Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

העשרת של חיידקי lipoproteins באמצעות שלב ללא יונית חומרים פעילי שטח למחיצות בשיטת מתואר שימוש ישיר במבחני TLR או יישומים אחרים. צעדים נוספים מפורטים להתכונן lipopeptides tryptic N-מסוף אפיון מבניים באמצעות ספקטרומטר מסה.

Abstract

Lipoproteins הם המרכיבים החשובים של המעטפה תא החיידק חזק מפעילי בתרבית של מערכת החיסון המולדת. למרות חשיבות שלהם תא פיזיולוגיה ואימונולוגיה, הרבה נשאר to be גילה על הרומן ליפופרוטאין טפסים, איך הם מסונתז וכן השפעת צורות שונות על חסינות המארח. כדי לאפשר מחקרים יסודיים lipoproteins, פרוטוקול זה מתאר שיטה של ליפופרוטאין חיידקי העשרה, הכנה של lipopeptides tryptic N-מסוף קביעת מבניים על ידי לייזר בסיוע מטריקס desorption יינון-שעת הטיסה ספקטרומטר מסה (MALDI-TOF MS). הרחבה על שלב טריטון X-114 הוקמה למחיצות בשיטת החילוץ ליפופרוטאין והעשרה של קרום התא חיידקי, הפרוטוקול כוללת צעדים נוספים כדי להסיר ליפופרוטאין שאינם מזהמים, ליפופרוטאין התשואה הגדלת ו טוהר. מאז lipoproteins משמשים בדרך כלל במבחני קולטן דמוי-אגרה (TLR), זה קריטי קודם לאפיין את מבנה N-מסוף על ידי גב' MALDI-TOF שעל זה, שיטה מוצג לבודד פפטידים הידרופובי מרוכז מועשר ב- N-מסוף lipopeptides מתאימים לניתוח ישיר מאת Lipoproteins MS/גב' MALDI-TOF המופרדים על ידי נתרן Dodecyl סולפט פולי-אקרילאמיד בג'ל (מרחביות-עמוד) מועברים קרום ניטרוצלולוזה, מתעכל בחיי עיר עם טריפסין, שטף ברצף כדי להסיר פפטידים tryptic הקוטב, סוף סוף eluted עם הכלורופורם-מתנול. כאשר משולב עם MS של פפטידים trypsinized קוטבי יותר מפתרונות לשטוף, שיטה זו מספקת את היכולת לזהות את ליפופרוטאין והן לאפיין את קצה אמיני בניסוי יחיד. נתרן מכוונת adduct היווצרות יכול גם להיות מועסק ככלי לקידום ספקטרה פיצול מבנית מקיף יותר. בסופו של דבר, העשרה של lipoproteins והנחישות של מבנים N-מסוף שלהם יאפשר מחקרים מקיפים יותר על מחלקה זו בכל מקום של חלבונים חיידקיים.

Introduction

חיידקי lipoproteins מאופיינים שנשמרת N-מסוף השומנים-השתנה ציסטאין זה מעגן את התחום חלבון הכדוריים השטח קרום התא. הם אוניברסלית מופצים בחיידקים, המהווים 2-5% של כל הגנים סלולר בתוך הגנום טיפוסי1. Lipoproteins לשחק תפקידים חיוניים במגוון רחב של תהליכים תאיים, לרבות ספיגת התזונתי, אותות, הרכבה של מתחמי חלבון, ושמירה על התא מעטפת המבנית2. של חיידקים פתוגניים, lipoproteins לשמש התקפה אלימה-גורמים-3,-4. במהלך זיהום, הכרה של N-מסוף lipopeptides על ידי קולטן דמוי-אגרה (TLR) 2 מסית תגובה חיסונית מולדת להסרת פתוגנים פולשים. בהתאם למצב acylation N-מסוף, lipoproteins מזוהים בדרך כלל על ידי קומפלקסים heterodimeric TLR2 חלופי. TLR2-TLR1 מזהה lipopeptides N-acylated, בעוד TLR2-TLR6 איגודים ליפופפטיד חינם α-אמינו טרמיני (termini). פעם מאוגדים, המסלולים איתות להתכנס לזירוז הפרשת proinflammatory-ציטוקינים-3,-4.

בעבר חשבו כי lipoproteins של חיידקים גראם חיוביים היו diacylated, ואלה מתוך חיידקים גראם שליליים היו triacylated, שונות היעדרות או נוכחות של חומצת שומן מקושרים אמיד על השאריות ציסטאין שנשמרת N-מסוף. הנחה זו נתמכה על ידי חוסר רצף orthologs בתוך הגנום גראם חיוביים כדי Lnt, טרנספראז גראם שליליים N-acyl השומן צורות lipoproteins triacylated5. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה חשפו ליפופרוטאין triacylation ב Firmicutes גראם חיוביים זה חוסר lnt, וכן שלושה מבנים ליפופרוטאין N-מסוף הרומן, כינה את peptidyl, lyso ו- N -acetyl טפסים6,7 ,8. ממצאים אלה מעלים שאלות על טפסים אפשרי ובכל זאת-כדי--שיגלו ליפופרוטאין, לצד שאלות עקרוניות על איך נוצרים אלה lipoproteins הרומן, איזו מטרה פיזיולוגיים או יתרון צורות שונות להקנות. יתר על כן, הם מדגימים בבירור היכולת הנוכחית של גנומיקה לחזות המבנה ליפופרוטאין. ואכן, לאחרונה זוהו מחלקה הרומן של ליפופרוטאין N-acyl השומן transferases, שנקרא Lit, Enterococcus faecalis , Bacillus קובו שגורם lipoproteins lyso-טופס9. אפשרות זו מציינת את הצורך לאמת השפעול ליפופרוטאין מבנה, אשר יכול להיות מאתגר עקב ואופיים הידרופובי מאד מוגבלת שיטות הזמינות לאפיין את המבנה המולקולרי שלהם.

כדי להקל על מחקרים על ליפופרוטאין אינדוקציה של התגובה החיסונית מארח את, כמו גם נחישות מבניים N-מסוף, אנחנו הסתגלו מספר פרוטוקולים שתואר קודם לכן על מנת לטהר lipoproteins חיידקי ולהכין את N-מסוף tryptic lipopeptides לניתוח-MALDI-TOF MS6,10,11,12. Lipoproteins מועשרים באמצעות שלב X-114 טריטון (המכונה מעתה ואילך חומרים פעילי שטח או TX-114) הוקמה למחיצות בשיטת, עם אופטימיזציה להסיר ההרסנית הלא-lipoproteins ולהגדיל את התשואה ליפופרוטאין. Lipoproteins אלו מתאימים לשימוש ישיר במבחני TLR או לטיהור עוד יותר על ידי עמודים מרחביות. עבור MALDI-TOF MS, העברה של ליפופרוטאינים ניטרוצלולוזה ממברנה מספק לפיגום לעיכול יעיל בחיי עיר טריפסין, שטיפה, עוקבות • תנאי מהמשטח ממברנה, וכתוצאה מכך מאוד מטוהר lipopeptides N-מסוף. ניטרוצלולוזה הוכח כדי להקל על הטיפול מדגם ולשפר את רצף כיסוי מתאים מאוד הידרופובי פפטידים ממברנלי אינטגרלי חלבונים13,14, וכן lipoproteins9,10 . השיטה יש יתרון נוסף של fractionating פפטידים בהתבסס על קוטביות, כך ניתן לנתח פתרונות ביניים שטיפת לזיהוי החלבון בוודאות גבוהה בד בבד עם N-מסוף קביעת מבניים בניסוי יחיד . פרוטוקול זה ייחודי נתרן מכוונת תכונות adduct צורה כדי לקדם את האב יון פיצול לכיוון dehydroalanyl יונים במהלך MS/MS, בסיוע במשימה מבנית של המדינה - acylation N. קצה אמיני הוא שני ביותר משתנה מפתח התכונה הקשורים לזיהוי TLR של lipoproteins. יחדיו, פרוטוקול זה אפשרה מחקרים אינטנסיביים לשחזור על lipoproteins, עם השלבים בודדים של טיהור ונחישות מבניים על-ידי MS MALDI-TOF להתאים בקלות בהתאם המטרה הכוללת של הניסוי.

Protocol

1. התא צמיחה פירוק

  1. לגדול חיידקים ציר סויה tryptic 15 mL (TSB) או מדיה עשירים דומה לשלב מעריכי מאוחר (OD600 של 1.0-1.5). קציר תאים על ידי צנטריפוגה, לשטוף פעם עם באגירה טריס תמיסת מלח/EDTA tbse (ב), להמשיך עם פרוטוקול או להקפיא עד השימוש.
    הערה: tbse ב: 20 מ מ טריס-הידרוכלוריד (HCl), pH 8.0, 130 מ מ נתרן כלורי (NaCl), חומצה ethylenediaminetetraacetic 5 מ מ (EDTA)). ליפופרוטאין ביטוי ושינוי יכול להיות מושפע על ידי תנאי הגידול (למשל חומציות, מליחות, צמיחה מדיה) ו- שלב הצמיחה15. צמיחת תאים וניתן לשנותם לפי הצורך, אבל 15-mL של תאים מומלץ תכשיר יחיד של lipoproteins כפי ביומסה עודף יכול להקטין את התשואה ליפופרוטאין. הכנה 15-mL אחת מניבה בדרך כלל מספיק דוגמת עבור טעינה אופטימלית של ~ 2-4 נתיבים על ג'ל מיני מרחביות-דף רגיל.
  2. Resuspend תאים μL 800 tbse עם 1 מ phenylmethyl sulfonyl פלואוריד (PMSF) ו ליזוזים 0.5 מ"ג/מ"ל. פתרון להעביר צינור microcentrifuge הליכי 2.0-mL עם פקקי בורג, o-ring, תקופת דגירה של 20 דקות ב 37 º C.
    הערה: מינים מסוימים אינם רגישים פירוק על ידי ליזוזים. צריך ישמש כתחליף אנזים lytic המתאים כדי לסייע פירוק.
  3. להוסיף ~ 800 μL 0.1 מ מ אסתטיים/סיליקה חרוזים הצינור, לשבש תאים ע י ניעור במהירות המרבית (7,000 סל ד) על מהמגן 5 מחזורים של 30 s כל אחד, עם 2 דקות לנוח על הקרח בין כל מחזור.
  4. צנטריפוגה מדגם ב 3000 g x עבור 5 דקות ב 4 ° C (על גלולה חרוזים ותאים רצופה). להעביר את תגובת שיקוע צינור 2.0-mL microcentrifuge ולשמור על קרח.
  5. להוסיף 200 μL tbse ב בגדר הנותרים ולחזור מהמגן מחזור נוסף. צנטריפוגה (כמפורט לעיל) ולשלב תגובת שיקוע עם תגובת שיקוע הקודם (צריך להיות הנפח הכולל של μL 800-1000).

2. העשרה של Lipoproteins מאת TX-114 שלב החלוקה למחיצות

  1. להשלים את תגובת שיקוע עם חומרים פעילי שטח TX-114 כדי ריכוז סופי של 2% (vol/כרך) על-ידי הוספת אמצעי שווה של 4% (vol/כרך) חומרים פעילי שטח ב- tbse ב קר כקרח, דגירה על קרח לשעה ערבוב על-ידי היפוך כל ~ 15 דקות.
    הערה: כאשר מקורר, תגובת שיקוע חומרים פעילי שטח יהיו miscible.
  2. להעביר את הצינור באמבט מים 37 ° C, תקופת דגירה של 10 דקות לגרום בשלב ההפרדה. Centrifuge הדגימה ב 10,000 g x 10 דקות על טמפרטורת החדר כדי לשמור על הפרדה דו-phasic.
  3. בעדינות פיפטה את השלב מימית עליון וזורקים. הוסף tbse ב קר כקרח לשלב חומרים פעילי שטח נמוכה יותר למלא את הצינור לאמצעי האחסון המקורי שלה ' ' היפוך ' כדי לערבב. דגירה על קרח למשך 10 דקות.
  4. להעביר את הצינור באמבט מים 37 ° C, תקופת דגירה של 10 דקות לגרום בשלב ההפרדה, לאחר מכן צנטריפוגה ב 10,000 g x 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. חזור על שלבים 2.3 2.4 פעם נוספת עבור סכום כולל של הפרדות צבע 3. להסיר את שלב מימית עליון וזורקים.
  6. הסר את צניפה של חלבונים זירז שנוצר במהלך עקירות (המופיעה בתחתית הצינורית), על ידי הוספת נפח 1 של tbse ב קר כקרח לשלב חומרים פעילי שטח. צנטריפוגה ב 4 ° C-g x 16,000 למשך 2 דקות הצניפה חלבונים לא מסיסים.
    הערה: מדגם צריכים להישאר חד-פאזי. אם שלב ההפרדה מתרחשת, מחדש להירגע מדגם, צנטריפוגה שוב. בגדר מורכב בדרך כלל של ליפופרוטאין שאינם מזהמים, אך ניתן להיעזר לצורך ניתוח נוסף.
  7. מיד להעביר את תגובת שיקוע צינור microcentrifuge 2.0-mL טריים המכילים 1250 μL של אצטון 100%. פיפטה למעלה ולמטה ביסודיות לשטוף את הדגימה מהקצה כפי שזה יהיה צמיגה. לערבב על-ידי היפוך, דגירה בין לילה ב-20 ° C, כדי לזרז את החלבון.
  8. Centrifuge המדגם-16,000 g x עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי הצניפה lipoproteins בתשומת לב הכיוון של הצינור. Lipoproteins יהוו סרט דק, לבן לאורך הקיר החיצוני של הצינור.
  9. רחץ גלולה פעמיים עם אצטון 100%. Decant אצטון ולאפשר הדגימה כדי אוויר יבש.
  10. הוסף 20-40 μL 10 מ מ טריס-HCl, pH 8.0 או תקן Laemmli מרחביות-דף לדוגמה מאגר16 ' resuspend באופן יסודי על-ידי pipetting למעלה ולמטה הקיר עם ליפופרוטאינים precipitated. לגרד את הצד של הצינור עם קצה פיפטה מכך lipoproteins.
    הערה: Lipoproteins יתמוסס לא במאגר טריס, אבל מעדיף ליצור השעיה.
    1. לאחסן lipoproteins ב-20 ° C עד השימוש.

3. מרחביות-דף Electroblotting, מכתים עם צבע מאכל פונסו S

  1. Lipoproteins שונים על ידי שימוש בשיטות הרגילות16עמודים מרחביות.
    הערה: האחוז אקרילאמיד ג'ל המתאים משתנה בהתאם את השימוש המיועד והגודל של lipoproteins. כאן, faecalis אי lipoproteins הופרדו מעל 10% ג'ל טריס-גליצין, בעוד 16.5% ג'ל טריס-tricine שימש את ליפופרוטאין e. coli קטנים ל"י/נ17.
  2. העברה ליפופרוטאינים קרום העברה ניטרוצלולוזה באמצעות הליך רגיל electroblotting.
    הערה: לבצע העברה חצי יבש באמצעות מרחביות מאגר פלוס 0.1% Bjerrum שייפר-נילסן-25 V. 1.3 אמא במשך 15 דקות18. לחלופין, ניתן להשתמש polyvinylidene difluoride (PVDF) ממברנה, אולם כפי שהוא יותר הידרופובי מאשר ניטרוצלולוזה, זה עשוי להפחית יעיל • תנאי של lipopeptides הידרופוביות של הקרום על צעדים מאוחר יותר.
  3. להעביר את הקרום ניטרוצלולוזה מיכל ולכסות עם צבע מאכל פונסו S פתרון (0.2% (w/v) צבע מאכל פונסו S בחומצה אצטית 5%). רוק בעדינות במשך 5 דקות או עד אדום-ורוד להקות גלויים.
  4. יוצקים את צבע מאכל פונסו S פתרון ולשטוף היטב את הקרום ניטרוצלולוזה עם dH2O כדי להסיר עודפי כתם.
    הערה: להקות שהוכתמו צבע מאכל פונסו destain במהירות. אם להקות נעלמים, חזור על התהליך מוכתמים.
  5. עם סכין גילוח נקי, לסלק את הלהקה הרצוי ואת העברת צינור microcentrifuge. לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ"ל של dH2O עד destain לגמרי את הלהקה.
    הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. חנות המקטע נכרת מכוסה מים ב-20 ° C עד השימוש.
  6. להעביר את המקטע על משטח נקי, עם סכין גילוח נקי, חותכים לקוביות רצועת ניטרוצלולוזה לחתיכות קטנות של 1 מ מ x 1 מ מ. לאסוף את השברים לתוך צינור microcentrifuge מחייב חלבון נמוכה 0.5-mL.
  7. לשטוף את החלקים פעמיים עם 0.5 מ"ל של טריות 50 מ"מ אמוניום ביקרבונט (NH4HCO3), pH 7.8 במים כיתה ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC).

4. tryptic עיכול, חילוץ ליפופפטיד ניטרוצלולוזה ממברנה, התצהיר אל היעד MALDI ולאחר קירור והקפאה

  1. Resuspend חתיכות ניטרוצלולוזה ב 20 μL של פתרון μg/mL 20 של טריפסין 50 מ"מ NH4HCO3, pH 7.8 במים כיתה HPLC. מערבולת לערבב, ואז לסובב בקצרה על מנת להבטיח כי כל החלקים מכוסים באופן מלא על-ידי הפתרון טריפסין. לכסות את המכסה צינור באמצעות סרט פרפין כדי למנוע אידוי, דגירה תקציר בן לילה ב 37 º C.
  2. ספין המדגם-16,000 g x עבור 30 s והסר הנוזל על-ידי pipetting.
    הערה: פעולה זו מסירה פפטידים הידרופילית trypsinized שבדק יכול להיות מאוחר יותר על-ידי MS MALDI-TOF לזיהוי החלבון.
  3. להוסיף 50 μL של 0.5% חומצה trifluoroacetic (TFA) במים כיתה HPLC. מערבולת לערבב, ואז לסובב את הדגימה בקצרה כדי להבטיח שכל החלקים מכוסים על-ידי הפתרון. תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הנוזל על ידי pipetting.
    התראה: TFA מזיק אם נשאף. לטפל בזהירות ולהשתמש בשכונה fume כימי. יש להימנע ממגע עם העור.
  4. חזור על שלב 4.3 עם 50 μL של 10% acetonitrile במים כיתה HPLC.
    התראה: Acetonitrile מזיק אם נשאף. לטפל בזהירות ולהשתמש בשכונה fume כימי. יש להימנע ממגע עם העור.
  5. חזור על שלב 4.3 עם 50 μL של 20% acetonitrile במים כיתה HPLC.
    הערה: פעולה זו מסירה כל פפטידים הידרופובי בינוני באופן רופף חייב את ניטרוצלולוזה.
  6. Elute את lipopeptides בחוזקה מאוגד, להוסיף 15 μL של 10 מ"ג/מ"ל טריים α-cyano-4-hydroxycinnamic חומצה (CHCA) מטריקס מומס כלורופורם-מתנול (2:1, וי/v), תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר עם vortexing לסירוגין.
    1. לחלופין, הוסף 15 μL כלורופורם מתנול elute lipopeptides ולערבב עם מטריקס במועד מאוחר יותר. מטריצות אחרים, כגון חומצה 2, 5-dihydroxybenzoic (DHB), צריך להיבדק חלופות CHCA כמו אם תוצאות לא מספקות מתקבלים על חיבור ליפופפטיד מסוים.
      התראה: כלורופורם והן מתנול מזיקים אם נשאף. לטפל בזהירות ולהשתמש בשכונה fume כימי. יש להימנע ממגע עם העור.
    2. אופציונלי: כדי לקדם את הנתרן adduct היווצרות, מוסף את הפתרון של CHCA ב כלורופורם-מתנול עם המימית סודיום ביקרבונט (NaHCO3) ריכוז סופי של 1 מ מ.
  7. ספין המדגם בקצרה. עם פיפטה, בזהירות להעביר את הנוזל צינור microcentrifuge החדש של איגוד חלבון נמוכה. פתרון זה יכיל את עיקר lipopeptides N-מסוף.
    הערה: ניטרוצלולוזה עשוי באופן חלקי או מלא להמיס הפתרון כלורופורם-מתנול. זה לא ישפיע באופן שלילי MS תוצאות, עשוי לשמש כשיטת חלופי להגברת ליפופפטיד החזרה. ממברנה PVDF יתמוסס לא באותו אופן.
  8. להפקיד μL 1 של lipopeptides eluted עם CHCA אל מטרה MALDI פלדה מלוטשת.
    הערה: הכלורופורם-מתנול יתפוגג במהירות, משאיר מאחורי מגובשת CHCA, lipopeptides ΜL 1 שני אופציונלי aliquot ניתן להפקיד על אותה נקודה כדי להגדיל את ריכוז לדוגמה. כלורופורם-מתנול עלול להתפשט באופן משמעותי לאחר ההצהרה על המטרה, ככזה, להקפיד להימנע מדגם ערבוב על המטרה. מומלץ להפקיד ולירות כתמים מרובים של כל דגימה.
  9. מיד להמשיך ספקטרומטר מסה. סרוק בכל התחומים של המקום עבור ליפופפטיד אות, במיוחד אם המקום מכיל שתי שכבות של המדגם, כפי השכבה השנייה עשויה לדחוף את lipopeptides בטבעת החיצונית של המקום.
    הערה: עוצמת לייזר ההתחלתי המומלץ הוא 25%, אבל ייתכן צורך להגדיל בעוצמה על רכישת אות לסכם מרובים ספקטרה (סריקות 20 או יותר) כדי להשיג יחס אות לרעש נאותה. כאן, ספקטרה נרכשו על מכשיר MALDI-תוף-תוף (ראה את הטבלה של חומרים) באמצעות שיטה מוגדר-המפעל מכשיר איתור יון חיובי המשקף על פני הטווח מ/z ' 700-3500 '. המכשיר היה מכויל בתערובת פפטיד tryptic אלבומין שור (BSA).

תוצאות

תיאור סכמטי של הפרוטוקול מסופק באיור1. השבר מועשרת ליפופרוטאין שחולצו מן Enterococcus faecalis בקרת האוויר 19433 על ידי TX-114 מוצג באיור2. לשם השוואה, מוצג גם התבנית סימון של השבר זירז חלבון. חלבונים מן השבר הזה שאושרו על-ידי MALDI-MS להיות מאוד שופע מזה?...

Discussion

פרוטוקול במסמך זה מתאר שני שלבים של ליפופרוטאין אפיון: העשרה על ידי TX-114 שלב קביעת חלוקה למחיצות ומבניים על-ידי MS MALDI-TOF. במהלך החילוץ TX-114, צנטריפוגה נוספים הסרת מזהמים חלבונים לזרז במהלך תהליך זה, ואחריו אצטון משקעים להניב lipoproteins מועשר. על ידי הגבלת היקף כל הכנה 15-mL שווה של תאים, מספר דגימות י...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

המחקר במעבדה מרדית נתמכה על ידי קרנות האתחול המסופקים על ידי המכללה אברלי של המדע (אוניברסיטת המדינה של פנסילבניה). אנו מודים ד ר טטיאנה Laremore על גישה לציוד פן סטייט פרוטאומיקס, מסה ספקטרומטר הליבה מתקן, אוניברסיטת פארק, פנסילבניה, בו בוצעו ניתוחים spectrometric המוני וייעוץ טכני מומחה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Materials
0.01 mm Zirconia/silica beadsBioSpec Products110791012
Acetic acidEMDAX0073-9
AcetoneEMDAX0116-6
AcetonitrileEMDAX0142-6
Ammonium bicarbonateFluka Analytical09830
BioTrace NT NitrocellulosePALL Life Sciences66485
Bovine serum albumin (BSA) digest standardProteaPS-204-1
ChloroformAcros Organics423550025
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Fisher ScientificBP118
HPLC Grade waterEMDWX0008-1
LysozymeFisher ScientificBP535-1
MethanolSigma-Aldrich34860
Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF)Amresco0754
Pierce trypsin proteaseThermo Scientific90057
Ponceau SAcros Organics161470100
Protein LoBind Tube 0.5mLEppendorf022431064
Sodium bicarbonateSigma-Aldrich792519
Sodium chlorideMacron Fine Chemicals7581-06
Trifluoroacetic acid (TFA)Sigma-Aldrich299537
Tris-hydrochloride (HCl)Fisher ScientificBP152
Triton X-114Sigma-Aldrich93422
Tryptic soy broth (TSB)BD211822
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade)Sigma-AldrichC8982
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
MagNALyserRoche
Trans-Blot Turbo Transfer SystemBio-Rad
MALDI-TOF targetBruker Daltonics
Ultraflextreme MALDI-TOF-TOFBruker DaltonicsEquipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser

References

  1. Babu, M. M., et al. A database of bacterial lipoproteins (DOLOP) with functional assignments to predicted lipoproteins. J Bacteriol. 188 (8), 2761-2773 (2006).
  2. Narita, S., Tokuda, H. Bacterial lipoproteins; biogenesis, sorting and quality control. Biochim Biophys Acta. 1862 (11), 1414-1423 (2016).
  3. Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infect Immun. 79 (2), 548-561 (2011).
  4. Nguyen, M. T., Götz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiol Mol Biol Rev. 80 (3), 891-903 (2016).
  5. Nakayama, H., Kurokawa, K., Lee, B. L. Lipoproteins in bacteria: structures and biosynthetic pathways. FEBS J. 279 (23), 4247-4268 (2012).
  6. Kurokawa, K., et al. Novel bacterial lipoprotein structures conserved in low-GC content Gram-positive bacteria are recognized by Toll-like receptor 2. J Biol Chem. 287 (16), 13170-13181 (2012).
  7. Kurokawa, K., et al. The Triacylated ATP Binding Cluster Transporter Substrate-binding Lipoprotein of Staphylococcus aureus Functions as a Native Ligand for Toll-like Receptor 2. J Biol Chem. 284 (13), 8406-8411 (2009).
  8. Asanuma, M., et al. Structural evidence of α-aminoacylated lipoproteins of Staphylococcus aureus. FEBS J. 278 (5), 716-728 (2011).
  9. Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Identification of the Lyso-Form N-Acyl Intramolecular Transferase in Low-GC Firmicutes. J Bacteriol. 199 (11), e00099-e00017 (2017).
  10. Serebryakova, M. V., Demina, I. A., Galyamina, M. A., Kondratov, I. G., Ladygina, V. G., Govorun, V. M. The acylation state of surface lipoproteins of Mollicute Acholeplasma laidlawii. J Biol Chem. 286 (26), 22769-22776 (2011).
  11. Feng, S. H., Lo, S. C. Induced mouse spleen B-cell proliferation and secretion of immunoglobulin by lipid-associated membrane proteins of Mycoplasma fermentans incognitus and Mycoplasma penetrans. Infect Immun. 62 (9), 3916-3921 (1994).
  12. Feng, S. H., Lo, S. C. Lipid extract of Mycoplasma penetrans proteinase K-digested lipid-associated membrane proteins rapidly activates NF-kappaB and activator protein 1. Infect Immun. 67 (6), 2951-2956 (1999).
  13. Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Spellman, D. S., Sun, T. -. T., Neubert, T. A. Analysis of electroblotted proteins by mass spectrometry: protein identification after Western blotting. Mol Cell Proteomics. 7 (2), 308-314 (2008).
  14. Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Sun, T. -. T., Neubert, T. A. Use of Nitrocellulose Membranes for Protein Characterization by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Anal Chem. 78 (14), 5102-5108 (2006).
  15. Kurokawa, K., et al. Environment-mediated accumulation of diacyl lipoproteins over their triacyl counterparts in Staphylococcus aureus. J Bacteriol. 194 (13), 3299-3306 (2012).
  16. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  17. Schӓgger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nat Protoc. 1, 16-22 (2006).
  18. Gravel, P. Protein Blotting by the Semidry Method. The Protein Protocols Handbook. , 321-334 (2002).
  19. Webster, J., Oxley, D. Protein Identification by Peptide Mass Fingerprinting using MALDI-TOF Mass Spectrometry. The Protein Protocols Handbook. , 1117-1129 (2009).
  20. Wilkins, M. R., et al. Detailed peptide characterization using PEPTIDEMASS - a World-Wide-Web-accessible tool. Electrophoresis. 18 (3-4), 403-408 (1997).
  21. Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).
  22. Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).
  23. Al-Saad, K. A., Zabrouskov, V., Siems, W. F., Knowles, N. R., Hannan, R. M., Hill, H. H. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of lipids: ionization and prompt fragmentation patterns. Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (1), 87-96 (2003).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

X 114135MALDIacylation

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved