSV30010Consumable
Trypsin 0.25%HycloneSH30042.01Consumable
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104Consumable
Trypan blueHycloneSV30084.01Consumable
Dimethyl SulfoxideSigmaD2650Consumable
ChitosanSigmaC3646Consumable
Sodium HydroxideSigmaS8045Consumable
Bovine Serum AlbuminHycloneSH30574.01Consumable
Round bottom polystyrene tubeCorning149591AConsumable
Mouse anti-horse CD44 (FITC)AbD serotecMCA1082FConsumable
Mouse anti-rat CD90 (FITC)AbD serotecMCA47FTConsumable
Mouse anti-horse MHC-II (FITC)AbD serotecMCA1085FConsumable
Mouse IgG1 (FITC) - Isotype ControlAbD serotecMCA928FConsumable
Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC)abcamab11415Consumable
Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Controlabcamab91356Consumable
Mouse anti-human CD34 (FITC)BDBDB560942Consumable
Mouse IdG1 kappa (FITC)BDBDB555748Consumable
7-AADBDBDB559925Consumable
BD Accuri C6 Flow CytometerBDEquipment
Vacutainer 5 mLMed Vet InternationalRED5.0Consumable
Acid-citrate-dextroseSigmaC3821Consumable
Calcium ChlorideSigmaC5670Consumable
SevofluraneJD Medical60307-320-25Consumable
RatsCharles RiverStrain code: 400Experimental animal
Rat surgical kitHarvard apparatus728942Equipment
Surgical Blade #15MEDLINEMDS15115Consumable
Rat MD's Baytril (2 mg/Tablet),
Rimadyl (2 mg/Tablet)		Bio ServF06801Consumable
Polyglactin 910, 5-0EthiconJ436GConsumable
Eosin alchol shandonThermo scientific6766007Consumable
Harris HematoxylinThermo scientific143907Consumable

References

  1. Rossdale, P. D., Hopes, R., Digby, N. J., offord, K. Epidemiological study of wastage among racehorses 1982 and 1983. Vet Rec. 116 (3), 66-69 (1982).
  2. Black, D. A., Tucci, M., Puckett, A., Lawyer, T., Benghuzzi, H. Strength of a new method of achilles tendon repair in the rat - biomed 2011. Biomed Sci Instrum. 47, 112-117 (2011).
  3. Lake, S. P., Ansorge, H. L., Soslowsky, L. J. Animal models of tendinopathy. Disabil Rehabil. 30 (20-22), 1530-1541 (2008).
  4. Frank, C. B. Ligament structure, physiology and function. J Musculoskelet Neuronal Interact. 4 (2), 199-201 (2004).
  5. Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Equine Vet J. 44 (1), 25-32 (2012).
  6. Smith, R. K., et al. Beneficial effects of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in naturally occurring tendinopathy. PLoS One. 8 (9), e75697 (2013).
  7. Fossett, E., Khan, W. S., Longo, U. G., Smitham, P. J. Effect of age and gender on cell proliferation and cell surface characterization of synovial fat pad derived mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 30 (7), 1013-1018 (2012).
  8. Zaim, M., Karaman, S., Cetin, G., Isik, S. Donor age and long-term culture affect differentiation and proliferation of human bone marrow mesenchymal stem cells. Ann Hematol. 91 (8), 1175-1186 (2012).
  9. Leychkis, Y., Munzer, S. R., Richardson, J. L. What is stemness?. Stud Hist Philos Biol Biomed Sci. 40 (4), 312-320 (2009).
  10. VandeVord, P. J., et al. Evaluation of the biocompatibility of a chitosan scaffold in mice. J Biomed Mater Res. 59 (3), 585-590 (2002).
  11. Griffon, D. J., Abulencia, J. P., Ragetly, G. R., Fredericks, L. P., Chaieb, S. A comparative study of seeding techniques and three-dimensional matrices for mesenchymal cell attachment. J Tissue Eng Regen Med. 5 (3), 169-179 (2011).
  12. Schwartz, Z., Griffon, D. J., Fredericks, L. P., Lee, H. B., Weng, H. Y. Hyaluronic acid and chondrogenesis of murine bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan sponges. Am J Vet Res. 72 (1), 42-50 (2011).
  13. Ragetly, G., Griffon, D. J., Chung, Y. S. The effect of type II collagen coating of chitosan fibrous scaffolds on mesenchymal stem cell adhesion and chondrogenesis. Acta Biomater. 6 (10), 3988-3997 (2010).
  14. Ragetly, G. R., Griffon, D. J., Lee, H. B., Chung, Y. S. Effect of collagen II coating on mesenchymal stem cell adhesion on chitosan and on reacetylated chitosan fibrous scaffolds. J Mater Sci Mater Med. 21 (8), 2479-2490 (2010).
  15. Ragetly, G. R., et al. Effect of chitosan scaffold microstructure on mesenchymal stem cell chondrogenesis. Acta Biomater. 6 (4), 1430-1436 (2010).
  16. Ragetly, G. R., Slavik, G. J., Cunningham, B. T., Schaeffer, D. J., Griffon, D. J. Cartilage tissue engineering on fibrous chitosan scaffolds produced by a replica molding technique. J Biomed Mater Res A. 93 (1), 46-55 (2010).
  17. Slavik, G. J., Ragetly, G., Ganesh, N., Griffon, D. J., Cunningham, B. T. A replica molding technique for producing fibrous chitosan scaffolds for cartilage engineering. Journal of Materials Chemistry. 17 (38), 4095-4101 (2007).
  18. Griffon, D. J., Sedighi, M. R., Schaeffer, D. V., Eurell, J. A., Johnson, A. L. Chitosan scaffolds: interconnective pore size and cartilage engineering. Acta Biomater. 2 (3), 313-320 (2006).
  19. Huang, G. S., Dai, L. G., Yen, B. L., Hsu, S. H. Spheroid formation of mesenchymal stem cells on chitosan and chitosan-hyaluronan membranes. Biomaterials. 32 (29), 6929-6945 (2011).
  20. Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
  21. Webster, R. A., Blaber, S. P., Herbert, B. R., Wilkins, M. R., Vesey, G. The role of mesenchymal stem cells in veterinary therapeutics - a review. N Z Vet J. 60 (5), 265-272 (2012).
  22. Khan, M. H., Li, Z., Wang, J. H. Repeated exposure of tendon to prostaglandin-E2 leads to localized tendon degeneration. Clin J Sport Med. 15 (1), 27-33 (2005).
  23. Sullo, A., Maffulli, N., Capasso, G., Testa, V. The effects of prolonged peritendinous administration of PGE1 to the rat Achilles tendon: a possible animal model of chronic Achilles tendinopathy. J Orthop Sci. 6 (4), 349-357 (2001).
  24. van Schie, H. T., et al. Monitoring of the repair process of surgically created lesions in equine superficial digital flexor tendons by use of computerized ultrasonography. Am J Vet Res. 70 (1), 37-48 (2009).
  25. Schramme, M., Kerekes, Z., Hunter, S., Labens, R. Mr imaging features of surgically induced core lesions in the equine superficial digital flexor tendon. Vet Radiol Ultrasound. 51 (3), 280-287 (2010).
  26. Hast, M. W., Zuskov, A., Soslowsky, L. J. The role of animal models in tendon research. Bone Joint Res. 3 (6), 193-202 (2014).
  27. Warden, S. J. Animal models for the study of tendinopathy. Br J Sports Med. 41 (4), 232-240 (2007).
  28. Murrell, G. A., et al. Achilles tendon injuries: a comparison of surgical repair versus no repair in a rat model. Foot Ankle. 14 (7), 400-406 (1993).
  29. Ozer, H., et al. Effect of glucosamine chondroitine sulphate on repaired tenotomized rat Achilles tendons. Eklem Hastalik Cerrahisi. 22 (2), 100-106 (2011).
  30. Chan, B. P., Fu, S. C., Qin, L., Rolf, C., Chan, K. M. Pyridinoline in relation to ultimate stress of the patellar tendon during healing: an animal study. J Orthop Res. 16 (5), 597-603 (1998).
  31. Ni, M., et al. Tendon-derived stem cells (TDSCs) promote tendon repair in a rat patellar tendon window defect model. J Orthop Res. 30 (4), 613-619 (2012).
  32. Orth, P., Zurakowski, D., Alini, M., Cucchiarini, M., Madry, H. Reduction of sample size requirements by bilateral versus unilateral research designs in animal models for cartilage tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 19 (11), 885-891 (2013).
  33. Kajikawa, Y., et al. Platelet-rich plasma enhances the initial mobilization of circulation-derived cells for tendon healing. J Cell Physiol. 215 (3), 837-845 (2008).
  34. Xu, W., et al. Human iPSC-derived neural crest stem cells promote tendon repair in a rat patellar tendon window defect model. Tissue Eng Part A. 19 (21-22), 2439-2451 (2013).
  35. Taguchi, T., et al. Influence of hypoxia on the stemness of umbilical cord matrix-derived mesenchymal stem cells cultured on chitosan films. J Biomed Mat Res B: Appl Biomat. , (2017).
  36. Griffon, D. J., et al. Effects of Hypoxia and Chitosan on Equine Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Int. , 2987140 (2016).
  37. Roughan, J. V., Flecknell, P. A. Evaluation of a short duration behaviour-based post-operative pain scoring system in rats. Eur J Pain. 7 (5), 397-406 (2003).
  38. Sotocinal, S. G., et al. The Rat Grimace Scale: a partially automated method for quantifying pain in the laboratory rat via facial expressions. Mol Pain. 7, 55 (2011).
  39. Rosenbaum, A. J., et al. Histologic stages of healing correlate with restoration of tensile strength in a model of experimental tendon repair. HSS J. 6 (2), 164-170 (2010).
  40. Vidal, M. A., Walker, N. J., Napoli, E., Borjesson, D. L. Evaluation of senescence in mesenchymal stem cells isolated from equine bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord tissue. Stem cells and development. 21 (2), 273-283 (2011).
  41. Patterson-Kane, J., Becker, D., Rich, T. The pathogenesis of tendon microdamage in athletes: the horse as a natural model for basic cellular research. J Compar Pathol. 147 (2), 227-247 (2012).
  42. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  43. Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
  44. Zhang, K., Yan, S., Li, G., Cui, L., Yin, J. In-situ birth of MSCs multicellular spheroids in poly(L-glutamic acid)/chitosan scaffold for hyaline-like cartilage regeneration. Biomaterials. 71, 24-34 (2015).
  45. Montanez-Sauri, S. I., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microscale screening systems for 3D cellular microenvironments: platforms, advances, and challenges. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 72 (2), 237-249 (2015).
  46. Butler, D. L., et al. The use of mesenchymal stem cells in collagen-based scaffolds for tissue-engineered repair of tendons. Nat Protoc. 5 (5), 849-863 (2010).
  47. Brennan, M. P., Sinusas, A. J., Horvath, T. L., Collins, J. G., Harding, M. J. Correlation between body weight changes and postoperative pain in rats treated with meloxicam or buprenorphine. Lab Anim (NY). 38 (3), 87-93 (2009).
  48. Ramon-Cueto, A., Cordero, M. I., Santos-Benito, F. F., Avila, J. Functional recovery of paraplegic rats and motor axon regeneration in their spinal cords by olfactory ensheathing glia. Neuron. 25 (2), 425-435 (2000).
  49. Arculus, S. L. Use of meloxicam as an analgesic in canine orthopaedic surgery. Vet Rec. 155 (24), 784 (2004).
  50. Bervar, M. Video analysis of standing--an alternative footprint analysis to assess functional loss following injury to the rat sciatic nerve. J Neurosci Methods. 102 (2), 109-116 (2000).
  51. Perry, S. M., Getz, C. L., Soslowsky, L. J. Alterations in function after rotator cuff tears in an animal model. J Shoulder Elbow Surg. 18 (2), 296-304 (2009).
  52. Stoll, C., et al. Healing parameters in a rabbit partial tendon defect following tenocyte/biomaterial implantation. Biomaterials. 32 (21), 4806-4815 (2011).
  53. Hankemeier, S., et al. Bone marrow stromal cells in a liquid fibrin matrix improve the healing process of patellar tendon window defects. Tissue Eng Part A. 15 (5), 1019-1030 (2009).
  54. Silver, I. A., et al. A clinical and experimental study of tendon injury, healing and treatment in the horse. Equine Vet J Suppl. (1), 1-43 (1983).
  55. Enwemeka, C. S. Inflammation, cellularity, and fibrillogenesis in regenerating tendon: implications for tendon rehabilitation. Phys Ther. 69 (10), 816-825 (1989).
  56. Goldin, B., Block, W. D., Pearson, J. R. Wound healing of tendon--I. Physical, mechanical and metabolic changes. J Biomech. 13 (3), 241-256 (1980).
  57. Lyras, D. N., et al. The effect of platelet-rich plasma gel in the early phase of patellar tendon healing. Arch Orthop Trauma Surg. 129 (11), 1577-1582 (2009).
  58. Oshiro, W., Lou, J., Xing, X., Tu, Y., Manske, P. R. Flexor tendon healing in the rat: a histologic and gene expression study. J Hand Surg Am. 28 (5), 814-823 (2003).
  59. Visser, L. C., Arnoczky, S. P., Caballero, O., Gardner, K. L. Evaluation of the use of an autologous platelet-rich fibrin membrane to enhance tendon healing in dogs. Am J Vet Res. 72 (5), 699-705 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

133mesenchymalSpheroids

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved