Enriquecimento de lipoproteínas bacterianas e preparação do N-terminal Lipopeptides de determinação estrutural por espectrometria de massa

Resumo

O enriquecimento de lipoproteínas bacterianas usando uma fase de tensoativo não-iônico, método de particionamento é descrito para utilização directa em ensaios TLR ou outras aplicações. Novos passos são detalhados para preparar tryptic lipopeptides N-terminal para caracterização estrutural por espectrometria de massa.

Resumo

As lipoproteínas são importantes constituintes do envelope celular bacteriana e potentes ativadores da resposta imune inata dos mamíferos. Apesar de sua importância para a fisiologia celular e Imunologia, ainda muito para ser descoberto sobre formas de lipoproteína romance, como eles são sintetizados e o efeito das várias formas de imunidade do hospedeiro. Para habilitar estudos aprofundados sobre as lipoproteínas, este protocolo descreve um método para o enriquecimento de lipoproteína bacteriana e preparação do N-terminal tryptic lipopeptides de determinação estrutural por laser assistida por matriz desorção ionização-tempo de voo espectrometria de massa (MALDI-TOF-MS). Expandindo-se em uma fase de Triton X-114 estabelecida particionamento método para extração de lipoproteína e enriquecimento da membrana da célula bacteriana, o protocolo inclui etapas adicionais para remover contaminantes não-lipoproteína, aumentando o rendimento de lipoproteína e pureza. Desde que lipoproteínas são comumente utilizadas em ensaios de receptores do tipo Toll (TLR), é fundamental para primeiro caracterizar a estrutura do N-terminal por aquiem MALDI-TOF MS., um método é apresentado para isolar peptídeos hidrofóbicos concentrados, enriquecidos no N-terminal lipopeptides adequados para análise direta por MALDI-TOF MS/MS. lipoproteínas que foram separados por sódio Dodecil sulfato de Poly-Acrylamide electroforese do Gel (SDS-PAGE) são transferidos para uma membrana de nitrocelulose, digerido em situ com tripsina, sequencialmente lavado para remover peptídeos tryptic polares e finalmente eluída com clorofórmio-metanol. Quando acoplado com MS dos peptides mais polares trypsinized de soluções de lavagem, este método fornece a capacidade para identificar a lipoproteína e caracterizar seu N-terminal em uma única experiência. Sódio intencional aduto formação também podem ser empregados como uma ferramenta para promover mais espectros de fragmentação estruturalmente informativo. Em última análise, enriquecimento de lipoproteínas e determinação das suas estruturas de N-terminal permitirá estudos mais aprofundados sobre esta classe onipresente de proteínas bacterianas.

Introdução

Lipoproteínas bacterianas são caracterizadas por uma cisteína conservada de lipídios-modificado N-terminal que ancora o domínio de proteínas globulares na superfície da membrana celular. Eles são universalmente distribuídos em bactérias, constituindo 2 a 5% de todos os genes celulares dentro de um genoma típico¹. Lipoproteínas desempenham um papel crítico em uma ampla variedade de processos celulares, incluindo a absorção de nutrientes, transdução de sinal, montagem de complexos de proteínas, bem como na manutenção celular envelope integridade estrutural². Em bactérias patogênicas, lipoproteínas servem como fatores de virulência^3,4. Durante uma infecção, o reconhecimento do N-terminal lipopeptides pelos receptores do tipo Toll (TLR) 2 incita a uma resposta imune inata para remover patógenos invasores. Dependendo do estado de acilação do N-terminal, lipoproteínas são geralmente reconhecidas pelo alternativo TLR2 heterodimérica complexos. TLR2-TLR1 reconhece lipopeptides N-acylated, enquanto TLR2-TLR6 liga livre lipopeptide α-amino termini. Uma vez acoplado, as vias de sinalização convergem para induzir a secreção de proinflammatory cytokines^3,4.

Anteriormente, pensava-se que as lipoproteínas de bactérias gram-positivas eram diacylated e os de bactérias Gram-negativas foram triacylated, diferenciando-se na ausência ou presença de um ácido graxo Amida-lig sobre os resíduos de cisteína conservados N-terminal. Esta hipótese foi apoiada pela falta de sequência orthologs em Gram-positivas genomas de Lnt, o transferase N-acil Gram-negativas que forma de lipoproteínas triacylated⁵. No entanto, estudos recentes têm revelado lipoproteína triacylation em Gram-positivas Firmicutes essa falta de lnt, bem como três estruturas romance de lipoproteína de N-terminal, denominadas o peptidyl, super e N -acetil formas^{6,7 ,8}. Estas descobertas levantam questões sobre formas de lipoproteína possível para ser descoberto, ao lado de questões fundamentais sobre como estas lipoproteínas romance são feitas e que finalidade fisiológica ou vantagem das diversas formas transmitir. Além disso, eles demonstram claramente a incapacidade atual de genômica para prever a estrutura de lipoproteína. Com efeito, recentemente identificamos uma classe nova de transferases N-acil de lipoproteína, chamado Lit, de Enterococcus faecalis e Bacillus cereus que faz superformulário lipoproteínas⁹. Isto indica a necessidade de verificar experimentalmente a estrutura de lipoproteína, que pode ser um desafio devido à sua natureza extremamente hidrofóbica e limitados métodos disponíveis para caracterizar sua estrutura molecular.

Para facilitar estudos na indução de lipoproteína da resposta imune do hospedeiro, bem como a determinação estrutural N-terminal, adaptámos vários protocolos descritas anteriormente, a fim de purificar as lipoproteínas bacterianas e preparar o N-terminal tryptic lipopeptides para análise por MALDI-TOF MS^6,10,11,12. As lipoproteínas são enriquecidas usando uma fase estabelecida de Triton X-114 (doravante referido como surfactante ou TX-114) método, com otimização para remover contaminantes não-lipoproteínas e aumentar o rendimento de lipoproteína de particionamento. Estas lipoproteínas são adequadas para uso direto em ensaios TLR ou mais purificação por SDS-PAGE. Para MALDI-TOF MS, transferência das lipoproteínas para membrana de nitrocelulose prevê um andaime eficiente em situ digestão do trypsin, lavagem e eluição subsequente da superfície da membrana, resultando no altamente purificado lipopeptides N-terminal. Nitrocelulose foi mostrado para facilitar o manuseio de amostras e melhorar a cobertura de sequência para peptídeos altamente hidrofóbicos das proteínas de membrana integrais^13,14, bem como as lipoproteínas^9,10 . O método tem a vantagem adicional de fracionamento peptídeos baseados na polaridade, para que soluções de lavagem intermediária podem ser analisadas para identificação de proteínas de alta confiança simultaneamente com determinação estrutural N-terminal em uma única experiência . Este protocolo exclusivamente intencional sódio características aduto formação para promover a fragmentação de íon de pai para dehydroalanyl íons durante MS/MS, auxiliando na atribuição estrutural do estado de - acilação N. N-terminal é ambos a característica mais variável e chave relacionada ao reconhecimento TLR de lipoproteínas. Tomados em conjunto, este protocolo tem permitido estudos intensivos e reprodutíveis sobre as lipoproteínas, com diferentes etapas de purificação e determinação estrutural por MALDI-TOF MS facilmente adaptado dependendo o objetivo geral do experimento.

Protocolo

1. crescimento e Lysis da pilha

1. Cresce bactérias em 15 mL de caldo de tryptic soy (TSB) ou mídia similar ao final da fase exponencial (OD₆₀₀ de 1.0-1.5). Colheita de células por centrifugação, lave uma vez com solução tampão salino/EDTA (TBSE) e continuar com protocolo ou congelar até o uso.
   Nota: TBSE: 20 mM Tris-cloridrato (HCl), pH 8.0, 130 mM de cloreto de sódio (NaCl) e 5 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)). Modificação e expressão de lipoproteína podem ser influenciadas por condições de crescimento (por exemplo, acidez, salinidade, meios de crescimento) e fase de crescimento¹⁵. Crescimento da pilha pode ser escalado como desejado, mas 15 mL de células é recomendado para uma única preparação de lipoproteínas como biomassa em excesso pode diminuir o rendimento de lipoproteína. Uma preparação de 15 mL geralmente produz suficiente amostra para carregamento ideal de ~ 2-4 pistas em um padrão mini gel de SDS-PAGE.
2. Ressuspender as células em 800 μL TBSE com fluoreto de sulfonila fenilmetil 1mm (PMSF) e lisozima 0,5 mg/mL. Transferir a solução para um tubo de rosca microcentrifuga 2,0 mL com tampa de rosca e o-Ring e incube por 20 min a 37 ° C.
   Nota: Certas espécies não são suscetíveis à Lise por lisozima. Uma enzima lítica apropriada deve ser substituída para auxiliar na Lise.
3. Adicionar contas de zircônia/sílica ~ 800 μL 0,1 mm para o tubo e rompa as celulas agitando a velocidade máxima (7.000 rpm) em um homogeneizador de 5 ciclos de 30 s cada, com 2 min descansar no gelo entre cada ciclo.
4. Amostra de centrífuga a 3000 x g por 5 min a 4 ° C (a pelota grânulos e ininterrupta de células). Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 2,0 mL microcentrifuga e manter no gelo.
5. Adicionar 200 μL TBSE a remanescente e retornar para o homogeneizador para um ciclo adicional. Centrifugar (como acima) e combinar o sobrenadante com o sobrenadante anterior (deve ser o volume total de 800-1000 μL).

2. enriquecimento de lipoproteínas Particionando fase TX-114

1. Complementar o sobrenadante com surfactante TX-114 para uma concentração final de 2% (vol/vol) adicionando um volume igual de 4% (vol/vol) o surfactante em TBSE gelada e incubar no gelo por 1h, misturar por inversão cada ~ 15 min.
   Nota: Quando refrigerados, o sobrenadante e surfactante será miscíveis.
2. Transferir o tubo para banho maria a 37 ° C e incubar durante 10 min induzir a separação de fases. Centrifugar a amostra a 10.000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente para manter a separação entre bi-fásicos.
3. Delicadamente, pipetar fora a fase aquosa superior e descarte. Adicionar TBSE gelada para a fase inferior do surfactante para encher o tubo ao seu volume original e inverter para misturar. Incube no gelo por 10 min.
4. Transferir o tubo para banho maria a 37 ° C e incubar durante 10 min induzir a separação de fases e, em seguida, centrifugar a 10.000 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente.
5. Repita etapas 2.3-2.4 mais uma vez, para um total de 3 separações. Retire a fase aquosa superior e descarte.
6. Retire o chumbo das proteínas precipitados que se formou durante o curso de extracções (visíveis na parte inferior do tubo), adicionando-se 1 volume de TBSE gelada para a fase de surfactante. Centrifugar a 4 ° C a 16.000 x g por 2 min para proteína insolúvel de Pelotas.
   Nota: A amostra deve manter uma única fase. Se ocorrer separação de fases, re-calma amostra e centrifugar novamente. A pelota é geralmente composta de contaminantes não-lipoproteína, mas pode ser retida para posterior análise.
7. Imediatamente transferi o sobrenadante para um tubo de fresco microcentrifuga de 2,0 mL contendo 1250 μL de acetona 100%. Pipete acima e para baixo completamente para lavar a amostra da ponta, que vai ser viscoso. Misturar por inversão e incubar durante uma noite a-20 ° C para precipitar proteínas.
8. Centrifugar a amostra a 16.000 x g por 20 min em temperatura ambiente para lipoproteínas com atenção para a orientação do tubo de Pelotas. Lipoproteínas irão formar uma película fina, branca ao longo da parede exterior do tubo.
9. Pellet de lavar duas vezes com 100% de acetona. Decantar a acetona e deixar secar a amostra ao ar.
10. Adicionar 20 a 40 μL de 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 ou um padrão de tampão de amostra Laemmli SDS-PAGE¹⁶ e completamente Resuspenda pipetando para cima e para baixo contra a parede com as precipitado lipoproteínas. Raspe a lateral do tubo com a ponta da pipeta para desalojar as lipoproteínas.
    Nota: As lipoproteínas não se dissolverá em tampão Tris, mas prefiro formam uma suspensão.
    1. Armazenar as lipoproteínas a-20 º C até o uso.

3. SDS-PAGE, eletroblotting e coloração com Ponceau S

1. Lipoproteínas separadas por SDS-PAGE usando métodos padrão¹⁶.
   Nota: A percentagem de acrilamida gel apropriado pode variar dependendo de seu uso pretendido e tamanho de lipoproteínas. Aqui, lipoproteínas E. faecalis foram separadas mais um 10% gel de Tris-glicina, enquanto um gel Tris-tricine de 16,5% foi usado para a lipoproteína de e. coli menor Lpp¹⁷.
2. Transferi as lipoproteínas para uma membrana de nitrocelulose transferência usando um procedimento padrão eletroblotting.
   Nota: Uma transferência semi seca usando Bjerrum Schafer-Nielsen buffer mais 0,1% SDS foi realizada a 25 V, 1.3 mA para min 15¹⁸. Alternadamente, polivinilideno (PVDF) de difluoreto membrana pode ser usada, no entanto, como é mais hidrofóbica de nitrocelulose, pode reduzir eficiente eluição de lipopeptides hidrofóbico da membrana em etapas posteriores.
3. Transferi a membrana de nitrocelulose para um recipiente e cubra com a solução de Ponceau S (0,2% (p/v) Ponceau S em ácido acético a 5%). Rocha suavemente durante 5 minutos, ou até vermelho-rosa bandas são visíveis.
4. Decantar a solução de Ponceau S e Enxagúe cuidadosamente a membrana de nitrocelulose com dH₂O para remover o excesso de manchar.
   Nota: Bandas Ponceau manchada serão destain rapidamente. Se desaparecerem, bandas, repita o processo de coloração.
5. Com uma lâmina de barbear limpa, excisar a banda desejada e a transferência para um tubo de microcentrifugadora. Lavar três vezes com 1 mL de dH₂O para destain completamente a banda.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Loja a seção extirpada coberto com água a-20 ° C até o uso.
6. A seção de transferência para uma superfície limpa e com uma lâmina de barbear limpa, a tira de nitrocelulose com dados em pequenos pedaços de aproximadamente 1 mm x 1 mm. coletar os pedaços em um tubo de microcentrifuga de ligação baixa proteína de 0,5 mL.
7. Lave as peças duas vezes com 0,5 mL de 50mm recém-preparado bicarbonato de amónio (NH₄HCO₃), 7,8 de pH em água de grau de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC).

4. tryptic digestão, Lipopeptide extração de membrana de nitrocelulose, deposição em destino MALDI e aquisição de dados

1. Resuspenda pedaços de nitrocelulose em 20 μL de solução de tripsina em 50mm NH₄HCO₃, pH 7,8 em água de grau HPLC 20 μg/mL. Vórtice de misturar, em seguida girar brevemente para assegurar que todas as peças são totalmente cobertas pela solução tripsina. Cobrir a tampa do tubo usando a película de parafina para evitar a evaporação e incubar a digerir durante a noite a 37 ° C.
2. Girar a amostra a 16.000 x g, durante 30 s e remover o líquido por pipetagem.
   Nota: Isto remove trypsinized hidrofílicos peptídeos que podem ser examinados mais tarde por MALDI-TOF MS para identificação de proteínas.
3. Adicione 50 μL de 0,5% o ácido trifluoroacético (TFA) em água de grau HPLC. Vórtice para misturar e, em seguida, girar a amostra brevemente para assegurar que todas as peças são cobertas pela solução. Incube durante 10 minutos à temperatura ambiente. Remova o líquido por pipetagem.
   Atenção: TFA é prejudicial se inalado. Manipular com cuidado e use na coifa química. Evite o contacto com a pele.
4. Repita a etapa 4.3 com 50 μL de acetonitrilo de 10% em água de grau HPLC.
   Atenção: Acetonitrilo é prejudicial se inalado. Manipular com cuidado e use na coifa química. Evite o contacto com a pele.
5. Repita a etapa 4.3 com 50 μL de acetonitrilo de 20% em água de grau HPLC.
   Observação: Isso remove qualquer peptídeos hidrofóbicos moderadamente frouxamente ligados a nitrocelulose.
6. Eluir o lipopeptides firmemente ligados, adicionar 15 μL de 10 mg/mL acabadas α-cyano-4-hidroxicinâmicos ácido (CHCA) matriz dissolvido no clorofórmio-metanol (2:1, v/v) e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente com utilização do Vortex intermitente.
   1. Alternadamente, adicione 15 μL de clorofórmio-metanol para eluir lipopeptides e misture com a matriz em um momento posterior. Outras matrizes, tais como o ácido benzoico-2,5 (DHB), devem ser testados como alternativas a CHCA se obtêm-se resultados satisfatórios para uma composição específica lipopeptide.
      Atenção: Tanto clorofórmio e metanol são prejudiciais se inalado. Manipular com cuidado e use na coifa química. Evite o contacto com a pele.
   2. Opcional: Para promover o sódio aduto de formação, complementar a solução de CHCA em clorofórmio-metanol com aquosa de bicarbonato de sódio (NaHCO₃) a uma concentração final de 1 mM.
7. Gire a amostra brevemente. Com uma pipeta, transferi cuidadosamente o líquido para um novo tubo de microcentrifuga de ligação de baixa proteína. Esta solução irá conter a maior parte do N-terminal lipopeptides.
   Nota: A nitrocelulose pode parcialmente ou totalmente dissolver na solução de clorofórmio-metanol. Isto não afetará negativamente os resultados do MS e pode ser usado como um método alternativo para aumentar o retorno de lipopeptide. Membrana PVDF não se dissolverá na mesma maneira.
8. Deposite 1 μL do lipopeptides eluted com CHCA em um alvo MALDI aço polido.
   Nota: O clorofórmio-metanol evaporará rapidamente, deixando para trás cristalizado CHCA e lipopeptides. Um opcional segundo 1 μL alíquota pode ser depositado no mesmo local para aumentar a concentração da amostra. Clorofórmio-metanol pode propagar-se significativamente após a deposição sobre o alvo, e como tal, deve ter cuidado para evitar a mistura de amostra no alvo. É recomendável para depositar e atirar em vários pontos de cada amostra.
9. Seguir para a espectrometria de massa. Varredura de todas as áreas da mancha para lipopeptide sinal, especialmente se o local contém duas camadas de amostra, como a segunda camada pode empurrar o lipopeptides a orla exterior do local.
   Nota: A intensidade de laser partida recomendada é 25%, embora pode ser necessário aumentar a intensidade para adquirir o sinal e soma vários espectros (varreduras de 20 ou mais) para alcançar a relação sinal-ruído adequada. Aqui, os espectros foram adquiridos em um instrumento de MALDI-TOF-TOF (consulte a Tabela de materiais) usando um método de instrumento configurado de fábrica para a deteção de iões positivos do refletor na gama de m/z 700-3500. O instrumento foi calibrado com uma mistura de peptídeo tryptic albumina de soro bovino (BSA).

Resultados

Um esquema do protocolo é fornecido na Figura 1. A fração de lipoproteína enriquecido extraída de Enterococcus faecalis ATCC 19433 por TX-114 é mostrada na Figura 2. Para comparação, o padrão de bandas da fração proteína precipitado também é mostrado. Proteínas dessa fração foram confirmadas por MALDI-MS para ser altamente abundante contaminando as proteínas além de lipoproteínas (tabela 1

Discussão

O protocolo neste documento descreve dois estágios distintos de caracterização de lipoproteína: determinação estrutural e particionamento por MALDI-TOF MS de fase de enriquecimento por TX-114. Durante a extração de TX-114, centrifugação adicional remove proteínas contaminantes que precipitar durante este processo, seguido por precipitação de acetona para produzir altamente enriquecido de lipoproteínas. Limitando-se a escala de cada preparação para 15 mL no valor de células, várias amostras podem ser fac...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
0.01 mm Zirconia/silica beads	BioSpec Products	110791012
Acetic acid	EMD	AX0073-9
Acetone	EMD	AX0116-6
Acetonitrile	EMD	AX0142-6
Ammonium bicarbonate	Fluka Analytical	09830
BioTrace NT Nitrocellulose	PALL Life Sciences	66485
Bovine serum albumin (BSA) digest standard	Protea	PS-204-1
Chloroform	Acros Organics	423550025
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Fisher Scientific	BP118
HPLC Grade water	EMD	WX0008-1
Lysozyme	Fisher Scientific	BP535-1
Methanol	Sigma-Aldrich	34860
Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF)	Amresco	0754
Pierce trypsin protease	Thermo Scientific	90057
Ponceau S	Acros Organics	161470100
Protein LoBind Tube 0.5mL	Eppendorf	022431064
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	792519
Sodium chloride	Macron Fine Chemicals	7581-06
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma-Aldrich	299537
Tris-hydrochloride (HCl)	Fisher Scientific	BP152
Triton X-114	Sigma-Aldrich	93422
Tryptic soy broth (TSB)	BD	211822
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade)	Sigma-Aldrich	C8982
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
MagNALyser	Roche
Trans-Blot Turbo Transfer System	Bio-Rad
MALDI-TOF target	Bruker Daltonics
Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF	Bruker Daltonics		Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser