세균성 단백질 질량 분석에 의하여 구조 결심에 대 한 N 맨끝 Lipopeptides의 준비의 농축

요약

비 이온 계면 활성 제 단계 분할 메서드를 사용 하 여 세균성 단백질의 농축 TLR 분석 실험에 직접 사용 또는 다른 응용 프로그램에 대 한 설명 합니다. 추가 단계 구조 특성에 대 한 N 맨끝 tryptic lipopeptides를 준비 하는 질량 분석에 의해 자세히 나와 있습니다.

초록

지 단백질 세균성 세포 봉투의 중요 한 성분 이며 포유류 타고 난 면역 반응의 강력한 활성 제입니다. 세포 생리학과 면역학에 그들의 중요성에도 불구 하 고 많은 소설 지, 어떻게 그들은 합성은, 양식과 호스트 면역에 다양 한 형태의 효과 대 한 발견 되 고 남아 있다. 지 단백질에 대 한 철저 한 연구를 활성화 하려면이 프로토콜 세균 단백 농축 하는 방법에 설명 합니다 및 매트릭스 지원 레이저에 의하여 구조 결심에 대 한 N 맨끝 tryptic lipopeptides의 준비 desorption 이온화 시간의 비행 질량 분석기 (MALDI TOF MS)입니다. 단백 추출 및 세균성 세포 막에서 농축 방법 분할 설립된 트리톤 X-114 단계에 확대, 프로토콜 단백 수확량 증가 비 지 오염 물질을 제거 하기 위한 추가 단계를 포함 하 고 순도입니다. 먼저 MALDI TOF 양 여기에 의해 N-터미널 구조 특성에 중요 한 단백질은 수용 체 통행세 같이 (TLR) 분석 실험 일반적으로 사용 됩니다, 이후, 메서드 N 맨끝에 농축 하는 집중된 소수 성 펩 티 드를 분리 하 여 lipopeptides 나트륨 라우릴 황산 염 폴 리 아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)에 의해 분리 된 TOF MALDI MS/양 지 단백질에 의해 직접 분석에 적합 니트로 막 전송 현장에 와 소화 트립 신, 순차적으로 북극 tryptic 펩 티 드, 제거 하기 위하여 세척 그리고 클로 프롬-메탄올을 가진 마지막으로 eluted. 세척 솔루션에서 더 극 trypsinized 펩 티 드의 MS와 결합,이 메서드는 둘 다 식별 하는 단백 단일 실험에서의 N-말단의 특성 기능을 제공 합니다. 의도적인 나트륨 adduct 형성 더 구조적으로 유익한 조각화 스펙트럼을 홍보 하는 도구로 채택 될 수 있다. 궁극적으로, 단백질의 농축 및 그들의 N 맨끝 구조의 세균성 단백질의이 유비 쿼터 스 클래스에 더 광범위 한 연구 수 있도록 합니다.

서문

세균성 단백질을 보존된 N 맨끝 지질 수정 시스테인 그 앵커 세포 막 표면에 구형 단백질 도메인 특징입니다. 그들은 보편적으로 박테리아에 일반적인 게놈¹내의 모든 세포질 유전자의 2 ~ 5%를 구성 배포 됩니다. 지 단백질 등 양분 통풍 관, 신호 변환 세포질 과정의 광범위 한에 중요 한 역할 단백질 복합물의 및 유지 세포 봉투 구조적 무결성². 병원 성 박테리아, 단백질 독성 요인^3,4로 제공합니다. 감염, 동안 N 맨끝 lipopeptides 수용 체 통행세 같이 (TLR) 2에 의해의 인식 incites 침입 병원 체를 제거 하는 타고 난 면역 반응. N 맨끝 acylation 상태에 따라 단백질 대체 TLR2 heterodimeric 복합물에 의해 일반적으로 인식 된다. TLR2 TLR1 TLR2 TLR6 바인딩 무료 lipopeptide α-아미노 termini 동안 N-acylated lipopeptides를 인식합니다. 한 번 바운드, 신호 경로 proinflammatory cytokines^3,4의 분 비를 유도 하기 위해 수렴.

그것은 이전 줄 알았는데 그 그람 양성 박테리아에서 단백질 diacylated 및 그램 음성 박테리아에서 보존된 N 맨끝 시스테인 잔류물에는 아 미드 연결 지방산의 존재 또는 부재에 다른 triacylated를 했다. 이 가정은 Lnt, 형성 하는 triacylated 단백질⁵그람 음성 N acyl 전이 효소를 그람 양성 게놈에서 순서 orthologs의 부족에 의해 지원 되었다. 그러나, 최근 연구 3 소설 N 맨끝 단백 구조, peptidyl, lyso와 N-아 세 틸 형태^{6,7 뿐 아니라 단백 triacylation 그람 양성 Firmicutes 그 부족 lnt에 계시 했다 ,8}. 이러한 결과 소설 단백질이 어떻게 만들어에 대 한 근본적인 질문 어떤 생리 적 목적이 나 장점은 다양 한 형태의 얻으며 함께 가능한 아직---발견 지 형태에 대 한 질문을 제기. 또한, 그들은 명확 하 게 지 단백질 구조 예측 유전체학의 현재 무 능력을 보여 줍니다. 실제로, 우리는 최근 단백 N acyl transferases, Lit, Enterococcus faecalis 균 cereus 만드는 lyso 형태의 지 단백질⁹에서 라는의 소설 클래스 식별. 이 매우 소수 성 성격 및 특성을 그들의 분자 구조를 사용할 수 있는 제한 된 방법 때문에 도전적 일 수 있다 지 단백질 구조를 실험적으로 확인 하는 필요를 나타냅니다.

우리 세균 단백질을 순화 하 고 N-터미널 tryptic 준비 몇 가지 이전에 설명한 프로토콜 호스트 면역 반응 뿐만 아니라 N-터미널 구조 결정의 단백 유도 대 한 연구를 촉진 하기 위하여 적응 MALDI TOF MS^6,10,,1112에 의해 분석을 위해 lipopeptides. 지 단백질 오염 비 단백질을 제거 하 고 단백 수확량을 증가 하는 최적화 메서드를 분할 설립된 트리톤 X-114 (이제부터 계면 활성 제 또는 TX-114 참조) 단계를 사용 하 여 농축입니다. 이러한 단백질은 SDS 페이지 더 정화 또는 TLR 분석 실험에 직접 사용 하기 위해 적합 합니다. MALDI TOF ms, 니트로 막에는 단백질의 양도 비 계 트립 신 소화 효율적인 현장에 대 한 세척, 하며 매우 인 멤브레인 표면에서 후속 차입 정화 N 맨끝 lipopeptides. 니트로 샘플 처리를 용이 하 게 하 고 완전 한 막 단백질^13,14, 지 단백질^{9,10에서 높은 소수 성 펩 티 드에 대 한 시퀀스 범위를 향상을 보여줘 왔다} . 메서드는 중간 세척 솔루션은 단일 실험에서 N-터미널 구조 결심과 동시에 높은 자신감 단백질 식별을 위해 분석 될 수 있다 그래야 펩 티 드, 극성에 따라 분별의 추가 이점이 있다 . 이 프로토콜 고유 기능 의도적인 나트륨 adduct MS/MS, N-acylation 상태의 구조 지정에 은닉 하는 동안 dehydroalanyl 이온으로 부모 이온 조각화를 홍보 하는 대형. N-말단은 모두 가장 변수 및 주요 기능 단백질의 TLR 인식에 관련 된. 함께 찍은,이 프로토콜 정화 및 TOF MALDI MS 실험의 전반적인 목표에 따라 쉽게 적응 하 여 구조 결정의 각 단계와, 지 단백질에 집중 하 고 재현할 수 연구를 허용 했다.

프로토콜

1. 세포 성장 및 세포

1. 후반 지 수 단계 (OD₆₀₀ 1.0-1.5의) 15 mL tryptic 간장 국물 (TSB) 또는 유사한 리치 미디어에 박테리아를 성장. 원심 분리에 의해 세포를 수확, Tris 버퍼 식 염 수/EDTA (: TBSE)로 한 번 씻어 프로토콜을 계속 하거나 사용까지 동결.
   참고:: TBSE: 20 mM Tris-염 산 (HCl), pH 8.0, 130 m m 염화 나트륨 (NaCl), 그리고 5 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)). 단백 식 수정 성장 조건 (예: 산도, 염 분, 성장 매체) 및 성장 단계¹⁵에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 원하는대로, 하지만 15 mL 세포 성장 조절 수 셀은 권장 단백질의 단일 준비에 대 한 초과 바이오 매스 단백 생산량을 줄일 수 있습니다. 한 15 mL 준비는 일반적으로 2 ~ 4의 최적의 로드에 대 한 충분 한 샘플 생성 표준 SDS 페이지 미니 젤에 차선.
2. 1mm phenylmethyl sulfonyl 불 소 (PMSF)와 0.5 mg/mL lysozyme 800 μ: TBSE 셀 resuspend 솔루션 2.0 mL 스레드 microcentrifuge 튜브 스크류 캡 및 o-링을 전송 하 고 37 ° c.에 20 분 동안 품 어
   참고: 특정 종 lysozyme에 의해 세포에 감염 되지 않습니다. 적절 한 용균성 효소 세포에 도움을 대체 한다.
3. 튜브 ~ 800 μ 0.1 m m 지 르 코니 아/실리 카 구슬을 추가 하 고 30의 5 사이클는 균질 화기에 최대 속도 (7000 rpm)에서 떨고 하 여 셀을 방해 s 각 사이클 사이 얼음에 각각, 2 분 휴식.
4. (작은 구슬 및 손상 되지 않은 세포)에 4 ° C에서 5 분 동안 3000 x g에서 원심 분리기 샘플. 새로운 2.0 mL microcentrifuge 튜브에는 상쾌한 전송 및 얼음에 계속.
5. 200 μ: TBSE 나머지 펠 릿을 추가 하 고 추가 주기에 균질 화기 돌아갑니다. (위와) 원심을 상쾌한 이전 상쾌한 (800-1000 μ 총 볼륨 되어야 함)와 결합 합니다.

2. 텍사스-114 단계 분할 하 여 단백질의 농축

1. TX-114 2% (vol/vol)의 최종 농도에 계면 활성 제와 함께 상쾌한은 동일한 양의 4% (vol/vol) 얼음 처럼 차가운: TBSE에 계면 활성 제를 추가 하 여 보충 하 고 1 시간 반전에 의해 모든 ~ 15 분을 혼합에 대 한 얼음에 품 어.
   참고: 냉장, 계면 활성 제와 상쾌한 됩니다 혼합할 수 있는.
2. 37 ° C 물 목욕 튜브를 전송 및 상 분리를 유도 하기 위해 10 분 동안 품 어. 샘플 bi phasic 분리를 유지 하기 위해 실내 온도 에서 10 분 동안 10000 x g에서 원심
3. 부드럽게 위 수성 단계에서 플라스틱 그리고 삭제. 그것의 원래 볼륨을 튜브 리필 낮은 계면 활성 단계로 얼음: TBSE를 추가 하 고 혼합에 반전. 10 분 동안 얼음에 품 어.
4. 37 ° C 물 목욕 튜브 전송 단계 분리를 유도 하기 위해 10 분 동안 품 어 다음 실 온에서 10 분 동안 10000 x g에서 원심.
5. 3 별거의 총 단계 2.3-2.4를 한 번 더 반복 합니다. 위 수성 단계를 제거 하 고 삭제.
6. 계면 활성 제 단계에 차가운: TBSE의 1 볼륨을 추가 하 여 기사 (튜브의 하단에 표시)의 과정에서 형성 된 침전 된 단백질의 펠 릿을 제거 합니다. 불용 성 단백질을 작은 2 분 16000 x g에서 4 ° C에서 원심.
   참고: 샘플은 단일 단계를 유지 한다. 단계 분리 발생 하면, 다시 샘플을 진정 하 고 다시 원심. 펠 릿 일반적으로 단백이 아닌 오염 물질의 구성 이지만 추가 분석을 위해 유지 될 수 있습니다.
7. 즉시 신선한 2.0 mL microcentrifuge 튜브 100% 아세톤의 1250 μ를 포함 하는 상쾌한 전송. 점도 있을 것 이다 팁에서 샘플을 씻어 철저 하 게 위쪽 및 아래쪽 플라스틱. 반전 하 여 혼합 하 고 단백질을 침전에-20 ° C에서 밤새 품 어.
8. 샘플 튜브의 방향에 주의와 단백질 pellet을 실 온에서 20 분 16000 x g에서 원심 지 단백질 튜브의 외부 벽을 따라 얇고, 백색 필름을 형성 합니다.
9. 100% 아세톤과 두 번 펠 릿을 세척. 아세톤을 가만히 따르다 고 공기 샘플을 건조 수 있습니다.
10. 10 mM Tris HCl, pH 8.0 또는 표준 Laemmli SDS 페이지 샘플 버퍼¹⁶ 의 20-40 μ를 추가 하 고 철저 하 게 아래로 침전 된 지 단백질으로 벽에 pipetting으로 resuspend. 지 단백질을 꺼내 려 피 펫 팁 튜브의 측면을 다쳤어요.
    참고: 단백질 Tris 버퍼에서 분해 되지 않습니다 하지만 오히려 한 현 탁 액을 형성.
    1. -20 ° C에서 단백질 사용까지 저장 합니다.

3. SDS 페이지, Electroblotting, Ponceau s 얼룩

1. SDS 페이지 표준 방법¹⁶를 사용 하 여 별도 단백질.
   참고: 적절 한 젤 아크릴 비율의 용도 단백질의 크기에 따라 달라 집니다. 여기, E. faecalis 단백질 분리 되었다 10% 이상, 트리 스-글리신 젤 16.5% 트리 스 tricine 젤 작은 대장균 단백 Lpp¹⁷사용 되었다.
2. 표준 electroblotting 프로시저를 사용 하 여 니트로 전송 막에는 단백질을 전송 합니다.
   참고: 세미 드라이 전송 Bjerrum 란-닐슨 버퍼 플러스 0.1 %SDS 사용 하 여 25 V, 1.3에서 수행한 15 분¹⁸mA. 그러나 또는 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막 사용할 수, 그것은 니트로 보다 더 소수, 그것은 나중 단계에서 막에서 소수 lipopeptides의 효율적인 차입을 줄일 수 있습니다.
3. 컨테이너와 커버 Ponceau S 솔루션 (0.2% (w/v) Ponceau S 5% 초 산에서)와 니트로 막 전송. 바위 부드럽게 5 분 또는 때까지 빨강 분홍색 밴드를 볼 수 있습니다.
4. Ponceau S 솔루션을 부 어와 신중 하 게 씻어₂O를 초과 제거 얼룩 지명 타자로 니트로 막.
   참고: Ponceau 스테인드 밴드는 급속 하 게 destain 것입니다. 밴드는 사라지고, 착 색 과정을 반복 합니다.
5. 깨끗 한 면도날으로 원하는 밴드와 microcentrifuge 튜브에 소비 세. DH₂O를 완전히 밴드 destain의 1 mL로 세 번 세척.
   참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 저장소 삭제 섹션 사용까지-20 ° C에서 물으로 덮여 있습니다.
6. 깨끗 한 표면에와 깨끗 한 면도날으로 섹션을 전송, 0.5 mL 낮은 단백질 바인딩 microcentrifuge 튜브로 조각 작은 조각의 약 1 m m x 1 m m. 수집으로 니트로 스트립 주사위.
7. 씻어 갓 50 m m 염화 중 탄산염 (NH₄HCO₃) 0.5 mL로 두 번 조각의 pH 7.8-고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 학년 물에.

4. tryptic 소화, 니트로 막, MALDI 표적, 및 데이터 수집에 증 착에서 Lipopeptide 추출

1. 50mm NH₄HCO₃, pH 7.8 HPLC 학년 물에서 trypsin의 20 μ g/mL 해결책의 20 μ에 니트로 조각 resuspend. 혼합, 소용돌이 다음 모든 조각을 완전히 trypsin 솔루션에 포함 되도록 짧게 스핀. 파라핀 필름 증발을 방지 하 고 37 ° c.에 하룻밤 다이제스트를 품 어를 사용 하 여 튜브 뚜껑 커버
2. 스핀에서 16000 x g 30 s 및 제거 pipetting으로 액체에 대 한 샘플.
   참고:이 단백질 식별 MALDI TOF MS에 의해 나중에 시험 될 수 있다 trypsinized 친수성 펩 티 드를 제거 합니다.
3. HPLC 학년 물에 0.5 %trifluoroacetic 산 (TFA)의 50 μ를 추가 합니다. 혼합, 소용돌이 다음 모든 조각 솔루션 적용 되도록 간단히 샘플을 회전 합니다. 실 온에서 10 분 동안 품 어. Pipetting으로 액체를 제거 합니다.
   주의: TFA는 흡입 하는 경우에 유해한. 신중 하 게 처리 하며 화학 증기 두건에서 사용. 피부와 접촉을 하지 마십시오.
4. HPLC 학년 물에 10% 이기의 50 μ와 4.3 단계를 반복 합니다.
   주의: 이기는 흡입 하는 경우에 유해한. 신중 하 게 처리 하며 화학 증기 두건에서 사용. 피부와 접촉을 하지 마십시오.
5. HPLC 학년 물에 20% 이기의 50 μ와 4.3 단계를 반복 합니다.
   참고:이 느슨하게는 니트로에 바인딩된 모든 알맞게 소수 성 펩 티 드를 제거 합니다.
6. 단단히 바인딩된 lipopeptides elute 갓 만든 10 mg/mL α-cyano-4-hydroxycinnamic 산 (CHCA) 매트릭스 클로 프롬-메탄올 (2:1, v/v)에 용 해의 15 μ를 추가 하 고 간헐적으로 vortexing와 실 온에서 10 분 동안 품 어.
   1. 또는 15 μ 클로 프롬-메탄올 elute lipopeptides 나중에 매트릭스와 믹스를 추가 합니다. 2, 5-dihydroxybenzoic 산 (DHB) 등 다른 행렬 특정 lipopeptide 구성에 대 한 불만족 한 결과 가져온 경우 CHCA에 대안으로 시험 되어야 한다.
      주의: 클로 프롬 및 메탄올 흡입 하는 경우에 유해 하다입니다. 신중 하 게 처리 하며 화학 증기 두건에서 사용. 피부와 접촉을 하지 마십시오.
   2. 옵션: 나트륨을 홍보 하기 위해 대형 adduct, 1mm의 최종 농도에 수성 나트륨 탄산염 (NaHCO₃)와 클로 프롬-메탄올에 CHCA의 솔루션을 보완.
7. 간단히 샘플을 회전 합니다. 피 펫와 신중 하 게 새로운 낮은 단백질 바인딩 microcentrifuge 튜브에 액체를 전송. 이 솔루션은 N 맨끝 lipopeptides의 대량을 포함 됩니다.
   참고:는 니트로 수 있습니다 부분적으로 또는 완전히 분해 클로 프롬 메탄올 솔루션. 이 부정적인 MS 결과 영향을 주지 않습니다 그리고 lipopeptide 반환을 증가 하는 대체 방법으로 사용할 수 있습니다. PVDF 막 하지 같은 방식으로 분해 됩니다.
8. 닦은 강철 MALDI 표적에 CHCA와 eluted lipopeptides의 1 μ를 입금.
   참고: 클로 프롬-메탄올 것입니다 증발 신속 하 게, 결정 CHCA와 lipopeptides 뒤에 남겨두고. Aliquot는 선택적 둘째 1 μ 샘플 농도 높이기 위해 같은 자리에 입금 될 수 있습니다. 클로 프롬-메탄올 대상에 증 착 후 크게 확산 될 수 있습니다와 같은 한다 주의 샘플 대상에 혼합 하지 마십시오. 입금 하 고 각 샘플의 여러 관광 명소를 촬영 하는 것이 좋습니다.
9. 즉시 질량 분석을 진행 합니다. 특히 자리 포함 되어 있는 경우 두 레이어 샘플의 두 번째 레이어 스팟의 바깥쪽 테두리에는 lipopeptides를 밀어 수 있습니다 lipopeptide 신호, 스팟의 모든 영역을 검사 합니다.
   참고: 권장된 시작 레이저 강도 25%, 비록 그것은 신호를 수집 하 고 적절 한 신호 대 잡음 비율을 달성 하기 위해 여러 스펙트럼 (20 명 이상 검사)를 합계 하는 강도 증가 하는 데 필요한 있을 수 있습니다. 여기, 스펙트럼 MALDI TOF TOF 악기에 인수 했다 ( 테이블의 자료를 참조) 700-3500 m/z 범위 반사판 긍정적인 이온 검출에 대 한 공장에서 구성 된 악기 방법을 사용 하 여. 악기는 소 혈 청 알 부 민 (BSA) tryptic 펩 티 드 혼합물으로 보정 했다.

결과

프로토콜의 회로도 그림 1에 제공 됩니다. TX-114 Enterococcus faecalis ATCC 19433에서에서 추출한 단백 농축 분수는 그림 2에 표시 됩니다. 비교를 위해 침전 된 단백질 분수의 밴딩 패턴도 표시 됩니다. 이 분수에서 단백질은 MALDI MS는 매우 풍부한 단백질 (표 1) 이외의 단백질 오염 수에 의해 확인 되었다.

토론

지 단백질 특성의 2 단계로 여기 프로토콜에 설명 합니다: TX-114에 의해 농축 단계 MALDI TOF MS에 의해 분할 및 구조 결정. TX-114 추출 하는 동안 추가 원심 아세톤 강수량 수익률 높은 농축된 단백질 이어서이 과정 침전 오염 단백질을 제거 합니다. 셀의 15 mL 가치에 각 준비의 규모를 제한 하 여 몇 가지 샘플 수 쉽게 병렬로 처리 되며 원하는 경우, 프로토콜의 끝에 풀링된.

MS 구조 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
0.01 mm Zirconia/silica beads	BioSpec Products	110791012
Acetic acid	EMD	AX0073-9
Acetone	EMD	AX0116-6
Acetonitrile	EMD	AX0142-6
Ammonium bicarbonate	Fluka Analytical	09830
BioTrace NT Nitrocellulose	PALL Life Sciences	66485
Bovine serum albumin (BSA) digest standard	Protea	PS-204-1
Chloroform	Acros Organics	423550025
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Fisher Scientific	BP118
HPLC Grade water	EMD	WX0008-1
Lysozyme	Fisher Scientific	BP535-1
Methanol	Sigma-Aldrich	34860
Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF)	Amresco	0754
Pierce trypsin protease	Thermo Scientific	90057
Ponceau S	Acros Organics	161470100
Protein LoBind Tube 0.5mL	Eppendorf	022431064
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	792519
Sodium chloride	Macron Fine Chemicals	7581-06
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma-Aldrich	299537
Tris-hydrochloride (HCl)	Fisher Scientific	BP152
Triton X-114	Sigma-Aldrich	93422
Tryptic soy broth (TSB)	BD	211822
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade)	Sigma-Aldrich	C8982
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
MagNALyser	Roche
Trans-Blot Turbo Transfer System	Bio-Rad
MALDI-TOF target	Bruker Daltonics
Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF	Bruker Daltonics		Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser