JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu kağıt hazırlık ve göbek kordonu matris elde edilen Mezenkimal Kök hücre pulcuklarının bir ikili patellar tendon kusur modelinde bir fare ile değerlendirilmesi açıklanmaktadır. Bu model ile kabul edilebilir bir hastalık ilişkili ve tedavi edilmezse ve tedavi tendon arasındaki farklılıkları algılamak için bulundu ve iki tedaviler arasında test.

Özet

Rejeneratif tıp geleneksel tedaviler meydan koşullar yeni alternatifler sağlar. Yaygınlık ve morbidite tendinopathy türlerin, karşıdan karşıya bu doku sınırlı iyileştirici özellikleri ile birlikte, hücresel tedaviler için arama istenir ve onların etkinliğini incelemek için deneysel modelleri geliştirilmesi tahrikli. Göbek kordonu matris elde edilen Mezenkimal Kök hücre (UCM-MSC) adaylardır çekici oldukları için bol, basit-e doğru toplamak, etik kaygılar ve teratoma oluşumu riskini engelleyecek, henüz ilkel embriyonik kök hücreleri daha yakından benzer daha Yetişkin doku kaynaklı MSCs. önemli ilgi kitosan üzerinde MSCs özellikleri kullanılarak küresel oluşumu geliştirmek için bir strateji olarak odaklanmıştır. UCM-MSCs, izole etmek için bu kağıt ayrıntıları teknikleri pulcuklarının kitosan film hazırlamak ve küresel oluşumu yüzey marker ifade üzerinde etkisini analiz. Sonuç olarak, bir ikili patellar tendon yaralanma modelinde fareler oluşturulması kitosan filmde oluşan UCM-MSC pulcuklarının vivo içinde implantasyonu için tanımlanır. Komplikasyon gözlenmedi morbidite ile ilgili olarak çalışmada, efektleri veya doku enfeksiyonu stres. Toplam fonksiyonel puanı 7 gün itibariyle işletilen Rats'in normal fareler daha düşük ama ameliyattan sonra 28 gün içinde normale döndü. Histolojik dokusu şifa puanları pıhtı yabancı cisim reaksiyonu ve 28 gün şifa ilerliyor tedavi Defektlerde 7 gün değerlendirildi varlığına doğruladı. Bu iki taraflı diz kapağı tendon kusur model arası bireysel değişim her fare iç denetimde oluşturulması yoluyla denetler, kabul edilebilir morbidite ile ilişkili ve tedavi edilmezse tendon ve tedaviler arasındaki farklar tespiti izin.

Giriş

Tendon hasarı önemli ağrı ve kas atrofi en yaygın nedenlerinden biri arasında tür1' dir. Veteriner tıpta, tendon ve bağ yaralanmaları atlar, özel ilgi ve yarış atları tüm yaralanmaları % 82 kas-iskelet sistemi dahil olanların % 46'sı tendon ve bağ2,3etkiler şunlardır. Skar dokusu oluşumu iyileşmiş tendonları biyomekanik özellikleri etkiler ve atletik kullanmak dönmek için korunan prognoz fleksör tendon yaralanmalarının sonra açıklar; Re-yaralanma 2 yıl içinde ilâ % 67'atların konservatif4ele meydana gelmektedir. Rejeneratif tıp geleneksel tedaviler zorluklar bir koşul yeni alternatifler sağlar. Otolog kök hücre tedavisi biraz cesaret verici sonuçlar5,6 üretti ama doku koleksiyonu, hücre işleme/yeniden programlama nedeniyle gecikmiş yönetim ve etkisi ile ilişkili morbidite ile sınırlıdır hastanın sağlık durumu (örneğin, yaş) özelliklerinde kök,7,8hücreleri. Bu sınırlamalar kapalı alternatif olarak Allojeneik Kök hücre araştırma için bir gerekçe sağlamak. Çünkü onlar etik kaygılar ve embriyonik kök hücreleri ile ilişkili teratoma oluşumu riskini engelleyecek fetal adnexa elde edilen hücreleri çekici adaylardır. Fetal adnexa arasında adı da Wharton'ın Jelly, göbek kordonu matrix (UCM), bol ve basit-e doğru toplamak var.

Hücre kaynağı ne olursa olsun, stemness artırılması allojenik rejeneratif tıp için bir hücre banka kurmak için önemlidir. Bir fonksiyonel açıdan stemness kendini yenileme ve çoklu soy farklılaşması9için potansiyel olarak tanımlanabilir. Stemness kanıtı yayılması ve farklılaşma deneyleri, gene işaretleri Oct4, Sox2 ve MicroRNAs9ifade ile birlikte kullanır. Geçersiz dolgu maddeleri ve yayılmasını önleme ve UCM MSCs farklılaşma geliştirme taşıyıcıları hizmet etmek için Biyomalzeme kullanımı stemness geliştirmek için bir strateji kullanır. Bu yaklaşım işleme transkripsiyon faktörlerin İndüklenmiş pluripotent hücreler Olgun Hücreler yeniden programlamak için ilgili endişeleri ortadan kaldırır. Kök hücre için potansiyel taşıyıcıları olarak kabul Biyomalzeme arasında kitosan Biyouyumluluk ve çözünebilirlik10için itiraz ediyor. Bu doğal aminopolysaccharide öncelikle kabuklu deniz ürünleri10subproduct elde edilen kitin, ikinci en bol doğal polisakkarit alkalin deasetilasyonu tarafından oluşturulur. Biz daha önce MSCs ve kitosan iskele arasındaki etkileşimler araştırıldı ve pulcuklarının11,12,13,14,15, oluşumu gözlenen 16. biz de kitosan matrisler12,13,14,15,16,17, chondrogenesis üstünlüğünü bildirdi 18. Daha yakın zamanlarda, iki bağımsız çalışmalar pulcuklarının oluşumu yağ dokusu tarafından açıklanan ve plasenta doku kitosan film19,için20kültürlü MSCs türetilmiş. Pulcuklarının Bu oluşumu sadece stemness gelişmiş, ama aynı zamanda kök hücre saklama vivo içinde implantasyon20sonra geliştirilmiş.

Yaygınlık ve morbidite tendinopathy türlerin karşıdan karşıya tendinopathies Patofizyoloji çalışma ve kök hücre Enjeksiyonlar gibi yeni terapiler test modeller geliştirilmesi istenir. Atları, collagenase kaynaklı tendinit MSCs tendon onarım21' kullanarak etkinliğini göstermek için yaygın bir modeldir. Klinik tendinopathies genellikle kronik gelen neden ise22,23overstrain, akut enflamatuar degisimler enjeksiyonları neden bu yaklaşım alaka sınırlıdır. Buna ek olarak, kimyasal indüksiyon tendon hastalığın şifa bir yanıt neden olmaktadır ve Engelli iyileşme süreci klinik durumlarda22,23' mevcut çoğaltmaz. Eksizyon, yüzeysel dijital fleksör tendon bir kesim tendinit atları24içinde cerrahi bir model olarak tarif edilmiştir. Daha yakın zamanlarda, minimal invaziv bir yaklaşım travmatik hasar yüzeysel dijital fleksör tendon25Merkezi çekirdeğe sınırlandırmak için kullanılır. Cerrahi modeller doğal tendon hastalığa yol ve meyletmek-e doğru25oluşturulan hasar ölçüde tekrarlanabilirlik eksikliği yorgunluk mekanizma taklit değil. Model, morbidite ve tendon at modelleri ile ilişkili maliyeti ne olursa olsun yeni tedaviler vivo değerlendirilmesi için bir ilk adım olarak bir ilgi kemirgen modelleri haklı ek sınırlamalar hastalıklardır.

Rodents deneysel modeller ana avantajlarından biri maliyet ve arası bireysel farklılıklarına kontrol yeteneği oluşur. Kemirgenler çeşitli fizyolojik faktörler nedeniyle onların hızlı büyüme oranları ile ilgili standart ve nispeten kısa ömürleri, varyasyon kaynakları sınırlama ve bu nedenle hayvanların farklılıkları algılamak için gerekli sayısını azaltarak. Tendon hastalıkları Rodents ikna etmek için stratejiler kimyasal indüksiyon, aynı zamanda cerrahi kısmi tendon kusurları21oluşturulması yararlanmıştır. Cerrahi modeller doğal tendinopathies kimyasal modeller daha iyi taklit, ancak daha yüksek morbidite ve hasarlı tendon geri dönülemez hata yol açabilir. Onların boyutu daha büyük kusurları, böylece doku şifa değerlendirme kolaylaştırmak oluşturulmasına izin verir gibi bu bakımdan sıçanlar fareler bu modeller için daha iyi adaylar gibi görünüyor. Sprague-Dawley Rat tendinopathies dört büyük tendon gruplar halinde deneysel çalışmalarda kullanılmıştır: rotator manşet, fleksör, Achilles ve patellar tendon26. Bunlar arasında patellar tendon içeren bu tendon daha büyük boyutunu ve27erişim kolaylığı nedeniyle özellikle çekici modeller. Patellar tendon kuadriseps kas için tibial yumrunun ekler. İçindeki bu ekstansiyon mekanizmasını, patella kuadriseps eylem yönlendirir ve patellar tendon proksimal ölçüde delineates sesamoid bir kemiktir. Patellar tendon proksimal ve distal kapsamlarını, kemikli çapa varlığı biyomekanik testleri kolaylaştırır. Patellar tendon genellikle içeren modelleri tek taraflı cerrahi kusurları üzerinde bir denetim28,29hizmet veren bir kontralateral sağlam tendon ile güveniyor. En yaygın patellar tendon kusur model kontralateral patellar tendon değişmeden kalır iken diz kapağı, distal tepe üzerinden patellar tendon tibial yumrunun ekleme Merkezi bölümü (1 mm genişliğinde) bilincin içerir. Sonuçlar ölçü Histoloji, tahribatsız biyomekanik test veya biyomekanik başarısızlık, ultrason görüntüleme, ex vivo floresan görüntü, brüt gözlem ve işlevsel testleri28,30 test dahil ettik ,31. Tek taraflı modeller aynı hayvan içinde benzer bir yaralanma muhafazakar yönetimi ile önerilen tedavinin karşılaştırma izin vermez. Benzer şekilde, çeşitli tedaviler arasında karşılaştırma ayrı hayvanlar gerektirir. İkili bir model arası bireysel farklılıklar ortadan kaldırmak ve hayvanlar için bir çalışma32gerekli sayısını azaltın. Ancak, ikili yaralanmaları morbidite artırabilir ve ikili topallık tedavi değerlendirme sekteye uğrayabilir. Birkaç çalışmalar kısaca peri-operatif yönetimi yerine tedavi etkileri ve morbidite modeli33,34üzerinde ikili patellar tendon kusurları fareler ama odak kullanımı rapor.

Bu çalışmanın uzun vadeli hedef UCM MSCs allojenik nakli için mukadder stemness ve in vivo yaşam geliştirmek için bir strateji geliştirmek etmektir. Bu hedefe ulaşmak için biz son zamanlarda UCM MSCs geliştirilmiş stemness pulcuklarının oluşumu tarafından kitosan film ve kuluçka hipoksik ortam35altında bildirdi. Bu vitro özellikleri geliştirilmiş biyomekanik özellikleri patellar tendon kusurların şartına UCM ile tedavi ile ilişkili bulunmuştur-MSCs. bu sonuçlara göre fare ikili patellar tendon kusur modeli aday test etmek uygun görünüyor tendon yaralanmaları36tedavisi. İşte yalıtım ve UCM-MSCs, kök hücre, oluşturma ve ikili diz kapağı tendon kusur ve post operatif tedavi için biyolojik bir iletim sistemi hazırlanması karakterizasyonu için detaylı iletişim kuralları sağlamak için çalışmada bildirdi Kurtarma ve doku içinde kusurları şifa değerlendirilmesi.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Western Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü tarafından onaylanmıştır.

1. izolasyon ve MSCs at göbek kordonu matris genişlemesi

  1. Plasenta foaling gözlenen sonra yetişkin bir kısrak (hamile) elde etmek ve aseptik göbek kordonu plasenta den yalıtır. Göbek kordonu fosfat tamponlu tuz (PBS) % 1 penisilin-streptomisin (P/S) ile 4 ° C'de aktarım sırasında işleme kadar tutun.
  2. Göbek kordonu oda sıcaklığında %1 PBS ile iki kez yıkayın P/S 50 mL tüp içinde. Bölüm 150 mm plaka ve yıkama PBS oda sıcaklığında 1 P/S bir 50 mL tüp iki veya üç kez, kanın çoğu, kadar durulanır dışarı % 2 inç uzun parçalara göbek kordonu.
  3. Boyuna gemiler ortaya çıkarmak için göbek bağını kestim. Gemiler, 2 damar, damar ve forseps ve makas kullanarak kablosu allantoic bir SAP gibi kaldırın. Bir neşter ile kazıma tarafından 150 mm plaka üzerine jöle benzeri matris çevresindeki damarları göbek kordonu matris (Wharton'ın Jelly), toplamak ve ince parçalar halinde jöle kıyma.
  4. 2-3 göbek kordonu parçaları (yaklaşık 12-15 g) 15 mL %0,1 (w/v) collagenase türü IA çözümde PBS ile 50 mL tüp içinde yer Wharton'ın jöle. 37 ° C'de 3-4 eriyene kadar h için nazik sallayarak ile kuluçkaya.
  5. 300 x g 15dk için de sindirilir doku santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin. Oda sıcaklığında PBS % 1 ile 15 ml sindirilir doku resuspend P/S, karıştırmak pipetting tarafından santrifüj kapasitesi 150 x g 5 min için de ve (yıkama) süpernatant Aspire edin. İki kez daha fazla yıkama yineleyin.
  6. Oda sıcaklığında PBS % 1 ile 15 mL hücrelerde yıkanmış resuspend P/S, karıştırmak pipetting tarafından tarafından 100 µm hücre süzgeç, 5 min için 150 x g, santrifüj ile süzün ve süpernatant Aspire edin.
  7. Kültür orta (CM) düşük glikoz Dulbecco'nın karıştırılarak hazırlamak fetal sığır serum (FBS) ve %1 P ile modifiye kartal orta (LG-DMEM) / S. Sterilize orta filtrasyon tarafından.
  8. 37 ° C için önceden ısınmış cm 10 mL gergin hücrelerde resuspend, pipetting tarafından mix, bir 25 cm2 doku kültürü şişesi aktarmak ve % 5 CO%2 90 nem ve 37,0 ° C. kuluçkaya Değişiklik CM 3 Kültür passaged zaman 70-%80 izdiham, kültür ulaşıncaya kadar günde.
  9. Kültür geçiş için şişesi CM Aspire edin, oda sıcaklığında PBS ile 5 mL iki kez yıkayın ve % 0.25 tripsin/ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) 5 min için 37 ° C'de 3 mL ile bağlantısını kesin.
  10. Tripsin/EDTA için 37,0 ° C önceden ısınmış cm 6 mL ile nötralize, pipetting tarafından mix, bir 15 mL tüp, 5 min için 150 x g, santrifüj içine aktarmak ve süpernatant Aspire edin. Müstakil cm 1 mL hücrelerde resuspend, pipetting tarafından mix. Trypan mavi ve hemasitometre kullanarak canlı hücreleri saymak. 5. 000 hücre/cm225 cm2 doku kültürü şişesi içine yeniden tohum ve % 5 CO%2 90 nem ve 37,0 ° C. kuluçkaya

2. pulcuklarının UCM MSCs kitosan Filmler kültürlü ile hazırlanması

  1. 100 mL %1 (w/v) kitosan çözeltisi hazırlamak için kitosan 1 g 99 mL distile su (dH2O) ekleyin ve iyi bir manyetik karıştırıcı ile karıştırın.
  2. Buzul asetik asitin 670 µL ekleyin ve kitosan çözülür ve viskoz hale kadar karıştırma devam edin. Bu genellikle 3-4 saat sürer.
  3. Kitosan çözeltinin 500 µL 12-iyi doku kültürü plaka her kuyunun içine ekleyin ve kitosan çözüm eşit dağıtmak ve tüm alt yüzeyi kapsayacak için plaka girdap.
  4. Kitosan kaplama-çözüm plaka laminar akış için 24 saat bir kapak gece kabin altında kuru. Bir kez kuru, ince film kurdu ve plakasına yapıştırılır.
  5. Kitosan filmi 1 mL 0.5 N sodyum hidroksit (NaOH) çözeltisi her kuyuya ekleyerek nötralize ve oda sıcaklığında 2 h için kuluçkaya. NaOH her kuyudan Aspire edin ve her yıkama dH2O 1 mL ile üç kez iyi. Her yıkama 1 mL % 70 etanol (alkol) ile bir kez de.
  6. Kitosan film sterilize etmek için 1 mL % 70 alkol her şey ve kuluçkaya gecede laminar akış dolapta ekleyin. Her kuyudan kalan alkol içinde ertesi gün Aspire edin. Her yıkama 1 mL steril PBS ile üç kez iyi. Kitosan film ultraviyole ışık altında laminar akış gecede bir kapak kabine ile sterilize.
  7. İçin UCM MSCs formu pulcuklarının, tohum genişletilmiş ve 5. 000 hücre/cm2her kuyuya pasajlı hücreleri ve % 5 CO%2 90 nem ve 37,0 ° C. kuluçkaya
    Not: Hücreleri hipoksi veya normoxia, araştırmacı'nın faiz bağlı olarak altına inkübe.

3. ifade yüzey işaretlerinin Akış Sitometresi ile analiz

  1. Bir tek hücre süspansiyon hazırlanması
    1. Çift plaka
      1. Orta her kuyudan çıkarın ve iki kere oda sıcaklığında PBS ile yıkayın.
      2. Bir hücre ayrılma reaktif 500 µL hücrelerle oda sıcaklığında 5-10 dk 12-şey plaka her kuyuya bağlantısını kesin.
      3. Kuluçka sonra arabellek (% 0.5 BSA içeren PBS) Boyama 1 ml her kuyuya ve hücreleri ayırmak için pipetting karıştırın.
      4. Hücre süspansiyon 15 mL konik tüp ve 5 min için 150 x g, santrifüj içine aktarın.
    2. Kitosan plaka
      1. Tüm pulcuklarının alıyorum orta bir pipet 1000 µL uç ile kullanarak toplamak. Toplanan orta 15 mL konik tüp içine aktarın. Orta toplama sonra PBS 1 mL de ekleyerek yıkayın ve yıkanmış PBS aynı 15 mL konik tüp içine aktarın.
      2. 150 x g 5 min için de pulcuklarının santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.
      3. 500 µL hücre ayrılma reaktif (örneğin, accutase) ekleyin ve oda sıcaklığında 5-10 dk için kuluçkaya. Pulcuklarının ayırmak ve artık görünür değildir kadar pipetting 1 mL ipucu kullanarak karıştırın.
      4. Boyama arabellek 1 mL tek hücre süspansiyon ve 5 min için 150 x g, santrifüj içine ekleyin.
  2. Hücreleri yıkama
    1. Süpernatant konik tüp sizden kaldırmak ve soğuk arabellek boyama 3 mL hücrelerde yeniden askıya alma. Deney boyunca buzda hücreler bu adıma tutmak.
    2. 300 x g 5 min (çamaşır) için de santrifüj kapasitesi.
    3. İki kez yıkayın.
  3. Hücre boyama
    1. 300 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.
    2. Bir trypan mavi ve hemasitometre kullanarak hücrelerin saymak. 1 x 106 hücre yeniden askıya 50 µL kapatmaktır (PBS içeren % 10 at serum) tampon ve buz üzerinde 30 dk için kuluçkaya.
    3. 10 µL floresein Birleşik isothiocyanate (FITC) antikorları (CD44, CD90, CD105, CD34, MHC kompleksi (MHC) Sınıf II veya izotip kontrol her antikor için) ve tampon boyama 40 µL ekleyin, sonra ışık buz üzerinde 1 h için korumalı kuluçkaya.
    4. 3 mL soğuk arabellek boyama ekleyin ve karıştırın, 300 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi ve (çamaşır) süpernatant Aspire edin.
    5. İki kez yıkama yineleyin.
    6. Hücre Pelet arabellek boyama 0.5 mL içinde yeniden askıya alma
    7. 7-AAD (canlılığı boya) 5 µL ekleyin ve buz üzerinde 30 dk için kuluçkaya
    8. Lekeli hücre örnekleri Akış Sitometresi tarafından analiz. Enkaz onların küçük SSC ve FSC tarafından dışlamak ve hücrelerin 7-AAD alt alımını belirlemek. Y - ve x-eksen üzerinde sırasıyla FL1 ve FL2 arsa. İzotip kontrol çapraz çizgi yukarıda bir kapı oluşturmak için kullanın. Alandaki olumlu lekeli hücrelerin yüzdesi ölçmek. Sayısı en az 20.000 olayları/örnek (ek şekil 1).
    9. Hücrelerin ve otomatik Floresans çoğunluğuna tarafından antikorlar ile lekeli hücre yüzdesi ölçmek ve yüzde izotip kontrol ile lekeli hücre çıkarma.

4. ikili Patellar Tendon kusur sıçan modelinde

  1. Sprague-Dawley Rat (yetişkin erkek, 4 – 5 ay yaşlı, vücut ağırlığı 350 – 375 g) seçin. Bu model için kullanılan sıçan nispeten büyük boyutuna dikkat edin.
  2. Anestezi ve çimdik-ayak refleks indüksiyon odasında kaybolması kadar maske % 8 sevoflurane 2 L/dk % 100 oksijen fareyle teslim yapay göz yağ uygulayın.
  3. Meloksikam (1 mg/kg) bir kas içi enjeksiyon preemptive analjezi olarak yönetmek.
  4. Yer fare iki 0,5 L su şişeleri arasında sıcak su ve vücut ısısı ve pozisyon, Cilt yaralanma engelleyen sırasında korumak için bir bezle kaplı. Tablo her ekstremite teyp. Hipotermi riskini azaltmak için kabarcık şal (şekil 1) ile vücudunu örtecek.
  5. Anestezi % 5 sevoflurane 1 L % 100 oksijen karışımı ile su ısıtma yastık üzerinde dorsal recumbency hayvan ile burun konisi, sürekli akış ile koruyun.
  6. Cilt travma önlemek için cerrahi siteleri küçük değil. Bunun yerine, her iki stifles üzerinde saç çıkarıcı krem uygulayın. Bir dil depressor kremi ve saç kaldırmak için kullanın.
  7. Cerrahi sitesi klorheksidin digluconate Maki ile fırçalayın ve % 70 etanol ile 3 kez yıkayın.
  8. Steril neşter #15 bıçak bastırmak craniomedial yönü üzerinde bir proksimal için distal yönde ile cilt deşmek. Belgili tanımlık kesme yaklaşık 1 cm patella seviyeye proksimal başlatın ve yaklaşık 5 mm için tibial tubercle distal genişletmek.
  9. Patellar tendon bir #15 neşter bıçakla temel subkutan doku boşaltarak ortaya çıkarmak için cilt yansıtır.
  10. #15 neşter bıçak kullanarak, her patellar tendon (1 mm) Merkezi üçüncü tibial yumrunun patella distal açıdan tüketim.
    1. 0,99 mm çaplı Kirschner teli tendon karşı her ekstremite (Şekil 2) üründe boyutunu standartlaştırmak için şablon olarak hizalayın.
    2. 2 tam-kalınlık insizyon Kirschner teli her tarafında tendon (şekil 3) merkez bölümünü yalıtmak için #15 neşter bıçak ile yapmak. Merkezi bölümde uzağından ve klemple iyi Iris makasla (şekil 4) çıkarabileceğim.
    3. Bastırmak fasya kapatmadan önce (karma hücre süspansiyon ve ACP) pıhtı 5.5 açıklandığı gibi uygun tedavi grupları ekleyin. Şerit çapraz bir desen ile hem 5-0 polyglactin 910 dikiş (şekil 5) kullanarak bir intradermal desen deri kapatın.
  11. Kontralateral bastırmak yordamı yineleyin.
    Not: Bir kusur rasgele bir tedavi (kök üzerinde kitosan şartına veya standart Tabaklarda kültürlü hücreleri) atanır. Kontralateral kusur iç denetimi hizmet için boş bırakılır.
  12. Ameliyattan sonra 4 tablet Enrofloksasin yönetmek (2 mg/tablet, sözlü olarak, bir kez her gün) ve bir tablet Meloksikam (2 mg/tablet, sözlü olarak, bir kez günlük) 7 gün için. Bu doz bir laboratuvar hayvan veteriner tarafından önerilen ve IACUC protokolünde onayladı.

5. teslim MSCs Patellar Tendon kusur içinde

  1. %8 sevoflurane 2 L/dk % 100 oksijen maskesi ile çimdik-ayak refleks indüksiyon odasında kaybolması kadar teslim ile patellar tendon kusur oluşturmak için kullanılan değil sağlıklı bir sıçan anestezi.
  2. 5 mL kan tarafından kalp ponksiyon imzalat Sprague-Dawley rat (yetişkin erkek, 4 – 5 ay yaşlı, vücut ağırlığı 350 – 375 g), bir 5 mL şırınga asit-sitrat-dekstroz (5:1 v/v) 1 mL içeren bir 20 G iğne ile toplamak.
  3. Fare Fentobarbital (100 mg/kg), süre aynı anestezi altında intracardial enjeksiyonla kardiyak ponksiyon ve kan toplama, sonra ötenazi.
  4. 350 x g için oda sıcaklığında 15 dk da örneğine santrifüj kapasitesi. Süpernatant aktarın ve aliquots (120 her µL)-20 ° c kadar kullanmak depolayın.
  5. Vivo implantasyonu, hemen önce yukarıdaki aliquot çözülme ve 0.5 x 10 ile 20 µL tripsin/EDTA kullanarak standart plakalar müstakil6 MSCs (veya'den alınan 1.9 3.1.2.1) mix veya (PBS/orta) temizlenerek kitosan plakalar toplamak.
  6. Çözdürülen plazma plazma etkinleştirmek ve pıhtı oluşumu teşvik için 96-şey plaka bir kuyu içinde kalan 100 µL % 10 Kalsiyum klorür (CaCl2) 6 µL eklemek (şartına plazma aktif: ACP).
  7. Mix hücre süspansiyon (20 µL) ve ACP (100 µL pıhtı (şekil 6) oluşturmak için). Bastırmak fasya kapatmadan önce oluşturulan patellar tendon kusur içinde pıhtı yerleştirin (bkz. Adım 4.10.3).

6. fonksiyonel sonuç

  1. Fareler üzerinde fare yüz buruşturma ölçek (RGS)37,38 dayalı ve implantasyon siteleri üzerinde şişlik ağrı belirtileri için günde iki kez izlemek.
    Not: Puanlama sistemi (0-6) ayaktan işlevin (0-3) 3 faaliyetleri, desteklenen ön ayakları ile zamanlanmış arka bacak ayakta dahil olmak üzere temel geliştirilmiştir, desteksiz hind bacak ayakta (0-2) ve yeteneği bir 17 cm plastik kafes duvar (0-1) (tırmanmak için zaman aşımına uğradı Tablo 1).
  2. Fareler iki arka bacak ayakta faaliyetleri için sabah ve akşam ortalama puan hesaplamak için her zaman noktasının değerlendirin.
  3. Fareler için başarıyla bir 17 cm plastik kafes üst ulaşan her iki arka bacaklarda ile tırmanma yeteneği değerlendirmek.

7. görünüm ve Patellar Tendon histopatoloji Brüt

  1. Fareler (iltihap değerlendirmek için) 7 gün ötenazi veya (doku şifa değerlendirmek için) 28 gün Fentobarbital (100 mg/kg) % 8 sevoflurane ve 2 L % 100 oksijen maskesi ile teslim ile anestezi altında intracardial iğne ile tedavi sonrası.
  2. Diz kapağı-tendon-tibia yumrunun birimlerle neşter ve makas ötenazi sonra hasat. Yumuşak doku ve kasları patellar tendon dışında bastırmak çevresinde kaldırın.
  3. Her numune brüt görünüm ve tendon (Şekil 7) kalinlasma inceleyin.
  4. Numune tendon proksimal ve yanal yönü üzerinde bir cerrah 's düğüm 5.0 Polydioxanone yerleştirerek gelecek şekilde yönlendirin. Her numune % 10 tarafsız tampon formalin çözümde düzeltmek ve enine bölümler (5 mikron) her tendon orta kısmından elde etmek.
  5. Hematoksilen Eozin ve standart protokolleri takip boyama Masson'ın Trichrome kullanarak bölümleri leke.
  6. Hematom iltihabı gibi patolojik değişikliklerin yanı sıra kusur içinde olup olmadığını belirlemek için bölümünü inceleyin.
  7. Kollajen sınıfa, anjiogenez ve kıkırdak oluşumu (Tablo 2)39derece alınarak daha önce yayımlanmış puanlama sistemi kullanma bölümlerine histolojik Puan değerlendirmek.

Sonuçlar

Mevcut çalışmada, ± SD (Standart sapma) demek gibi sonuçları sunulmuştur. Hücreleri 6 kısraklarda göbek bağları izole ve her hücre yüzey işaretçisine standart veya kitosan Klima altında ifade izole hücre satırlarının yüzdesi karşılaştırıldığında Friedman testi ile parametrik olmayan bir Varyans analizi ile olarak tekrarlanan önlemler. Tendon kusur modeli oluşturmak için 8 sıçan 7 gün ameliyat sonrası değerlendirme için kullanıldı ve 12 fareler 28 g...

Tartışmalar

Biz sonunda at doğal tendinopathies yönetiminde aday yaklaşımlar test niyetinde çünkü at hücreleri bu proje için seçildi. Nitekim, tendon yaralanmalarının at at yüzeysel dijital fleksör ve Aşil tendonu insanlar41yılında arasındaki biyolojik benzerliği nedeniyle tendinopathy adam doğal modelleri olarak çekici bulunmaktadır. Hücre yüzey işaretleyicileri CD44, CD90, CD105, CD34 ve MHC II immunophenotyping hücrelerinin hücresel tedavi42için uluslarar...

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Teşekkürler

Yazarlar Dr Su, doktora, verileri onun istatistiksel analiz için kabul etmek istiyorum. Yazarlar ayrıca Dr. McClure, DVM, doktora DACLAM, anestezi onu tavsiye için teşekkür ederiz ve ağrı yönetimi protokolleri çalışmada kullanılan. Bu proje araştırma (12678v) ve USDA bölüm 1433 fonları (2090) için Western Üniversitesi Sağlık Bilimleri dairesi Başkan Yardımcısı gelen hibe tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
PBS 10xHycloneSH30258.01Consumable
Collagenase type IAWorthingtonLS004197Consumable
DMEM low glucoseHycloneSH30021.FSConsumable
Fetal Bovine SerumHycloneSH30910.03Consumable
Penicillin/Streptomycin 100xHycloneSV30010Consumable
Trypsin 0.25%HycloneSH30042.01Consumable
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104Consumable
Trypan blueHycloneSV30084.01Consumable
Dimethyl SulfoxideSigmaD2650Consumable
ChitosanSigmaC3646Consumable
Sodium HydroxideSigmaS8045Consumable
Bovine Serum AlbuminHycloneSH30574.01Consumable
Round bottom polystyrene tubeCorning149591AConsumable
Mouse anti-horse CD44 (FITC)AbD serotecMCA1082FConsumable
Mouse anti-rat CD90 (FITC)AbD serotecMCA47FTConsumable
Mouse anti-horse MHC-II (FITC)AbD serotecMCA1085FConsumable
Mouse IgG1 (FITC) - Isotype ControlAbD serotecMCA928FConsumable
Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC)abcamab11415Consumable
Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Controlabcamab91356Consumable
Mouse anti-human CD34 (FITC)BDBDB560942Consumable
Mouse IdG1 kappa (FITC)BDBDB555748Consumable
7-AADBDBDB559925Consumable
BD Accuri C6 Flow CytometerBDEquipment
Vacutainer 5 mLMed Vet InternationalRED5.0Consumable
Acid-citrate-dextroseSigmaC3821Consumable
Calcium ChlorideSigmaC5670Consumable
SevofluraneJD Medical60307-320-25Consumable
RatsCharles RiverStrain code: 400Experimental animal
Rat surgical kitHarvard apparatus728942Equipment
Surgical Blade #15MEDLINEMDS15115Consumable
Rat MD's Baytril (2 mg/Tablet),
Rimadyl (2 mg/Tablet)		Bio ServF06801Consumable
Polyglactin 910, 5-0EthiconJ436GConsumable
Eosin alchol shandonThermo scientific6766007Consumable
Harris HematoxylinThermo scientific143907Consumable

Referanslar

  1. Rossdale, P. D., Hopes, R., Digby, N. J., offord, K. Epidemiological study of wastage among racehorses 1982 and 1983. Vet Rec. 116 (3), 66-69 (1982).
  2. Black, D. A., Tucci, M., Puckett, A., Lawyer, T., Benghuzzi, H. Strength of a new method of achilles tendon repair in the rat - biomed 2011. Biomed Sci Instrum. 47, 112-117 (2011).
  3. Lake, S. P., Ansorge, H. L., Soslowsky, L. J. Animal models of tendinopathy. Disabil Rehabil. 30 (20-22), 1530-1541 (2008).
  4. Frank, C. B. Ligament structure, physiology and function. J Musculoskelet Neuronal Interact. 4 (2), 199-201 (2004).
  5. Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Equine Vet J. 44 (1), 25-32 (2012).
  6. Smith, R. K., et al. Beneficial effects of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in naturally occurring tendinopathy. PLoS One. 8 (9), e75697 (2013).
  7. Fossett, E., Khan, W. S., Longo, U. G., Smitham, P. J. Effect of age and gender on cell proliferation and cell surface characterization of synovial fat pad derived mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 30 (7), 1013-1018 (2012).
  8. Zaim, M., Karaman, S., Cetin, G., Isik, S. Donor age and long-term culture affect differentiation and proliferation of human bone marrow mesenchymal stem cells. Ann Hematol. 91 (8), 1175-1186 (2012).
  9. Leychkis, Y., Munzer, S. R., Richardson, J. L. What is stemness?. Stud Hist Philos Biol Biomed Sci. 40 (4), 312-320 (2009).
  10. VandeVord, P. J., et al. Evaluation of the biocompatibility of a chitosan scaffold in mice. J Biomed Mater Res. 59 (3), 585-590 (2002).
  11. Griffon, D. J., Abulencia, J. P., Ragetly, G. R., Fredericks, L. P., Chaieb, S. A comparative study of seeding techniques and three-dimensional matrices for mesenchymal cell attachment. J Tissue Eng Regen Med. 5 (3), 169-179 (2011).
  12. Schwartz, Z., Griffon, D. J., Fredericks, L. P., Lee, H. B., Weng, H. Y. Hyaluronic acid and chondrogenesis of murine bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan sponges. Am J Vet Res. 72 (1), 42-50 (2011).
  13. Ragetly, G., Griffon, D. J., Chung, Y. S. The effect of type II collagen coating of chitosan fibrous scaffolds on mesenchymal stem cell adhesion and chondrogenesis. Acta Biomater. 6 (10), 3988-3997 (2010).
  14. Ragetly, G. R., Griffon, D. J., Lee, H. B., Chung, Y. S. Effect of collagen II coating on mesenchymal stem cell adhesion on chitosan and on reacetylated chitosan fibrous scaffolds. J Mater Sci Mater Med. 21 (8), 2479-2490 (2010).
  15. Ragetly, G. R., et al. Effect of chitosan scaffold microstructure on mesenchymal stem cell chondrogenesis. Acta Biomater. 6 (4), 1430-1436 (2010).
  16. Ragetly, G. R., Slavik, G. J., Cunningham, B. T., Schaeffer, D. J., Griffon, D. J. Cartilage tissue engineering on fibrous chitosan scaffolds produced by a replica molding technique. J Biomed Mater Res A. 93 (1), 46-55 (2010).
  17. Slavik, G. J., Ragetly, G., Ganesh, N., Griffon, D. J., Cunningham, B. T. A replica molding technique for producing fibrous chitosan scaffolds for cartilage engineering. Journal of Materials Chemistry. 17 (38), 4095-4101 (2007).
  18. Griffon, D. J., Sedighi, M. R., Schaeffer, D. V., Eurell, J. A., Johnson, A. L. Chitosan scaffolds: interconnective pore size and cartilage engineering. Acta Biomater. 2 (3), 313-320 (2006).
  19. Huang, G. S., Dai, L. G., Yen, B. L., Hsu, S. H. Spheroid formation of mesenchymal stem cells on chitosan and chitosan-hyaluronan membranes. Biomaterials. 32 (29), 6929-6945 (2011).
  20. Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
  21. Webster, R. A., Blaber, S. P., Herbert, B. R., Wilkins, M. R., Vesey, G. The role of mesenchymal stem cells in veterinary therapeutics - a review. N Z Vet J. 60 (5), 265-272 (2012).
  22. Khan, M. H., Li, Z., Wang, J. H. Repeated exposure of tendon to prostaglandin-E2 leads to localized tendon degeneration. Clin J Sport Med. 15 (1), 27-33 (2005).
  23. Sullo, A., Maffulli, N., Capasso, G., Testa, V. The effects of prolonged peritendinous administration of PGE1 to the rat Achilles tendon: a possible animal model of chronic Achilles tendinopathy. J Orthop Sci. 6 (4), 349-357 (2001).
  24. van Schie, H. T., et al. Monitoring of the repair process of surgically created lesions in equine superficial digital flexor tendons by use of computerized ultrasonography. Am J Vet Res. 70 (1), 37-48 (2009).
  25. Schramme, M., Kerekes, Z., Hunter, S., Labens, R. Mr imaging features of surgically induced core lesions in the equine superficial digital flexor tendon. Vet Radiol Ultrasound. 51 (3), 280-287 (2010).
  26. Hast, M. W., Zuskov, A., Soslowsky, L. J. The role of animal models in tendon research. Bone Joint Res. 3 (6), 193-202 (2014).
  27. Warden, S. J. Animal models for the study of tendinopathy. Br J Sports Med. 41 (4), 232-240 (2007).
  28. Murrell, G. A., et al. Achilles tendon injuries: a comparison of surgical repair versus no repair in a rat model. Foot Ankle. 14 (7), 400-406 (1993).
  29. Ozer, H., et al. Effect of glucosamine chondroitine sulphate on repaired tenotomized rat Achilles tendons. Eklem Hastalik Cerrahisi. 22 (2), 100-106 (2011).
  30. Chan, B. P., Fu, S. C., Qin, L., Rolf, C., Chan, K. M. Pyridinoline in relation to ultimate stress of the patellar tendon during healing: an animal study. J Orthop Res. 16 (5), 597-603 (1998).
  31. Ni, M., et al. Tendon-derived stem cells (TDSCs) promote tendon repair in a rat patellar tendon window defect model. J Orthop Res. 30 (4), 613-619 (2012).
  32. Orth, P., Zurakowski, D., Alini, M., Cucchiarini, M., Madry, H. Reduction of sample size requirements by bilateral versus unilateral research designs in animal models for cartilage tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 19 (11), 885-891 (2013).
  33. Kajikawa, Y., et al. Platelet-rich plasma enhances the initial mobilization of circulation-derived cells for tendon healing. J Cell Physiol. 215 (3), 837-845 (2008).
  34. Xu, W., et al. Human iPSC-derived neural crest stem cells promote tendon repair in a rat patellar tendon window defect model. Tissue Eng Part A. 19 (21-22), 2439-2451 (2013).
  35. Taguchi, T., et al. Influence of hypoxia on the stemness of umbilical cord matrix-derived mesenchymal stem cells cultured on chitosan films. J Biomed Mat Res B: Appl Biomat. , (2017).
  36. Griffon, D. J., et al. Effects of Hypoxia and Chitosan on Equine Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Int. , 2987140 (2016).
  37. Roughan, J. V., Flecknell, P. A. Evaluation of a short duration behaviour-based post-operative pain scoring system in rats. Eur J Pain. 7 (5), 397-406 (2003).
  38. Sotocinal, S. G., et al. The Rat Grimace Scale: a partially automated method for quantifying pain in the laboratory rat via facial expressions. Mol Pain. 7, 55 (2011).
  39. Rosenbaum, A. J., et al. Histologic stages of healing correlate with restoration of tensile strength in a model of experimental tendon repair. HSS J. 6 (2), 164-170 (2010).
  40. Vidal, M. A., Walker, N. J., Napoli, E., Borjesson, D. L. Evaluation of senescence in mesenchymal stem cells isolated from equine bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord tissue. Stem cells and development. 21 (2), 273-283 (2011).
  41. Patterson-Kane, J., Becker, D., Rich, T. The pathogenesis of tendon microdamage in athletes: the horse as a natural model for basic cellular research. J Compar Pathol. 147 (2), 227-247 (2012).
  42. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  43. Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
  44. Zhang, K., Yan, S., Li, G., Cui, L., Yin, J. In-situ birth of MSCs multicellular spheroids in poly(L-glutamic acid)/chitosan scaffold for hyaline-like cartilage regeneration. Biomaterials. 71, 24-34 (2015).
  45. Montanez-Sauri, S. I., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microscale screening systems for 3D cellular microenvironments: platforms, advances, and challenges. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 72 (2), 237-249 (2015).
  46. Butler, D. L., et al. The use of mesenchymal stem cells in collagen-based scaffolds for tissue-engineered repair of tendons. Nat Protoc. 5 (5), 849-863 (2010).
  47. Brennan, M. P., Sinusas, A. J., Horvath, T. L., Collins, J. G., Harding, M. J. Correlation between body weight changes and postoperative pain in rats treated with meloxicam or buprenorphine. Lab Anim (NY). 38 (3), 87-93 (2009).
  48. Ramon-Cueto, A., Cordero, M. I., Santos-Benito, F. F., Avila, J. Functional recovery of paraplegic rats and motor axon regeneration in their spinal cords by olfactory ensheathing glia. Neuron. 25 (2), 425-435 (2000).
  49. Arculus, S. L. Use of meloxicam as an analgesic in canine orthopaedic surgery. Vet Rec. 155 (24), 784 (2004).
  50. Bervar, M. Video analysis of standing--an alternative footprint analysis to assess functional loss following injury to the rat sciatic nerve. J Neurosci Methods. 102 (2), 109-116 (2000).
  51. Perry, S. M., Getz, C. L., Soslowsky, L. J. Alterations in function after rotator cuff tears in an animal model. J Shoulder Elbow Surg. 18 (2), 296-304 (2009).
  52. Stoll, C., et al. Healing parameters in a rabbit partial tendon defect following tenocyte/biomaterial implantation. Biomaterials. 32 (21), 4806-4815 (2011).
  53. Hankemeier, S., et al. Bone marrow stromal cells in a liquid fibrin matrix improve the healing process of patellar tendon window defects. Tissue Eng Part A. 15 (5), 1019-1030 (2009).
  54. Silver, I. A., et al. A clinical and experimental study of tendon injury, healing and treatment in the horse. Equine Vet J Suppl. (1), 1-43 (1983).
  55. Enwemeka, C. S. Inflammation, cellularity, and fibrillogenesis in regenerating tendon: implications for tendon rehabilitation. Phys Ther. 69 (10), 816-825 (1989).
  56. Goldin, B., Block, W. D., Pearson, J. R. Wound healing of tendon--I. Physical, mechanical and metabolic changes. J Biomech. 13 (3), 241-256 (1980).
  57. Lyras, D. N., et al. The effect of platelet-rich plasma gel in the early phase of patellar tendon healing. Arch Orthop Trauma Surg. 129 (11), 1577-1582 (2009).
  58. Oshiro, W., Lou, J., Xing, X., Tu, Y., Manske, P. R. Flexor tendon healing in the rat: a histologic and gene expression study. J Hand Surg Am. 28 (5), 814-823 (2003).
  59. Visser, L. C., Arnoczky, S. P., Caballero, O., Gardner, K. L. Evaluation of the use of an autologous platelet-rich fibrin membrane to enhance tendon healing in dogs. Am J Vet Res. 72 (5), 699-705 (2011).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T psay 133fare modeliTendon yaralanma modeliMezenkimal K k h crekitosanpulcuklar n nPatellar tendon pencere kusur

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır