Arricchimento delle lipoproteine batteriche e preparazione del N-terminale lipopeptidi per determinazione strutturale mediante spettrometria di massa

Riepilogo

L'arricchimento delle lipoproteine batteriche mediante una fase di tensioattivo non ionico metodo di partizionamento è descritto per uso diretto in saggi TLR o altre applicazioni. Ulteriori iniziative sono dettagliate per preparare lipopeptidi triptico N-terminale per la caratterizzazione strutturale mediante spettrometria di massa.

Abstract

Le lipoproteine sono costituenti importanti della busta delle cellule batteriche e potenti attivatori della risposta immunitaria innata dei mammiferi. Nonostante la loro importanza nella fisiologia cellulare e di immunologia, molto resta ancora da scoprire sulle forme di romanzo della lipoproteina, come essi sono sintetizzati e l'effetto delle varie forme su immunità dell'ospite. Per attivare studi approfonditi sulle lipoproteine, questo protocollo descrive un metodo per l'arricchimento della lipoproteina batterica e preparazione del N-terminale triptico lipopeptidi per determinazione strutturale di matrix-assisted laser desorbimento ionizzazione-tempo di volo spettrometria di massa (MALDI-TOF MS). Espandendo una consolidata fase di Triton X-114 metodo per l'estrazione della lipoproteina e arricchimento dalla membrana cellulare batterica di partizionamento, il protocollo include ulteriori passaggi per rimuovere i contaminanti non-lipoproteina, aumentano il rendimento della lipoproteina e purezza. Poiché le lipoproteine sono comunemente usate nelle analisi di recettori Toll-like (TLR), è fondamentale innanzitutto caratterizzano la struttura del N-terminale di MALDI-TOF MS. qui, viene presentato un metodo per isolare peptidi idrofobi concentrati arricchiti in N-terminale lipopeptidi adatti per l'analisi diretta di MALDI-TOF MS/MS. lipoproteine che sono stati separati da sodio solfato elettroforesi dodecilica del Gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) sono trasferito ad una membrana di nitrocellulosa, digeriti in situ con tripsina, in sequenza lavata per rimuovere peptidi triptici polar e infine eluito con cloroformio-metanolo. Quando accoppiato con MS dei peptidi trypsinized più polari da soluzioni di lavaggio, questo metodo fornisce la capacità di identificare la lipoproteina e caratterizzano la sua estremità N-terminale in un singolo esperimento. Formazione del complesso di sodio intenzionale può essere impiegato anche come strumento per promuovere più spettri di frammentazione strutturalmente ben informato. In definitiva, arricchimento delle lipoproteine e determinazione delle loro strutture di N-terminale permetterà studi più approfonditi su questa onnipresente classe di proteine batteriche.

Introduzione

Lipoproteine batteriche sono caratterizzate da una N-terminale del lipido-modificato cisteina conservato che le ancore il dominio globulare proteina alla superficie della membrana cellulare. Essi sono distribuiti universalmente nei batteri, che costituiscono il 2 e il 5% di tutti i geni cellulari all'interno di un tipico genoma¹. Lipoproteine giocano un ruolo critico in un'ampia varietà di processi cellulari, tra cui l'assorbimento di nutrienti, trasduzione del segnale, assemblaggio di complessi proteici e nel mantenimento delle cellule busta integrità strutturale². Batteri patogeni, lipoproteine servono come fattori di virulenza^3,4. Durante un'infezione, riconoscimento del N-terminale lipopeptidi di recettori Toll-like (TLR) 2 incita una risposta immunitaria innata per rimuovere gli agenti patogeni d'invasione. A seconda dello stato di acilazione del N-terminale, le lipoproteine sono generalmente riconosciute da alternativo TLR2 heterodimeric complessi. TLR2-TLR1 riconosce N-acilato lipopeptidi, mentre TLR2-TLR6 lega lipopeptide gratis termini α-amminico. Una volta legato, le vie di segnalazione convergono per indurre la secrezione di citochine proinfiammatorie^3,4.

Era precedentemente pensato che le lipoproteine da batteri Gram-positivi erano diacylated e quelli da batteri gram-negativi erano triacylated, differendo in assenza o in presenza di un acido grasso ammide-collegato sul residuo di cisteina di N-terminale conservato. Questa ipotesi è stata sostenuta dalla mancanza di sequenza ortologhi nei genomi Gram-positivi a Lnt, il gram-negativi N-acil transferasi che forma triacylated lipoproteine⁵. Tuttavia, recenti studi hanno rivelato lipoproteina triacylation in Gram-positivi Firmicutes tale mancanza lnt, come pure tre nuove strutture della lipoproteina N-terminale, definiti il peptidil, lyso e N -acetile moduli^{6,7 ,8}. Questi risultati sollevano domande sulle forme possibili della lipoproteina ancora scoperto, insieme a domande fondamentali su come sono fatte queste lipoproteine romanzo e quali finalità fisiologiche o vantaggio impartire le varie forme. Inoltre, dimostrano chiaramente l'impossibilità attuale di genomica per predire la struttura della lipoproteina. Infatti, recentemente abbiamo identificato una nuova classe di transferasi di N-acil lipoproteina, chiamato Lit, da Enterococcus faecalis e bacillo saguaro che rende lyso-modulo lipoproteine⁹. Questo indica la necessità di verificare sperimentalmente la struttura della lipoproteina, che può essere difficile a causa della loro natura estremamente idrofobica e limitate metodi disponibili per caratterizzare la loro struttura molecolare.

Per facilitare gli studi sull'induzione della lipoproteina della risposta immunitaria ospite, come pure la determinazione strutturale di N-terminale, abbiamo adattato parecchi protocolli precedentemente descritta al fine di purificare le lipoproteine batteriche e preparare il trittico N-terminale lipopeptidi per analisi mediante MALDI-TOF MS^6,10,11,12. Le lipoproteine sono arricchite utilizzando una consolidata fase di Triton X-114 (d'ora in poi denominato tensioattivo o TX-114) metodo, con ottimizzazione per rimuovere contaminanti non-lipoproteine e aumentare la resa della lipoproteina di partizionamento. Queste lipoproteine sono adatte per uso diretto in saggi TLR o per ulteriore purificazione da SDS-PAGE. Per MALDI-TOF MS, trasferimento delle lipoproteine di membrana di nitrocellulosa fornisce un'impalcatura per efficiente in situ digestione della tripsina, lavaggio e successiva eluizione dalla superficie della membrana, con conseguente altamente purificato lipopeptidi N-terminale. Nitrocellulosa è stata indicata per facilitare la manipolazione del campione e migliorare la copertura di sequenza per i peptidi altamente idrofobi da proteine integrali di membrana^13,14, così come le lipoproteine^9,10 . Il metodo ha il vantaggio aggiuntivo di frazionamento peptidi basati su polarità, in modo che soluzioni di lavaggio intermedio possono essere analizzati per identificazione di proteine di alta fiducia simultaneamente con determinazione strutturale di N-terminale in un singolo esperimento . Questo protocollo in modo univoco sodio intenzionale caratteristiche del complesso formazione per promuovere la frammentazione di ioni di padre verso gli ioni dehydroalanyl corso MS/MS, aiutando nella mansione strutturale dello stato N- acilazione. N-terminale è sia la caratteristica più variabile e chiave relazionata al riconoscimento TLR delle lipoproteine. Presi insieme, questo protocollo ha permesso studi intensivi e riproducibili sulle lipoproteine, con le singole fasi di purificazione e determinazione strutturale di MALDI-TOF MS facilmente adattato a seconda l'obiettivo generale dell'esperimento.

Protocollo

1. crescita e lisi delle cellule

1. Crescere i batteri in 15 mL di brodo di soia triptico (TSB) o simili contenuti multimediali alla fine della fase esponenziale (OD₆₀₀ di 1.0-1.5). Raccogliere le cellule mediante centrifugazione, lavare una volta con Tris-buffered saline/EDTA (TBSE) e continuare con protocollo o congelare fino all'utilizzo.
   Nota: TBSE: 20 mM Tris-cloridrato (HCl), pH 8.0, 130 mM di cloruro di sodio (NaCl) e 5 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)). Modifica ed espressione della lipoproteina può essere influenzati dalle condizioni di crescita (ad es. acidità, salinità, crescita media) e crescita fase¹⁵. Crescita delle cellule può essere scalata come desiderato, ma 15 mL delle cellule è consigliato per un unico preparato delle lipoproteine in eccesso biomassa può diminuire resa della lipoproteina. Una preparazione di 15 mL generalmente produce quantità sufficiente di campione per un carico ottimale di ~ 2-4 corsie su una standard del mini gel di SDS-PAGE.
2. Risospendere le cellule in 800 μL TBSE con 1 mM phenylmethyl sulfonil fluoruro (PMSF) e lisozima di 0,5 mg/mL. Trasferire la soluzione in una microcentrifuga filettato a 2,0 mL con tappo a vite e o-ring e incubare per 20 min a 37 ° C.
   Nota: Alcune specie non sono suscettibili alla lisi da lisozima. Un enzima litico appropriato dovrebbe essere sostituito per facilitare la lisi.
3. Aggiungere perline zirconia/silice di ~ 800 μL 0,1 mm per il tubo e frantumare le cellule agitando alla massima velocità (7.000 giri/min) su un omogeneizzatore per 5 cicli di 30 s ciascuna, con 2 min riposare su ghiaccio tra ciascun ciclo.
4. Campione di centrifugare a 3000 x g per 5 min a 4 ° C (a pellet perline e ininterrotta delle cellule). Trasferire il surnatante in una provetta di 2,0 mL microcentrifuga nuovo e mantenere il ghiaccio.
5. Aggiungere 200 μL TBSE per la pallina restante e ritornare l'omogeneizzatore per un ulteriore ciclo. Centrifuga (come sopra) e combinare il surnatante con il surnatante precedente (dovrebbe essere il volume totale di 800-1000 μL).

2. arricchimento delle lipoproteine di TX-114 fase di partizionamento

1. Completare il surnatante con TX-114 tensioattivo a una concentrazione finale del 2% (vol/vol) aggiungendo un volume uguale di 4% (vol/vol) il tensioattivo in TBSE ghiacciata e incubare in ghiaccio per 1 h, mescolare capovolgendo ogni ~ 15 min.
   Nota: Quando refrigerati, il surnatante e tensioattivo sarà miscibile.
2. Il tubo di trasferimento a bagnomaria a 37 ° C ed incubare per 10 min per indurre la separazione di fase. Centrifugare il campione a 10.000 x g per 10 min a temperatura ambiente per mantenere la separazione bi-fasico.
3. Delicatamente Pipettare fuori la fase acquosa superiore e scartare. Aggiungere TBSE ghiacciata la fase inferiore di tensioattivo per riempire il tubo al suo volume originario e invertire per mescolare. Incubare in ghiaccio per 10 min.
4. Trasferire la provetta a bagnomaria a 37 ° C ed incubare per 10 min per indurre la separazione di fase, quindi centrifugare a 10.000 x g per 10 min a temperatura ambiente.
5. Ripetere i passaggi da 2.3-2.4 ancora una volta per un totale di 3 separazioni. La fase acquosa superiore di rimuovere e scartare.
6. Rimuovere il pellet di proteine precipitate che si formano nel corso delle estrazioni (visibile nella parte inferiore del tubo), aggiungendo 1 volume di TBSE ghiacciata alla fase di tensioattivo. Centrifugare a 4 ° C a 16.000 x g per 2 min a pellet proteina insolubile.
   Nota: Il campione deve rimanere una sola fase. In caso di separazione di fase, ri-chill campione e centrifugare nuovamente. Il pellet è generalmente composto da agenti inquinanti non-lipoproteina, ma possa essere conservato per ulteriori analisi.
7. Immediatamente trasferire il surnatante in una provetta di fresco 2,0 mL microcentrifuga contenente 1250 µ l di acetone 100%. Pipettare accuratamente su e giù per lavare il campione dalla punta come sarà viscoso. Mescolare per inversione e incubare per una notte a-20 ° C per precipitare le proteine.
8. Centrifugare il campione a 16.000 x g per 20 min a temperatura ambiente a pellet lipoproteine con attenzione all'orientamento del tubo. Lipoproteine formerà una pellicola sottile e bianca lungo la parete esterna del tubo.
9. Lavare la pallina due volte con 100% di acetone. Decantare acetone e lasciare asciugare il campione di aria.
10. Aggiungere 20-40 μL di 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 o standard Laemmli SDS-PAGE sample buffer¹⁶ e Risospendere accuratamente pipettando su e giù contro il muro con le lipoproteine precipitate. Raschiare il lato del tubo con la punta della pipetta per sloggiare le lipoproteine.
    Nota: Le lipoproteine non si dissolvono in tampone Tris, ma piuttosto formano una sospensione.
    1. Memorizzare le lipoproteine a-20 ° C fino all'utilizzo.

3. SDS-PAGE, Electroblotting e colorazione con Ponceau S

1. Lipoproteine separate da SDS-PAGE utilizzando metodi standard¹⁶.
   Nota: La percentuale di acrilammide gel appropriato variano a seconda della sua destinazione d'uso e le dimensioni delle lipoproteine. Qui, E. faecalis lipoproteine sono state separate oltre un 10% gel di Tris-glicina, mentre un gel di Tris-tricine 16,5% è stato utilizzato per la più piccola lipoproteina di e. coli Lpp¹⁷.
2. Trasferire le lipoproteine ad una membrana di nitrocellulosa trasferimento utilizzando una procedura standard electroblotting.
   Nota: È stato eseguito un trasferimento semi-secco utilizzando Bjerrum Schafer-Nielsen buffer più 0,1% SDS a 25 V, 1.3 mA per 15 min¹⁸. In alternativa, polivinilidene difluoruro (PVDF) membrana potrebbe essere utilizzata, tuttavia, come è più idrofobo di nitrocellulosa, esso può ridurre efficiente eluizione di idrofobo lipopeptidi dalla membrana alle fasi successive.
3. Trasferire la membrana di nitrocellulosa a un contenitore e coprire con la soluzione di Ponceau S (0,2% (w/v) Ponceau S in acido acetico al 5%). Roccia delicatamente per 5 minuti o fino a bande rosso-rosa sono visibili.
4. Versate la soluzione di Ponceau S e risciacquare con cura la membrana di nitrocellulosa con dH₂O per rimuovere l'eccesso di mordente.
   Nota: Tinto Ponceau bande saranno decolorare rapidamente. Se le bande scompaiono, ripetere il processo di colorazione.
5. Con una lama di rasoio pulita, asportare la banda desiderata e il trasferimento ad un tubo del microcentrifuge. Lavare tre volte con 1 mL di dH₂O per decolorare completamente la band.
   Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Archivio sezione asportata ricoperta d'acqua a-20 ° C fino all'utilizzo.
6. Trasferire la sezione su una superficie pulita e con una lama di rasoio pulita, tagliare a dadini la striscia di nitrocellulosa a pezzetti di circa 1 mm x 1 mm. raccogliere i pezzi in un tubo del microcentrifuge associazione di proteine di basso di 0,5 mL.
7. Lavare i pezzi due volte con 0,5 mL preparata 50mm di bicarbonato di ammonio (NH₄HCO₃), pH 7,8 in acqua di qualità per cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC).

4. triptica digestione, Lipopeptide estrazione dalla membrana di nitrocellulosa, deposizione sul Target MALDI e acquisizione dati

1. Risospendere pezzi di nitrocellulosa in 20 μL di una soluzione di 20 μg/mL di tripsina in 50mm NH₄HCO₃, pH 7,8 in acqua di grado HPLC. Vortice di mescolare, poi girare brevemente per garantire che tutti i pezzi sono completamente coperti dalla soluzione di tripsina. Coprire il coperchio del tubo usando pellicola di paraffina per evitare l'evaporazione e incubare digerire una notte a 37 ° C.
2. Spin il campione a 16.000 x g per 30 s e rimuovere il liquido di pipettaggio.
   Nota: Questo rimuove tripsinizzate idrofiliche peptidi che possono essere esaminati successivamente mediante MALDI-TOF MS per l'identificazione della proteina.
3. Aggiungere 50 μL di 0,5% acido trifluoroacetico (TFA) in acqua di grado HPLC. Vortice di mescolare, poi girare il campione brevemente affinché tutti i pezzi sono coperti dalla soluzione. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il liquido di pipettaggio.
   Attenzione: TFA è nocivo se inalato. Maneggiare con cautela e utilizzare la cappa chimica. Evitare il contatto con la pelle.
4. Ripetere il passaggio 4.3 con 50 μL di 10% acetonitrile in acqua di grado HPLC.
   Attenzione: L'acetonitrile è nocivo se inalato. Maneggiare con cautela e utilizzare la cappa chimica. Evitare il contatto con la pelle.
5. Ripetere il passaggio 4.3 con 50 μL di 20% acetonitrile in acqua di grado HPLC.
   Nota: Questa operazione rimuove qualsiasi peptidi moderatamente idrofobi vagamente associati alla nitrocellulosa.
6. Per eluire il lipopeptidi strettamente associato, aggiungere 15 μL di preparati 10mg/mL α-ciano-4-idrossicinnamico acido (CHCA) matrice disciolto in cloroformio-metanolo (2:1, v/v) e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente con agitazione intermittente.
   1. In alternativa, aggiungere 15 μL cloroformio-metanolo per eluire lipopeptidi e mescolare con matrice in un secondo momento. Altre matrici, come l'acido 2,5-dihydroxybenzoic (DHB), dovrebbero essere testati come alternative al CHCA se si ottengono risultati insoddisfacenti per una composizione particolare lipopeptide.
      Attenzione: Cloroformio e metanolo sono nocivi se inalato. Maneggiare con cautela e utilizzare la cappa chimica. Evitare il contatto con la pelle.
   2. Opzionale: Sodio di promuovere la formazione del complesso, integrare la soluzione di CHCA in cloroformio-metanolo con bicarbonato di sodio acquoso (NaHCO₃) ad una concentrazione finale di 1 mM.
7. Girare brevemente il campione. Con una pipetta, trasferire con cautela il liquido per un nuovo tubo del microcentrifuge associazione di povera in proteine. Questa soluzione conterrà la maggior parte dei lipopeptidi del N-terminale.
   Nota: La nitrocellulosa può sciogliere parzialmente o completamente nella soluzione di cloroformio-metanolo. Questo non influirà negativamente MS risultati e può essere utilizzato come metodo alternativo per aumentare lipopeptide ritorno. Membrana PVDF non si dissolva nello stesso modo.
8. Cassetta 1 μL dei lipopeptidi eluiti con CHCA su una destinazione di MALDI in acciaio lucida.
   Nota: Il cloroformio-metanolo evapora rapidamente, lasciando dietro di sé cristallizzato CHCA e lipopeptidi. Un opzionale secondo 1 μL di aliquota possono essere depositati su nello stesso punto per aumentare la concentrazione del campione. Cloroformio-metanolo può diffondersi significativamente dopo la deposizione sul bersaglio e come tale, si dovrebbe prestare attenzione per evitare la miscelazione del campione sul bersaglio. Si consiglia di depositare e sparare i punti multipli di ogni campione.
9. Procedere immediatamente alla spettrometria di massa. Analizzare tutte le aree dello spot per segnale lipopeptide, soprattutto se lo spot contiene due strati del campione, come il secondo strato può spingere i lipopeptidi al bordo esterno della macchia.
   Nota: Intensità del laser partenza consigliata è 25%, anche se può essere necessario aumentare l'intensità per acquisire segnale e sommare più spettri (20 o più scansioni) per ottenere adeguato rapporto segnale-rumore. Qui, gli spettri sono stati acquisiti su uno strumento di MALDI-TOF-TOF (Vedi la Tabella materiali) utilizzando un metodo predefiniti dello strumento per la rilevazione di ioni positivi di riflettore sopra la gamma di m/z 700-3500. Lo strumento è stato calibrato con una miscela di peptide triptico di albumina di siero bovino (BSA).

Risultati

Un disegno schematico del protocollo è fornito nella Figura 1. La frazione arricchita di lipoproteina estratta da Enterococcus faecalis ATCC 19433 da TX-114 è illustrata nella Figura 2. Per confronto, il disegno a strisce della frazione proteica precipitato è anche mostrato. Proteine da questa frazione sono state confermate mediante MALDI-MS per essere altamente abbondanti contaminando proteine diverse da lipoproteine...

Discussione

Il protocollo di questo documento descrive due distinte fasi di caratterizzazione della lipoproteina: determinazione di partizionamento e strutturale mediante MALDI-TOF MS di fase di arricchimento di TX-114. Durante l'estrazione di TX-114, ulteriore centrifugazione rimuove contaminanti proteine che precipitano durante questo processo, seguito da precipitazione di acetone per produrre lipoproteine altamente arricchite. Limitando la scala di ogni preparazione a 15 mL vale la pena di cellule, parecchi campioni possono esser...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
0.01 mm Zirconia/silica beads	BioSpec Products	110791012
Acetic acid	EMD	AX0073-9
Acetone	EMD	AX0116-6
Acetonitrile	EMD	AX0142-6
Ammonium bicarbonate	Fluka Analytical	09830
BioTrace NT Nitrocellulose	PALL Life Sciences	66485
Bovine serum albumin (BSA) digest standard	Protea	PS-204-1
Chloroform	Acros Organics	423550025
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Fisher Scientific	BP118
HPLC Grade water	EMD	WX0008-1
Lysozyme	Fisher Scientific	BP535-1
Methanol	Sigma-Aldrich	34860
Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF)	Amresco	0754
Pierce trypsin protease	Thermo Scientific	90057
Ponceau S	Acros Organics	161470100
Protein LoBind Tube 0.5mL	Eppendorf	022431064
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	792519
Sodium chloride	Macron Fine Chemicals	7581-06
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma-Aldrich	299537
Tris-hydrochloride (HCl)	Fisher Scientific	BP152
Triton X-114	Sigma-Aldrich	93422
Tryptic soy broth (TSB)	BD	211822
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade)	Sigma-Aldrich	C8982
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
MagNALyser	Roche
Trans-Blot Turbo Transfer System	Bio-Rad
MALDI-TOF target	Bruker Daltonics
Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF	Bruker Daltonics		Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser