ラットの両側膝蓋腱損傷モデルの幹細胞療法の評価

要約

準備とラットの両側膝蓋腱欠損モデル臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞スフェロイドの評価について述べる。このモデルは、未処理と処理の腱との間の違いを検出する発見だったし、2 処置間テスト許容罹患率に関連付けられていた。

要約

再生医療は、伝統的な治療法に挑戦する条件に新しい選択肢を提供します。有病率と罹患率、生物種間の寛解のこの組織の限られた癒しのプロパティと組み合わせて細胞療法に関する検索を求め、その有効性を検討するための実験モデルの開発を推進します。臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞 (UCM MSC) は、豊富な簡単に収集、倫理的な問題と奇形腫形成の危険性回避まだ原始胚性幹細胞をもっと密接に類似している魅力的な候補者よりも大人の組織由来の MSCs。 重要な関心は、スフェロイドの形成を通じて MSCs のプロパティを強化する戦略としてキトサンを重視しています。UCM-MSCs を分離するこの紙詳細テクニックはキトサン フィルムの回転楕円体を準備し、表面マーカー式回転楕円体形成の効果を分析します。その結果、キトサン膜上に形成した UCM MSC 回転楕円体の体内注入のラットの両側膝蓋腱損傷モデルの作成を説明します。合併症を認めなかった罹患率に関して研究、ストレス上昇の効果、または組織感染症。7 日手術群の合計機能スコアは正常ラットよりも低かったが、手術後 28 日以内に正常に返されます。組織の治癒の組織学的スコアは、異物反応と 28 日で治癒の進行がないこと 7 日間に評価処理の欠陥で血栓の存在を確認しました。この両側膝蓋腱欠損モデルが許容可能な罹患率に関連付けられているは、未処理の腱とトリートメントの違いの検出を許可各ラットにおける内部統制の作成による個体間変動を制御します。

概要

腱損傷は、種¹にわたって大幅に痛みや筋肉萎縮の最も一般的な原因の 1 つです。獣医学で腱と靱帯損傷は、馬に特別な関心の競走馬のすべての傷害の 82% を含む筋骨格系とそれらの 46% の腱や靭帯の^2,3に影響を与えます。瘢痕形成が癒される腱の力学的特性に影響を与えるし、屈筋腱の傷害後運動の使用へのリターンに守られた予後を説明します再傷害は最大で 2 年以内発生パワードップラーを馬の 67^%4。再生医療は、伝統的な治療法に挑戦する条件に新しい選択肢を提供します。自家幹細胞療法はいくつかの励みになる結果^5,6を生産しているが、組織の採取、細胞の処理/リプログラミングによる遅延管理の影響に関連する罹患率によって制限されます、幹の特性に (年齢) などの患者さんの健康状態は、^{7、8 を}細胞します。これらの制限は、既製の代替として同種幹細胞を調査するための理論的根拠を提供します。胎児の付属器由来の細胞は、倫理的な問題および胚性幹細胞に関連する奇形腫形成の危険性を回避するために魅力的な候補です。胎児の付属器の中で臍帯マトリックス (UCM)、Wharton のゼリーとも呼ばれますが豊富、集めやすいです。

細胞ソースに関係なく幹細胞性を高めることは同種の再生医療細胞バンクの確立に不可欠です。機能的観点から自己複製と多系統分化⁹の可能性として幹細胞性を定義できます。幹細胞性の証拠は、アッセイ、遺伝子マーカー Oct4、 Sox2, Nanog⁹の式と一緒に増殖と分化に依存します。幹細胞性を強化する方法の 1 つは、void のフィラーと UCM MSCs の増殖・分化を高めるキャリアとして機能する生体材料の使用に依存します。このアプローチは、多能性細胞に成熟した細胞を再プログラムする転写因子の操作に関する懸念を排除できます。生体幹細胞の潜在的なキャリアとして考慮される間、キトサンは生体適合性と分解性¹⁰魅力的です。この天然アミノ多糖類は、主に上位製貝¹⁰品として得られる 2 番目の最も豊富な天然多糖類キチン質のアルカリ脱アセチル化によって形成されます。以前 MSCs とキトサン足場間の相互作用を調査して回転楕円体^{11,12,13,14,15,}の形成の観察¹⁶. 我々 はまたキトサン行列^{12,13,14,15,16,17、軟骨分化の優位性を報告 18}。最近では、2 つの独立した研究は、脂肪組織によってスフェロイド形成を説明および胎盤組織由来キトサン フィルム^19,20上で培養した MSCs。回転楕円体のこの形成だけでなく、幹細胞性を強化、また生体内注入²⁰後幹細胞の保存を改善しました。

有病率と罹患率の種にわたって寛解の伸張の病態を検討して幹細胞注射など新しい治療法をテストする実験モデルの開発を求めています。馬、コラゲナーゼによる腱鞘炎は腱修復²¹で MSCs を使用して有効性を発揮する一般的なモデルです。注射は急性炎症性変化を引き起こすので、このアプローチの妥当性は限られている、臨床の伸張は通常慢性の結果に対し^22,23ストレスを掛けすぎています。さらに、腱の疾患の化学的誘導は治癒反応を誘発して症例^22,23に障害の治癒過程をレプリケートしません。浅指屈筋腱の部分の切除は、馬²⁴で腱鞘炎の手術モデルとして記載されています。最近では、低侵襲アプローチは、浅指屈筋腱²⁵の中核への外傷性の損傷を制限する使用されました。手術モデルは自然な腱の病気につながる可能性があります、²⁵を作成された損傷の範囲内の再現性に欠けがち疲労機構をシミュレートしません。モデル, 罹患率と腱の馬のモデルに関連付けられているコストに関係なく病気は体内の新規治療法の評価のための最初のステップとして齧歯動物モデルに関心を正当化するための制限です。

齧歯動物の実験モデルの主な利点の 1 つは、費用と個体間変動を制御する能力で構成されています。齧歯動物は、その急速な成長率により様々 な生理的要因に関して標準化することができますおよび短い寿命のスパンの変化の源を制限して、その違いを検出するために必要な動物の数を減らします。齧歯動物の腱疾患を誘導する戦略は、化学的誘導部分の腱欠陥²¹の外科的創造にもに依存しています。手術モデルの化学モデルをより自然な伸張をシミュレートすることが、高い罹患率と損傷した腱の壊滅的な障害につながることができます。その点、ラットだこれらのモデルのマウスよりもより良い候補者のサイズは、組織の治癒の評価を促進することにより、大規模な欠陥を作成できます。ラットは、4 つの主要な腱グループの伸張の実験的研究で使用されている: 腱、屈筋、アキレス、膝蓋腱²⁶。これらのうち、膝蓋腱を含むモデルは、この腱の大きなサイズと²⁷それへのアクセスの容易さのため特に魅力的です。膝蓋腱が脛骨粗面に大腿四頭筋をアタッチします。この伸筋機構内膝蓋骨は、大腿四頭筋の操作を指示し、膝蓋腱の近位の範囲を区別する種子骨です。膝蓋腱の近位と遠位の範囲で骨アンカーの存在生体力学的テストが容易になります。通常膝蓋腱を含むモデルは、コントロール^28,29として対側そのまま腱の片側手術の欠陥に依存します。最も一般的な膝蓋腱欠損モデルは、対側の膝蓋腱がそのまままま、脛骨粗面の挿入に膝蓋骨の遠位の頂点から膝蓋腱の中央部分 (幅 1 mm) を切除します。組織、非破壊力学的試験や生体力学的障害、超音波画像診断、 ex vivo蛍光イメージング、肉眼観察および機能テスト^{28,30 をテスト結果の措置が含まれています。 ,31}。一方的なモデルは提案された治療と同じ動物内で同様の負傷の保守的な管理とを比較できないようにします。同様に、いくつかの治療の比較では、別の動物が必要です。二国間のモデルは個体間変動を取り除き、³²の研究に必要な動物の数を減らすでしょう。しかし、二国間の傷害の罹患率を高める可能性があり、二国間跛行の治療評価を妨げる可能性が。簡単にいくつかの研究のレポート モデル^33,34の罹患率・周術期管理ではなく、治療の効果に関する両側膝蓋腱欠損ラットがフォーカスの使用。

この研究の長期的な目標は、UCM MSCs 宛ての同種移植の幹細胞性と生体内での生存率を改善するための戦略を開発することです。この目標を達成するために最近キトサン フィルムと³⁵低酸素環境下での培養でスフェロイドの形成による UCM MSCs の改良された幹細胞性を報告した.これらの体外プロパティ エアコン UCM と扱われる膝蓋腱欠損の改善された生体力学的特性と関連していた-MSCs これらの結果に基づいて、ラット両側膝蓋腱欠損モデルが候補者をテストするには適しているようだ。腱の傷害の³⁶のトリートメント。研究の目的は、分離とキャラクタリゼーション UCM MSCs の幹細胞、作成と両側膝蓋骨腱障害、手術後の治療のための生物学的デリバリー システムの準備のための詳しいプロトコルを提供するためにはここで報告回復と組織欠陥の中に癒しの評価。

プロトコル

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ウエスタン大学の保健学科によって承認されています。

1. 分離とウマ臍帯行列から MSCs の拡大

1. 観察 foaling 後大人の牝馬 (妊娠している) から胎盤を入手して無菌胎盤から臍帯を分離します。おいて臍帯リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 1% ペニシリン-ストレプトマイシン (P/S) の 4 ° C での転送中に処理まで。
2. 1% と室温 PBS で 2 回臍帯を洗う P/S 50 mL のチューブに。セクション 2 インチ長さ 150 mm の板と P/S 50 mL のチューブの 2 つのまたは 3 回まで血液のほとんどをすすいだ 1% 室温 PBS で洗浄断章に臍帯。
3. 船を公開する縦へその緒を切る。2 動脈、静脈、鉗子、はさみを使用してコードから尿の茎などの血管を削除します。メスで削って 150 mm の板の上にゼリーのようなマトリックスの周囲血管臍帯マトリックス (Wharton のゼリー) を収集し、細かい部分にゼリーをみじん切り。
4. 場所ワルトン 15 ml の PBS の 0.1% (w/v) コラゲナーゼ タイプ IA ソリューションの 50 mL チューブに 2-3 臍帯断片 (約 12-15 g) から。3-4 時間溶解するまで穏やかな揺れで 37 ° C で孵化させなさい。
5. 15 分間 300 x g で消化組織を遠心し、上清を吸引します。室温 PBS 1% の 15 mL で消化組織を再懸濁します P/S、ピペッティングで混ぜる、5 分間 150 × g で遠心、上清 (洗浄) を吸引します。二回以上洗濯を繰り返します。
6. 室温 PBS 1% の 15 mL のセルを洗浄再懸濁します P/S、ピペッティングで混ぜる、100 μ m セル ストレーナー付け, 150 x g で 5 分間遠心によるひずみ、上清を吸引します。
7. 低血糖ダルベッコを混合することによって培養液 (CM) を準備変更イーグル培地 (LG DMEM) ウシ胎児血清 (FBS) と 1 %p/s. 濾過により培地を滅菌します。
8. 37 ° C に加温 CM の 10 mL で緊張した細胞を再懸濁します、ピペッティングで混ぜる、25 cm²培養フラスコに移す、5% CO₂ 90% の湿度と 37.0 ° c. で孵化させなさい変更 CM 文化文化、継代時に 70-80% の合流点に達するまで 3 日おき。
9. 文化を通路にフラスコから CM を吸引、室温 PBS の 5 mL で 2 回洗浄、3 ml の 5 分の 37 ° C で 0.25% トリプシン/エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) のデタッチします。
10. トリプシン/EDTA 37.0 ° C に加温 CM の 6 ml を中和する、ピペッティングで混ぜる、150 x g で 5 分間遠心 15 mL チューブに移す、上清を吸引します。CM の 1 mL 中の剥離細胞を再懸濁します、ピペッティングで混ぜます。トリパン ブルーと検定を使用して実行可能なセルを数えます。5,000 セル/cm²で 25 cm²培養フラスコに再シードし、5% CO₂ 90% の湿度と 37.0 ° c. で孵化させなさい

2. UCM mscs キトサン膜上で培養した回転楕円体の準備

1. 1% (w/v) キトサン溶液の 100 mL を準備するには、キトサンの 1 g を加えて 99 mL の蒸留水 (dH₂O)、および磁性攪拌器でよく混ぜます。
2. 氷酢酸の 670 μ L を追加し、キトサンを溶解して粘性になるまで混合を続行します。これは通常 3-4 時間がかかります。
3. 12 ウェル培養プレートの各ウェルにキトサン溶液 500 μ L を追加し、キトサン ソリューションを均等に分散し、すべて底面のカバー プレートを旋回します。
4. キトサン コーティング ソリューション平板層流 24 時間一晩カバーなしキャビネットを乾燥させます。一度乾燥、薄膜を形成・ プレートに付着されます。
5. 各ウェルに 0.5 N 水酸化ナトリウム (NaOH) 溶液の 1 mL を追加してキトサン フィルムを中和し、室温で 2 時間インキュベートします。各ウェルから NaOH を吸引し、それぞれを洗ってよく dH₂O の 1 mL で 3 回。それぞれを洗って一度 70% エタノール (エタノール) 1 mL でも。
6. キトサン フィルムを殺菌するには、層流れのキャビネットで一晩 70 %etoh それぞれによく、インキュベートの 1 mL を追加します。次の日に各ウェルから残りのエタノールを吸引します。それぞれを洗っても 1 ml 滅菌 PBS の 3 回。キトサン フィルム流カバーなし一晩キャビネットの下紫外光を滅菌します。
7. フォームは UCM MSCs の回転楕円体に種子を拡大し 5,000 セル/cm²、各ウェルに、細胞を継代そして 5% CO₂ 90% の湿度と 37.0 ° c. で孵化させなさい
   注: セルは、低酸素症又は治験責任医師の関心に応じて常孵化することができます。

3 フローサイトメトリー分析表面マーカーの発現

1. 単一細胞懸濁液の準備
   1. 標準プレート
      1. 各ウェルからメディアを削除し、室温 PBS で 2 回洗います。
      2. 室温で 5-10 分の 12 ウェル プレートの各ウェルに、細胞解離試薬の 500 μ L でセルをデタッチします。
      3. インキュベーション後、染色バッファー (0.5 %bsa を含む PBS) 1 ml を各ウェルに、細胞をデタッチするピペッティングで混ぜます。
      4. 15 mL の円錐管 150 x g で 5 分間遠心し、細胞懸濁液を転送します。
   2. キトサン プレート
      1. 先端が 1,000 μ L ピペットを使用して吸引媒体によってすべての回転楕円体を収集します。15 mL の円錐管に集められた媒体。媒体を収集した後、PBS の 1 mL を追加してよく洗うし、同じ 15 mL の円錐管に洗浄 PBS を転送します。
      2. 5 分間 150 x g で回転楕円体を遠心し、上清を除去します。
      3. 細胞解離試薬 (例えばaccutase) を 500 μ l 添加し、室温で 5-10 分の間孵化させなさい。ミックスによるピペット 1 mL 先端まで回転楕円体を切り離して考えるし、表示されなくなります。
      4. 単一細胞懸濁液や 150 x g で 5 分間遠心に染色バッファーの 1 つの mL を追加します。
2. 洗浄のセル
   1. 円錐管から上澄みを除去し、再バッファーを染色冷 3 mL のセルを中断します。このステップから氷上実験を通して細胞を保ちます。
   2. 5 分 (洗濯) 300 × g で遠心分離機します。
   3. 2 回洗います。
3. セルを汚す
   1. 5 分間 300 × g で遠心し、上清を除去します。
   2. トリパン ブルーと検定を使用して実行可能なセルを数えます。50 μ L ブロックで 1 x 10 の⁶セルを再停止 (PBS 含む 10% 馬血清) をバッファーし、氷の上で 30 分間インキュベートします。
   3. 10 μ L フルオレセイン イソチオ シアン酸 (FITC) 共役抗体 (CD44、CD90, CD105、CD34、主要組織適合遺伝子複合体 (MHC) クラス II、または各抗体アイソタイプ コントロール) とバッファーを染色の 40 μ L を追加し、氷の上の 1 h の光から保護します。
   4. 染色バッファー冷 3 mL を加えるとミックス、5 分 300 × g で遠心、上清 (洗浄) を吸引します。
   5. 二回洗濯を繰り返します。
   6. 再バッファーを染色の 0.5 mL の細胞ペレットを中断します。
   7. 7 AAD (生存率色素) の 5 μ L を追加し、氷の上で 30 分間インキュベート
   8. フローサイト メーターによる細胞染色サンプルを分析します。小さく SSC と FSC によって破片を除外し、7 AAD の吸収性の低い実行可能なセルを識別します。プロット FL1 と FL2 に、y 軸と x 軸、それぞれ。アイソタイプ コントロールを使用すると、対角線上のゲートを作成できます。地域で積極的に陽性細胞の割合を測定します。少なくとも 20,000 イベント/サンプル (補足図 1) をカウントします。
   9. ゲーティング生菌と自動蛍光抗体染色細胞の割合を測定し、染色のアイソタイプ コントロールのセルの割合を減算します。

4. 両側膝蓋腱欠損モデル ラットの

1. ラット (成人男性、4-5 ヶ月、体重 350-375 g) を選択します。このモデルに使用されるラットの比較的大きいサイズに注意してください。
2. 麻酔し、誘導室でピンチからつま先まで反射の消失までマスクを介して配信される 2 L/分 100% 酸素を 8% セボフルラン ラット人工眼の潤滑剤を適用します。
3. 先制鎮痛としてメロキシカム (1 mg/kg の筋肉内注射を管理します。
4. 暖かい水で満たされ、皮膚傷害を防ぎながら体の温度と位置を維持するために布で覆われた 2 つの 0.5 L 水ボトル間ネズミを配置します。テーブルにそれぞれの端をテープします。低体温症のリスクを減らすためには、バブルラップ (図 1) と体をカバーします。
5. 5% セボフルラン 1 L 100% 酸素混合背臥床水加熱パッドの上に動物の鼻の円錐形の連続的な流れで麻酔を維持します。
6. 皮膚外傷を避けるためには、施術部位を切てはいけない。代わりに、両方の抑圧に除去クリームを適用します。舌圧子を使用して、クリームや髪を削除します。
7. クロルヘキシジン酸スクラブで手術部位をスクラブし、3 回を 70% エタノールでリンスします。
8. 抑圧の craniomedial の側面に、遠位、近位方向に滅菌 #15 メス刃で皮膚を切開します。膝蓋骨のレベルに近位部に約 1 cm の切開を開始し、約 5 mm 脛骨結節の遠位はそれを拡張します。
9. #15 メス刃を持つ基になる皮下組織の解放によって膝蓋腱を公開するスキンが反映されます。
10. #15 メス刃を使用して、脛骨粗面に膝蓋骨の遠位面から各膝蓋腱 (1 mm) の中央 3 分の 1 を切除します。
    1. 各肢 (図 2) の欠陥のサイズを標準化するためのテンプレートとして腱に対して 0.99 mm 径 Kirschner 金網を合わせます。
    2. (図 3) の腱の中央部分を分離する #15 メス刃を Kirschner 線の各側に 2 全層切開を作る。近位および遠位罰金アイリスはさみ (図 4) で中央部を切除します。
    3. 膝関節の筋膜を閉じる前に 5.5 で説明したように、適切な治療グループの血栓 (混合細胞懸濁液および ACP) を挿入します。十字パターンと筋膜と皮膚 5-0 polyglactin 910 縫合糸 (図 5) を使って皮のパターンを閉じます。
11. 対側の抑圧に手順を繰り返します。
    注: 1 つの欠陥は無作為に治療 (キトサン エアコンまたは標準プレート上で培養した幹細胞)。対側の欠陥が内部統制として機能する、空のまま。
12. 手術後管理エンロフロキサシンの 4 錠 (2 mg/錠、経口投与、1 日 1 回) とメロキシカム錠 (2 mg/錠経口投与、1 日 1 回) を 7 日間。これらの用量は実験動物の獣医師が推奨され、IACUC プロトコルで承認します。

5. 膝蓋腱欠損内の MSCs の配信

1. 2 L/分 100% 酸素マスクを届け誘導室でピンチからつま先まで反射の消失までに 8% セボフルランを膝蓋腱欠損を作成使用されていない健康なラットを麻酔します。
2. 収集する 5 mL の血液心臓穿刺によって麻酔 Sprague-dawley ラット (成人男性、4-5 ヶ月、体重 350-375 g)、5 mL シリンジで酸-クエン酸-ブドウ糖 (5:1 v/v) 1 mL を含む 20 G 針で。
3. ペントバルビ タール (100 mg/kg)、同じ麻酔中の intracardial 注入による心臓穿刺・採血後のラットを安楽死させます。
4. 室温で 15 分間 350 x g でサンプルを遠心します。上清を転送し、使用するまで-20 ° C で因数 (各 120 μ L) を格納します。
5. 体内注入の直前に上記の因数を解凍しミックス 0.5 x 10 と 20 μ L⁶ MSCs (1.9 または 3.1.2.1) からトリプシン/EDTA を用いた標準的な板から分離または (PBS/中) とフラッシュしてキトサン プレートから収集します。
6. 解凍プラズマ プラズマをアクティブにし、血栓の形成を誘導する 96 ウェル プレートのウェル内の残りの 100 μ L に 10% 塩化カルシウム (CaCl₂) の 6 μ L を追加 (エアコン プラズマをアクティブ化: ACP)。
7. 細胞懸濁液 (20 μ L) をミックスし、ACP (100 μ L) (図 6) 血栓を形成します。膝関節の筋膜を閉じる前に作成した膝蓋腱欠損内血栓を配置 (4.10.3 の手順を参照してください)。

6. 機能的予後

1. ラットのラット顔をしかめるスケール (RGS)^37,38に基づいて、着床に腫れ、痛みの兆候を 1 日 2 回を監視します。
   注: スコアリング システム (0-6) (0-3) サポート前肢と後肢の時間立っているを含む 3 の活動に基づく歩行の機能を評価するため開発された、時間自力で後肢に立って (0-2) と 17 cm プラスチック製ケージの壁 (0-1) (を登る能力表 1)。
2. 朝と夕方には平均スコアを計算する各時点のラットの 2 つの後肢に立って活動を評価します。
3. ラット正常に登頂両後肢と 17 cm プラスチック製ケージの壁を登る能力を評価します。

7. 総外観と膝蓋腱の病理組織学

1. (炎症の評価) に 7 日目にラットを安楽死させるか (組織の治癒を評価) に 28 日の投稿 (100 mg/kg) ペントバルビ タール麻酔 8% セボフルランと 2 L 100% 酸素マスクを介して配信の intracardial 注射治療。
2. 安楽死した後膝蓋腱-脛骨結節台メスとはさみを収穫します。軟部組織や靭帯膝蓋腱を除いて、抑圧の周りを削除します。
3. 外見と (図 7) 腱の肥厚のため検体を調べる。
4. 腱の近位部と外側面に 5.0 Polydioxanone の外科医の結び目を置くことによって試料に合わせます。10% 中性緩衝ホルマリン液で検体を修正し、各腱の中間部分から横断 (5 μ m) を取得します。
5. ヘマトキシリンとエオシン、次の標準的なプロトコルを染色、マッソンの Trichrome を使用してセクションを染色します。
6. 炎症などの病理学的変化と同様、欠陥、内血腫の存在を検出するセクションを確認します。
7. コラーゲン生、血管新生、および軟骨形成 (表 2)³⁹度に基づいて、以前に発行されたスコアリング システムを使用してセクションの組織学的スコアを評価します。

結果

現在の研究では、平均 ± SD (標準偏差) に結果が表示されます。セルは 6 馬のへその緒から隔離され標準またはキトサンのエアコンの下で各細胞の表面マーカーを表現する分離細胞の割合を比較したフリードマン検定との非パラメトリック解析の分散として繰り返し対策。腱欠損モデル作成用 7 日術後評価 8 ラットを用い、12 ラット 28 日間評価のため使用されました?...

ディスカッション

馬のセルは、最終的に馬の自然な伸張の管理の候補者のアプローチをテストしていきますのでこのプロジェクトに選ばれました。確かに、馬の腱損傷は浅指屈筋と人間⁴¹アキレス腱の生物学的類似性のため男で寛解の自然なモデルとして訴えています。細胞表面マーカー CD44、CD90, CD105、CD34 と MHC II は、細胞、細胞療法⁴²国際社会によって推薦の基準に従っ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS 10x	Hyclone	SH30258.01	Consumable
Collagenase type IA	Worthington	LS004197	Consumable
DMEM low glucose	Hyclone	SH30021.FS	Consumable
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30910.03	Consumable
Penicillin/Streptomycin 100x	Hyclone	SV30010	Consumable
Trypsin 0.25%	Hyclone	SH30042.01	Consumable
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104	Consumable
Trypan blue	Hyclone	SV30084.01	Consumable
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D2650	Consumable
Chitosan	Sigma	C3646	Consumable
Sodium Hydroxide	Sigma	S8045	Consumable
Bovine Serum Albumin	Hyclone	SH30574.01	Consumable
Round bottom polystyrene tube	Corning	149591A	Consumable
Mouse anti-horse CD44 (FITC)	AbD serotec	MCA1082F	Consumable
Mouse anti-rat CD90 (FITC)	AbD serotec	MCA47FT	Consumable
Mouse anti-horse MHC-II (FITC)	AbD serotec	MCA1085F	Consumable
Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control	AbD serotec	MCA928F	Consumable
Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC)	abcam	ab11415	Consumable
Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control	abcam	ab91356	Consumable
Mouse anti-human CD34 (FITC)	BD	BDB560942	Consumable
Mouse IdG1 kappa (FITC)	BD	BDB555748	Consumable
7-AAD	BD	BDB559925	Consumable
BD Accuri C6 Flow Cytometer	BD		Equipment
Vacutainer 5 mL	Med Vet International	RED5.0	Consumable
Acid-citrate-dextrose	Sigma	C3821	Consumable
Calcium Chloride	Sigma	C5670	Consumable
Sevoflurane	JD Medical	60307-320-25	Consumable
Rats	Charles River	Strain code: 400	Experimental animal
Rat surgical kit	Harvard apparatus	728942	Equipment
Surgical Blade #15	MEDLINE	MDS15115	Consumable
Rat MD's Baytril (2 mg/Tablet), Rimadyl (2 mg/Tablet)	Bio Serv	F06801	Consumable
Polyglactin 910, 5-0	Ethicon	J436G	Consumable
Eosin alchol shandon	Thermo scientific	6766007	Consumable
Harris Hematoxylin	Thermo scientific	143907	Consumable