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요약

이 종이 준비와 쥐에서 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 모델 탯 매트릭스 유래 중간 엽 줄기 세포 spheroids의 평가 설명합니다. 이 모델 수용 병 적 상태와 관련 되었다와 치료 및 치료 힘 줄 사이의 차이 검출 하기 위하여 발견 되었고 2 개의 처리 사이 테스트.

초록

재생 의학 조건 전통적인 치료에 도전 하는 새로운 대안을 제공 합니다. 정도와 종에 걸쳐 tendinopathy의 사망률이 조직의 한정 된 치료 속성 결합, 세포 치료에 대 한 검색 메시지가 있고 그들의 효능을 연구 실험 모델의 개발을 추진. 탯 매트릭스 유래 중간 엽 줄기 세포 (MSC UCM)는 매력적인 후보 때문에 풍부 하 고, 수집, 윤리적인 우려 및 기형종 형성의 위험 회피 아직 원시적인 배아 줄기 세포를 더 밀접 하 게 닮은 쉽게 보다 성인 조직 유래 MSCs 상당한 관심은 회전 타원 체 형성을 통해 MSCs의 재산을 강화 하는 전략으로 키토 산에 집중 했다. UCM-MSCs을이 종이 세부 기법 키토 산 필름 spheroids를 준비 하 고 표면 마커 식에 회전 타원 체 형성의 효과 분석. 따라서, 쥐에서 양측 슬 개 골 힘 줄 부상 모델의 창조는 UCM MSC spheroids 키토 산 필름 형성의 vivo에서 이식에 대 한 설명 되어 있습니다. 아니 합병증 관찰 되었다 병 적 상태에 관하여 연구에서 스트레스 상승 효과, 또는 조직 감염. 7 일 운영된 쥐의 총 기능 점수 정상 쥐 보다 낮은 했지만 수술 후 28 일 이내 정상으로 돌아왔다. 조직 치유의 조직학 점수 7 일 평가 처리 결함에 응고 이물질 반응, 그리고 28 일에 치료 진행의 부재의 존재를 확인 했다. 이 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 모델 각 쥐에는 내부 통제의 창조를 통해 간 개별 변형 제어, 수용 병 적 상태와 관련 된 되었고 치료 힘 줄과 치료의 차이점의 탐지를 허용.

서문

힘 줄 부상 종1에 걸쳐 상당한 통증과 근육 위축 증의 가장 일반적인 원인 중 하나입니다. 수의학, 경주 말에 모든 상해의 82 %musculoskeletal 시스템을 포함 하 고 그의 46%에 영향을 미칠 힘 줄과 인 대2,3말에 특별 한 관심의 힘 줄 및 인 대 부상 있습니다. 흉터 조직 형성과 치료 힘 줄의 biomechanical 속성에 영향을 미치는 flexor의 힘 줄 부상; 후 운동 사용에 반환에 대 한 경비 예 후를 설명 한다 다시 부상 발생에 2 년 이내 최대 말의 67%4신중 하 게 취급 합니다. 재생 의학 도전 전통적인 치료 조건에 새로운 대안을 제공 합니다. 자가 줄기 세포 치료 몇 가지 고무적인 결과5,6 생산 하지만 조직 컬렉션, 지연 처리/프로그래밍으로 인해 셀, 행정과의 영향와 관련 된 병 적 상태에 의해 제한 되는 줄기의 속성 (예: 연령) 환자의 건강 상태7,8세포. 이러한 제한은 상용 해서도 수용자 줄기 세포를 조사 근거를 제공 합니다. 그들은 윤리적 문제 및 기형종의 배아 줄기 세포와 관련 된 위험을 회피 하기 때문에 태아 adnexa 파생 셀 매력적인 후보자 이다. 태아 adnexa 가운데 탯 매트릭스 (UCM)와 튼의 젤리 라는 풍부 하 고 수집 하기 쉬운입니다.

셀 소스에 stemness 강화 allogenic 재생 의학을 위한 세포 은행 확립에 필수적 이다. 기능 관점에서 stemness 자체 갱신 및 다중 계보 분화9에 대 한 가능성으로 정의할 수 있습니다. Stemness의 증거 분석, 유전자 마커 Oct4, Sox2, 및 Nanog9의 식 함께 확산 및 감 별 법에 의존합니다. 한 전략 stemness 향상을 void 필러와 강화 확산 및 UCM MSCs의 차별화로 생체 재료의 사용에 의존 합니다. 이 방법은 유도 만능 세포로 성숙 세포를 재 설 정할 transcriptional 요인의 조작에 관한 우려를 제거 합니다. 생체 줄기 세포에 대 한 잠재적인 운반대로 간주, 중 키토 산 생체 적합성과 분해성10매력적 이다. 이 자연 aminopolysaccharide 카이, 두 번째 가장 풍부한 천연 다 당 류 주로 조개10의 subproduct로 얻은 알칼리 성 deacetylation에 의해 형성 된다. 우리 이전에 MSCs 및 키토 산 건설 기계 사이의 상호 작용을 조사 하 고 spheroids11,12,13,,1415, 의 형성 관찰 16. 우리는 또한 키토 산 행렬12,13,14,15,,1617, chondrogenesis의 우수성에 보고 18. 최근에, 2 개의 독립적인 연구 지방 조직에 의해 spheroids 형성을 설명 하 고 태 반 조직 유래 키토 산 영화19,20에 경작 하는 MSCs. Spheroids의이 형성 뿐만 아니라 stemness, 강화 하지만 또한 생체 내에 이식20후 줄기 세포의 보존을 향상.

정도와 병 종에 걸쳐 tendinopathy의 tendinopathies의 병 태 생리학을 연구 하 고 줄기 세포 주사 등 새로운 치료법을 테스트 실험 모델의 개발 라는 메시지가 있다. 말, 콜라 유도 염증이 생길 수도 힘 줄 수리21에서 MSCs를 사용 하 여 효능을 입증 하는 일반적인 모델입니다. 이 접근의 관련성, 주사는 급성 염증 성 변화를 일으킬, 임상 tendinopathies 만성에서 일반적으로 발생 하는 반면 팽팽하게22,23. 또한, 힘 줄 질환의 화학 유도 치료 응답을 유도 하 고 임상의 경우22,23에 장애인된 치유 과정을 복제 하지 않습니다. 표면 디지털 flexor의 힘 줄의 세그먼트의 절단 말24에 염증이 생길 수도의 외과 모델로 설명 하고있다. 더 최근에, 최소로 침략 접근 표면 디지털 flexor의 힘 줄25의 중앙 코어를 외상 성 손상 제한 하 사용 되었다. 외과 모델 자연 힘 줄 질환으로 이어질 수 있는 손상 만든25의 범위 내에서 재현성 부족 경향이 피로 메커니즘을 시뮬레이션 하지 않습니다. 모델, 병 적 상태 및 힘 줄의 말 모델와 관련 된 비용에 질병 vivo에서 새로운 치료의 평가 대 한 첫 번째 단계로 설치류 모델에 대 한 관심을 정당화 하는 추가 제한이 있습니다.

설치류의 실험 모델의 주요 장점 중 하나 비용과 간 개별 가변성을 제어 하는 기능으로 이루어져 있다. 설치류 그들의 빠른 성장 속도로 인해 다양 한 생리 적인 요인에 관하여 표준화 수 고 상대적으로 짧은 수명을, 변이의 소스를 제한 및 그러므로 차이 감지 하는 데 필요한 동물의 수를 감소. 설치류에 힘 줄 질환을 유도 하는 전략 부분 힘 줄 결함21의 외과 생성 뿐만 아니라 화학 유도에 의존 했습니다. 외과 모델 자연 tendinopathies 화학 모델 보다 더 나은 시뮬레이션 수 있습니다 하지만 더 높은 사망률 및 손상 된 힘 줄의 치명적인 오류가 발생할 수 있습니다. 그 점에서 쥐 조직 치유의 평가 촉진 함으로써 더 큰 결함의 생성을 허용 하는 그들의 크기가이 모델에 대 한 마우스 보다 더 나은 후보를 보인다. 4 주요 힘 줄 그룹에서 tendinopathies의 실험 연구에서 사용 된 Sprague-Dawley 쥐: 회전자, flexor, 아 킬 레 스, 그리고 슬 개 골 심 줄26. 이 중, 슬 개 골 힘 줄을 포함 하는 모델은이 힘 줄의 더 큰 크기와27에 액세스의 용이성 때문에 특히. 슬 개 골 힘 줄 tibial tuberosity에 quadriceps 근육을 연결합니다. 이 신 근 메커니즘 내에서 슬 개 골은 sesamoid 뼈는 허벅지 근육의 동작을 지시 하 고 슬 개 골 힘 줄의 인접 정도 구분. 슬 개 골 힘 줄의 인접 하 고 말 초 범위에서 뼈 앵커의 존재 biomechanical 테스트를 지원합니다. 일반적으로 슬 개 골 힘 줄을 포함 하는 모델 contralateral 그대로 힘 줄 컨트롤28,29봉사와 일방적인 외과 결점에 의존 합니다. 가장 일반적인 슬 개 골 힘 줄 결함 모델에서는 contralateral 슬 개 골 힘 줄은 그대로 동안 tibial tuberosity의 삽입에 슬 개 골의 원심 꼭대기에서 슬 개 골 힘 줄의 중앙 부분 (폭에서 1 m m)를 절 개 합니다. 측정 결과의 조직학, 비-파괴적인 biomechanical 테스트 또는 biomechanical 테스트 실패, 초음파 영상, ex vivo 형광 이미징, 총 관찰, 그리고 기능 테스트28,30 포함 ,31. 일방적인 모델 같은 동물 내에서 유사한 상해의 보수 관리와 제안 된 치료의 비교를 허용 하지 않습니다. 마찬가지로, 여러 치료 간의 비교는 별도 동물을 필요합니다. 양자 모델 간 개별 변이 제거 하 고 연구32에 필요한 동물의 수를 줄일 것 이다. 그러나, 양자 상해 사망률을 증가 시킬 수 있습니다 그리고 양자 lameness 치료 평가 방해 수 있습니다. 몇 가지 연구 짧게 페리 요원 관리 보다는 오히려 치료의 효과 모델33,34의 병 적에 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 쥐 하지만 초점에의 사용을 보고합니다.

이 연구의 장기 목표는 UCM MSCs allogenic 이식에 운명의 stemness 그리고 vivo에서 생존을 개량 하는 전략을 개발 하는 것입니다. 이 목표를 달성 하기 위해 우리 최근 키토 산 영화와 인큐베이션 hypoxic 환경35아래에 spheroids의 형성에 의해 UCM MSCs의 향상 된 stemness을 보고 있다. 이러한 생체 외에서 속성은 관련 된 슬 개 골 힘 줄 결함 조건된 UCM으로 치료의 향상 된 biomechanical 속성-MSCs. 이러한 결과에 기반, 쥐 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 모델 후보 테스트에 적합 한 것 힘 줄 부상36에 대 한 치료입니다. 연구의 목적은 여기 격리 및 특성화 UCM MSCs의 줄기 세포, 창조 및 양측 슬 개 골 힘 줄 결함, 그리고 수술 후의 치료에 대 한 생물 학적 전달 시스템의 준비에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 하는 보고 복구 및 조직 결함 내 치유의 평가 합니다.

프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 웨스턴 대학 보건 과학에 의해 승인 되었습니다.

1. 격리와 말 탯 매트릭스에서 MSCs의 확장

  1. 태 반 (임신) 성인 마 레에서 foaling 관찰 후을 aseptically 탯 태에서 분리 합니다. 탯에에서 계속 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 1% 페니실린-스 (P/S)와 4 ° C에서 전송 하는 동안 처리까지.
  2. 실내 온도 PBS 1%로 두 번 탯 워시 50ml 튜브에 P/S. 150 m m와 1 %P / S 50 mL 튜브 2 또는 세 번까지 혈액의 대부분은 밖으로 씻어 서 실내 온도 PBS에 세척에 2 인치 길이의 조각으로 탯 섹션.
  3. 잘라 배를 경도 탯. 2 동맥, 정 맥, 그리고 집게와가 위를 사용 하 여 코드에서 allantoic 줄기를 포함 하 여, 혈관을 제거. 메스로 근 근 의해 150 mm 접시에 젤리 같은 매트릭스 주변 혈관은 탯 매트릭스 (왓슨의 젤리)를 수집 하 고 정밀한 조각으로 젤리를 말하다.
  4. PBS에서 0.1% (w/v) 콜라 유형 IA 솔루션의 15 mL 50 mL 튜브에 2-3 탯 조각 (약 12-15 g)에서 장소와 튼 젤리 해산 때까지 3-4 h 동안 부드러운 흔들어 37 ° C에서 품 어.
  5. 15 분 동안 300 x g에서 소화 조직 원심 하 고 상쾌한 발음. 1% 실내 온도 PBS의 15 mL에 소화 조직 resuspend P/S, pipetting으로 혼합, 5 분 동안 150 x g에서 원심 및 상쾌한 (세척)을 발음. 세척 두 번 더 반복 합니다.
  6. Resuspend 셀 1% 실내 온도 PBS의 15 mL에 세차 P/S, pipetting으로 혼합, 100 µ m 셀 스 트레이너, 5 분 동안 150 x g에서 원심 분리기와에 의해 변형 및 상쾌한 발음.
  7. 낮은 포도 당 Dulbecco의 혼합 하 여 배양 (CM) 준비 소 태아 혈 청 (FBS)와 1 %P 수정이 글의 중간 (LG-DMEM) / 미 여과 의해 매체를 소독.
  8. 37 ° C에 미리 데워 CM의 10 mL에 긴장된 셀 resuspend, pipetting으로 혼합, 25 cm2 조직 배양 플라스 크에 전송 및 습도 90%와 37.0 ° C에서 5% CO2 에서 품 어 변경 c M 매 3 일 마다 문화 문화 passaged 것 이다 때 70-80%의 합류를 도달할 때까지.
  9. 문화 통로를 플라스 크에서 CM을 발음 하 고 두 번, 실내 온도 PBS의 5 mL로 세척 하 고 0.25 %trypsin / ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 5 분 동안 37 ° C에서의 3 mL와 분리.
  10. 트립 신/EDTA 37.0 ° C에 미리 데워 CM의 6 mL로 중화 하 고, pipetting으로 혼합 하 고 15 mL 튜브, 5 분 동안 150 x g에서 원심 분리기로 전송 한 상쾌한 발음. Resuspend CM의 1 mL에 분리 된 셀, pipetting으로. Trypan 블루과 hemocytometer를 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다. 5, 000 셀/cm2, 25 cm2 조직 배양 플라스 크에 다시 시드해야 하 고 습도 90%와 37.0 ° C에서 5% CO2 에서 품 어

2. 키토 산 영화에 교양 UCM MSCs와 Spheroids의 준비

  1. 1% (w/v) 키토 산 용액 100 mL를 준비 하려면 99 ml의 증류수 (dH2O), 키토 산의 1 g을 추가 하 고는 자력으로 잘 혼합 합니다.
  2. 빙 초 산의 670 µ L을 추가 하 고 혼합 키토 산 녹이 고 점성 된다 때까지 계속. 이 일반적으로 3-4 시간 걸립니다.
  3. 12 음 조직 배양 플레이트의 각 음에 키토 산 솔루션의 500 µ L을 추가 하 고 접시 키토 산 솔루션을 균등 하 게 배포 하 고 모든 바닥 표면에 소용돌이.
  4. 층 류 24 h에 대 한 하룻밤 커버 없이 캐비닛에서 키토 산 코팅 솔루션 접시 건조. 건조 되 면, 박막 형성 하 격판덮개를 준수 합니다.
  5. 각 우물에 0.5 N 수산화 나트륨 (NaOH) 용액 1 mL를 추가 하 여 키토 산 영화를 중화 하 고 실 온에서 2 h에 품 어. 각 우물에서 NaOH를 발음 하 고 각각을 씻어 세 번 dH2O의 1 mL와 함께 잘. 각 세척 한 번 70% 에탄올 (EtOH)의 1 mL와 함께 잘.
  6. 키토 산 영화를 소독, 층 류 캐비닛에 70 %EtOH 각 잘하고 품 어의 1 mL을 하룻밤 추가 합니다. 다음 날에 각 우물에서 나머지 EtOH를 발음. 각 세척 살 균 PBS의 1 mL 세 번 잘. 키토 산 필름 층 류 커버 없이 하룻밤 캐비닛 아래 자외선으로 소독.
  7. UCM MSCs의 양식 spheroids, 씨앗 확장 5000 셀/cm2, 각 잘으로 셀 passaged 고 습도 90%와 37.0 ° C에서 5% CO2 에서 품 어
    참고: 셀 수 있는 알을 품을 산소 또는 normoxia, 탐정의 관심에 따라.

3. 표면 마커 Cytometry 통해 분석의 표현

  1. 단일 세포 현 탁 액의 준비
    1. 표준 플레이트
      1. 각 우물에서 매체를 제거 하 고 실내 온도 PBS로 두번 세척.
      2. 실 온에서 5-10 분에 대 한 12-잘 접시의 각 음에 셀 분리 시 약의 500 µ L로 세포를 분리 합니다.
      3. 부 화, 후 각 우물에 버퍼 (PBS 0.5 %BSA 포함) 얼룩의 1 ml을 추가 하 고 셀을 분리를 pipetting으로 혼합.
      4. 세포 현 탁 액 15 mL 원뿔 튜브와 5 분 동안 150 x g에서 원심 분리기로 전송 합니다.
    2. 키토 산 판
      1. 모든 spheroids는 피 펫을 사용 하 여 1000 µ L 팁 발음 매체에 의해 수집 합니다. 15 mL 원뿔 튜브에 수집 된 매체를 전송. 매체를 수집, 후 1 mL PBS의 추가 의해 잘 세척 하 고 동일한 15 mL 원뿔 튜브에 씻어 PBS를 전송 합니다.
      2. 5 분 동안 150 x g에서 spheroids 원심 고 상쾌한을 제거 합니다.
      3. 셀 분리 시 약 (예, accutase)의 500 µ L을 추가 하 고 실 온에서 5-10 분 동안 품 어. Pipetting을 사용 하 여 1 mL 팁 spheroids 해리는 더 이상 표시 될 때까지 혼합.
      4. 단일 셀 펜션과 5 분 동안 150 x g에서 원심 분리기로 얼룩 버퍼의 1 mL를 추가 합니다.
  2. 셀을 세척
    1. 상쾌한 원뿔 튜브에서 제거 하 고 다시 감기 버퍼 얼룩의 3 mL에 셀을 일시 중단. 이 단계에서 실험을 통해 아이스 셀을 계속.
    2. 5 분 (세척)에 대 한 300 x g에서 원심.
    3. 두 번 씻는 다.
  3. 세포를 얼룩이 지기
    1. 5 분 x 300g에 centrifuge 고 상쾌한을 제거 합니다.
    2. Trypan 블루와 hemocytometer를 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다. 다시 일시 중단 1 x 106 셀 50 µ L 차단 (PBS 포함 10% 말 혈 청)를 버퍼링 하 고 얼음에 30 분 동안 품 어.
    3. 얼음에 1 시간에 대 한 빛에서 보호 품 어 다음 10 µ L fluorescein isothiocyanate (FITC) 활용 된 항 체 (CD44, CD90, CD105, CD34, 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (MHC) 종류 II, 또는 각 항 체 isotype 제어) 및 버퍼, 얼룩의 40 µ L를 추가 합니다.
    4. 감기 버퍼 얼룩의 3 개 mL를 추가 하 고 혼합, 5 분, 300 x g에서 원심 상쾌한 (세척)을 발음.
    5. 두 번 세척을 반복 합니다.
    6. 다시 버퍼를 얼룩이 지기의 0.5 mL에 셀 펠 릿을 일시 중단
    7. 7-AAD (생존 염료)의 5 µ L을 추가 하 고 얼음에 30 분 동안 품 어
    8. 교류 cytometer에 의해 스테인드 세포 샘플을 분석 합니다. 그들의 작은 SSC와 FSC, 파편을 제외 하 고 7-AAD의 낮은 통풍 관으로 가능한 셀을 식별 합니다. 플롯 FL1 및 FL2에는 y와 x-축, 각각. Isotype 제어를 사용 하 여 대각선 위에 게이트를 만들. 지역에 있는 긍정적으로 얼룩진된 세포의 백분율을 측정 합니다. 적어도 20000 이벤트/샘플 (보충 그림 1)을 계산 합니다.
    9. 실행 가능한 셀 및 자동-형광, 게이팅 하 여 항 체로 얼룩진 셀의 비율 측정 하 고 세포 isotype 제어와 스테인드의 백분율을 뺍니다.

4. 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 모델 쥐에서

  1. Sprague Dawley 쥐 (성인 남성, 4-5 개월, 몸 무게 350-375 g)을 선택 합니다. 이 모델에 사용 하는 쥐의 비교적 큰 크기 note
  2. Anesthetize 고 2 L/분 100% 산소에서 8 %sevoflurane 쥐 핀치 발가락 반사 유도 실에서의 실종까지 마스크를 통해 전달 하는 인공 눈 윤활제를 적용 합니다.
  3. 선제 무 통으로 Meloxicam (1 mg/kg)의 근육 주사를 관리 합니다.
  4. 따뜻한 물으로 채워지고 피부 부상을 방지 하면서 체온과 위치를 유지 하기 위해 천으로 덮여 두 0.5 L 물 병 사이 쥐를 놓습니다. 테이블에 각 말단을 테이프. 저체온증의 위험을 줄이기 위해 버블 랩 (그림 1)와 함께 시체를 커버.
  5. 마 취 5 %sevoflurane 원뿔, 물 난방 패드에 지 recumbency에 동물을 통해 1 L 100% 산소 혼합물에의 지속적인 흐름을 유지 합니다.
  6. 피부 외상을 방지 하려면 수술 사이트를 클립 하지 않습니다. 대신, 두 stifles 이상 머리 제거 크림을 적용 합니다. 혀 억압 물을 사용 하 여 크림 및 머리 제거.
  7. 수술 부위의 액체 digluconate 스크럽, 스크럽 하 고 3 번 70% 에탄올으로 씻어.
  8. 피부는 억압의 craniomedial 측면에 인접 하 원심 방향에서 살 균 #15 메스 블레이드와 incise. 약 1 cm 수준, 슬 개 골의 근 위 절 개를 시작 하 고 약 5 mm tibial 결 절에 원심 확장.
  9. #15 메스 블레이드와 기본 피하 조직을 확보 하 여 슬 개 골 힘 줄 노출에 피부를 반영 합니다.
  10. #15 메스 블레이드를 사용 하 여 소비 세 각 슬 개 골 힘 줄 (1 m m)의 중앙 세 번째 슬 개 골의 원심 부분에서 tibial tuberosity에.
    1. 각 사지 (그림 2)에서 결함의 크기를 표준화 하는 템플릿으로 힘 줄에 대해 0.99 m m 직경 Kirschner 와이어를 맞춥니다.
    2. 힘 줄 (그림 3)의 중앙 부분을 #15 메스 블레이드와 Kirschner 와이어의 각 측에 2 전체 두께 절 개를 확인 합니다. 정밀한 아이리스가 위 (그림 4)와 함께 중앙 섹션 proximally 고 distally resect.
    3. 억압의 근 막을 닫기 전에 5.5에 설명 된 대로 적절 한 치료 그룹에 대 한 응고 (혼합된 셀 펜션과 ACP)를 삽입 합니다. 십자 패턴으로 근 막과 피부 패턴 5-0 polyglactin 910 봉합 (그림 5)를 사용 하 여 피부를 닫습니다.
  11. Contralateral 억압에서 절차를 반복 합니다.
    참고: 하나의 결함 치료 (줄기 세포 chitosan에 조건 또는 표준 접시에 배양) 무작위로 할당 됩니다. Contralateral 결함은 내부 통제 역할을 빈 남아 있습니다.
  12. 수술 후 관리 enrofloxacin의 4 정제 (2 mg/태블릿, 구두, 하루에 한 번씩) meloxicam의 태블릿 (2 mg/태블릿, 구두, 하루에 한 번씩) 7 일 동안. 이 복용량 실험 동물 수 의사에 의해 권장 되었고 IACUC 프로토콜에 승인.

5. 슬 개 골 힘 줄 결함 내에서 MSCs의 배달

  1. 핀치-발가락 반사 유도 실에서의 실종까지 마스크를 통해 전달 하는 2 L/분 100% 산소에서 8 %sevoflurane 슬 개 골 힘 줄 결함 생성에 사용 되지 않는 건강 한 쥐 anesthetize
  2. 수집 5 mL 혈액 심장 펑크에 의해 마 취 Sprague-Dawley 쥐 (성인 남성, 4-5 개월, 몸 무게 350-375 g)에서 5 mL 주사기에 산 시트르산 포도 당 (5:1 v/v)의 1 mL를 포함 하는 20 G 바늘.
  3. Pentobarbital (100 mg/kg), 같은 마 취에서의 intracardial 주입 하 여 심장 펑크와 혈액 수집 후 쥐를 안락사.
  4. 실 온에서 15 분 동안 350 x g에서 샘플 원심 상쾌한 전송 및 사용까지 aliquots (120 µ L 각)-20 ° C에서 저장.
  5. 생체 내에 이식 직전 위의 약 수를 녹여 섞어 0.5 x 10와 20 µ L 트립 신/EDTA를 사용 하 여 표준 격판덮개에서 분리 (1.9 또는 3.1.2.1)에서6 MSCs 또는 (PBS/매체)와 홍 조에 의해 키토 산 판에서 수집.
  6. 해 동된 플라즈마는 플라즈마를 활성화 하 고 혈전의 형성을 유발 하 96 잘 접시의 우물에서의 나머지 100 µ L를 6 µ L 10% 칼슘 염화 물 (CaCl2)의 추가 (바른된 플라즈마 활성화: ACP).
  7. 세포 현 탁 액 (20 µ L) 혼합 및 ACP (100 µ L) 형태로 응고 (그림 6). 장소는 억압의 근 막 닫기 전에 만든 슬 개 골 힘 줄 결함 내에서 응고 (단계 4.10.3 참조).

6. 기능적 결과

  1. 통증, 쥐 얼굴을 찡 그리기 규모 (RGS)37,38 에 기반 하 고 이식 사이트 위에 붓기의 표시를 위해 하루에 두 번 쥐를 모니터링 합니다.
    참고: 채 점 시스템 (0-6) 보 행 기능 지원 앞 발 타임된 뒷 다리 서 포함 하 여 3 활동에 따라 (0-3)를 평가 하기 위해 개발 되었습니다, 그리고 남의 뒷 다리 서 (0-2), 그리고 17 cm 플라스틱 케이지 벽 (0-1) (등반 능력을 초과 표 1)입니다.
  2. 아침에 각 시간 점의 평균 점수를 계산 하기 위해 저녁에 2 개의 뒷 다리 서 활동에 대 한 쥐를 평가.
  3. 성공적으로 도달 상단 두 뒷 다리 사지와 17 cm 플라스틱 케이지 벽을 등반 하는 기능에 대 한 쥐를 평가 합니다.

7. 총 모양 및 슬 개 골 힘 줄의 Histopathology

  1. 7 일 (염증 평가)에 쥐를 안락사 또는 (평가 조직 치유)을 28 일 pentobarbital 8 %sevoflurane 2 L 100% 산소 마스크를 통해 전달 마 취 (100 mg/kg)의 intracardial 주입 하 여 치료를 게시.
  2. 안락사 후 슬 개 골-힘 줄-경골 tuberosity 단위 메스와가 위를 걷. 부드러운 조직 및 슬 개 골 힘 줄 제외한 억압, 주위 인 대를 제거 합니다.
  3. 총 모양 및 힘 줄 (그림 7)의 농축에 대 한 각 견본을 검사 합니다.
  4. 힘 줄의 인접 하 고 측면 측면에 5.0 Polydioxanone의 외과 의사 매듭을 배치 하 여 표본 동양. 각 표본 10% 중립 버퍼링 된 포 르 말린 용액에 고정 하 고 각 힘 줄의 중간 부분에서 가로 섹션 (5 µ m).
  5. 되며 고 오신, Masson의 Trichrome 표준 프로토콜에 따라 얼룩을 사용 하 여 섹션을 얼룩.
  6. 염증 등 병 적인 변화 뿐 아니라 결함, 내 혈의 존재를 감지 하는 섹션을 검사 합니다.
  7. 콜라겐 학년, 신생, 및 연골 형성 (표 2)39의 정도에 따라 이전 게시 된 채 점 시스템을 사용 하 여 섹션의 조직학 점수를 평가 합니다.

결과

현재 연구에서 결과 ± SD (표준 편차)를 의미 하는 대로 표시 됩니다. 셀 6 mares의 탯에서 고립 되었다 및 표준 또는 키토 산 컨디셔닝에서 각 세포 표면 마커를 표현 하는 격리 된 셀 라인의 비율 비교 했다 프리드먼 테스트와 함께 비패라메트릭 분산 분석으로 반복 측정 한다입니다. 힘 줄 결함 모델 생성 8 쥐 7 일 수술 후 평가 위해 사용 되었다 및 12 쥐 28 일 평가 위해 사용...

토론

우리 결국 말에 자연 tendinopathies의 관리에서 후보 접근을 테스트 하는 것 때문에 말 셀이이 프로젝트에 대 한 선정 됐다. 실제로, 말에 힘 줄 부상 있습니다 말 표면 디지털 flexor 및 인간41킬 사이 생물 학적 유사성 때문에 자연 모델 남자에서 tendinopathy의 매력. 세포 표면 마커 CD44, CD90, CD105, CD34와 MHC II immunophenotyping 세포 치료42에 대 한 국제 학회에서 권장 하는 ?...

공개

저자는 공개 충돌의 관심 있다.

감사의 말

저자는 데이터의 그녀의 통계 분석에 대 한 수, 박사, 인정 하 고 싶습니다. 저자는 또한에 대 한 그녀의 조언을 마 취 박사 McClure, DVM, 박사 DACLAM, 감사 하 고 통증 관리 프로토콜 연구에 사용. 이 프로젝트는 연구 (12678v)와 USDA 섹션 1433 자금 (2090) 부사장의 웨스턴 대학 보건 과학 사무실에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
PBS 10xHycloneSH30258.01Consumable
Collagenase type IAWorthingtonLS004197Consumable
DMEM low glucoseHycloneSH30021.FSConsumable
Fetal Bovine SerumHycloneSH30910.03Consumable
Penicillin/Streptomycin 100xHycloneSV30010Consumable
Trypsin 0.25%HycloneSH30042.01Consumable
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104Consumable
Trypan blueHycloneSV30084.01Consumable
Dimethyl SulfoxideSigmaD2650Consumable
ChitosanSigmaC3646Consumable
Sodium HydroxideSigmaS8045Consumable
Bovine Serum AlbuminHycloneSH30574.01Consumable
Round bottom polystyrene tubeCorning149591AConsumable
Mouse anti-horse CD44 (FITC)AbD serotecMCA1082FConsumable
Mouse anti-rat CD90 (FITC)AbD serotecMCA47FTConsumable
Mouse anti-horse MHC-II (FITC)AbD serotecMCA1085FConsumable
Mouse IgG1 (FITC) - Isotype ControlAbD serotecMCA928FConsumable
Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC)abcamab11415Consumable
Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Controlabcamab91356Consumable
Mouse anti-human CD34 (FITC)BDBDB560942Consumable
Mouse IdG1 kappa (FITC)BDBDB555748Consumable
7-AADBDBDB559925Consumable
BD Accuri C6 Flow CytometerBDEquipment
Vacutainer 5 mLMed Vet InternationalRED5.0Consumable
Acid-citrate-dextroseSigmaC3821Consumable
Calcium ChlorideSigmaC5670Consumable
SevofluraneJD Medical60307-320-25Consumable
RatsCharles RiverStrain code: 400Experimental animal
Rat surgical kitHarvard apparatus728942Equipment
Surgical Blade #15MEDLINEMDS15115Consumable
Rat MD's Baytril (2 mg/Tablet),
Rimadyl (2 mg/Tablet)		Bio ServF06801Consumable
Polyglactin 910, 5-0EthiconJ436GConsumable
Eosin alchol shandonThermo scientific6766007Consumable
Harris HematoxylinThermo scientific143907Consumable

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