JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מתוקננת מפורט של תפוקה גבוהה מטוסי אף-16 rRNA-אמפליקון רצף. הפרוטוקול מציג פרוטוקול משולב, לובשי מדים, ריאלי וזולה החל באיסוף הנתונים ניתוחים דגימת צואה. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח של מספר רב של דוגמאות עם סטנדרטים קפדניים מספר פקדים.

Abstract

Microbiome מעיים אנושיים ממלאת תפקיד מרכזי בהגנה על התאים מפני פגיעה, עיבוד אנרגיה וחומרים מזינים, ובקידום חסינות. סטיות מן מה נחשב קומפוזיציה microbiota בריא (dysbiosis) עשוי לפגום תפקידים חיוניים מובילים לתנאים פיפטות. מאמצי מחקר האחרונות ומתמשכים מכוונת כלפי אפיון השיוכים בין הרכב מיקרוביאלי, מחלה ובריאות האדם.

ההתקדמות טכנולוגיות רצף תפוקה גבוהה מאפשרים אפיון ההרכב חיידקים במעיים. שיטות אלה כוללות 16 rRNA-אמפליקון רצף ורצף רובה ציד. מטוסי אף-16 rRNA-אמפליקון רצף משמש פרופיל taxonomical הרכב, ואילו רובה רצף מספקת מידע נוסף אודות הגן תחזיות, ביאור פונקציונלי. יתרון באמצעות שיטה רצף יישוב של rRNA 16 גנים באזור משתנה הוא עלותו נמוכות משמעותית לעומת רובה רצף. רצף הבדלים ג'ין rRNA מטוסי אף-16 משמשים כמו טביעת חיידקים כדי לזהות ולכמת taxa שונים בתוך דוגמה אישית.

המאמצים הבינלאומיים הגדולים נשאר תקנים עבור מטוסי אף-16 rRNA-אמפליקון רצף. עם זאת, מספר מחקרים מדווחים ממקור משותף של וריאציה הנגרמת על ידי אפקט אצווה. כדי למזער את האפקט הזה, פרוטוקולים במדים לאיסוף הדגימה, עיבוד, ורצף חייב ליישם. פרוטוקול זה מציע השילוב של פרוטוקולים משמש בהרחבה מתחיל מאוסף דגימת צואה ניתוח נתונים. פרוטוקול זה כולל גישה ישירה-PCR ללא עמודים, המאפשרת טיפול בו זמנית, הפקת דנ א מספרים גדולים של דגימות צואה, יחד עם ה-PCR הגברה של אזור V4. בנוסף, הפרוטוקול מתאר את הצינור ניתוח ומספק קובץ script באמצעות הגירסה העדכנית ביותר של QIIME (QIIME 2 גירסה 2017.7.0 ו- DADA2). פרוטוקול צעד אחר צעד זה נועד כדי להנחות את אלו המעוניינים ליזום את השימוש מטוסי אף-16 rRNA-אמפליקון רצף בצורה איתנה, הרבייה, קל לשימוש, מפורט.

Introduction

מרוכזים מאמצים נעשו כדי להבין טוב יותר microbiome גיוון ושפע, כמו היבט נוסף של לכידת ההבדל ונקודות הדמיון בין אנשים בריאים ופתולוגיים בתנאים. גיל2,3, גאוגרפיה4,5,סגנון חיים6ו מחלה5 הוצגו להיות מזוהה עם ההרכב של microbiome הבטן, אבל התנאים אוכלוסיות רבות טרם אושרו במלואן מאופיין. לאחרונה דווח כי ניתן לשנות את microbiome עבור יישומים טיפוליים-7,-8,-9. לכן, נוספים תובנות לגבי מערכת היחסים בין מצבים פיזיולוגיים שונים ההרכב מיקרוביאלי הוא הצעד הראשון לקראת אופטימיזציה של שינויים עתידיים פוטנציאליים.

השיטות התרבות חיידקים המסורתית מוגבלים על ידי תשואות נמוכות10,11, נתפסים כמו מדינה בינארי חיידקים איפה גם להציג בבטן או לא. תפוקה גבוהה מבוסס DNA רצף יש מהפכה אקולוגיה מיקרוביאלית, הפעלת לכידתו של כל חברי הקהילה מיקרוביאלי. עם זאת, רצף לקרוא אורך ואיכות נותרו מכשולים משמעותיים טקסונומיה מדויק הקצאה12. יתר על כן, ניסויים לפי תפוקה גבוהה עלולים לסבול מתופעות אצווה, איפה מדידות מושפעים הלא-ביולוגיים או לא מדעי משתנים13. בשנים האחרונות הוקמו מספר תוכניות כדי ללמוד את microbiome האנושית, כולל הפרויקט בטן אמריקאי, פרוייקט Microbiome האנושי של ארצות הברית (ארה ב) של הפרויקט MetaHIT הממלכה המאוחדת (בריטניה). היוזמות הללו יצרו כמויות אדירות של נתונים שאינם השוואה בקלות עקב חוסר עקביות הגישות שלהם. מגוון רחב של פרויקטים בינלאומיים כגון האיחוד הבינלאומי Microbiome האנושי, הפרויקט לסטנדרטים Microbiome האנושית בינלאומיים, ואת המכון הלאומי לתקנים וטכנולוגיה (NIST) ניסה להתמודד עם בעיות אלה,14 , ופיתח תקנים עבור מדידות microbiome אשר צריך לאפשר את ההישג של תוצאות אמינות הרבייה. המתוארים כאן הוא פרוטוקול משולב של מספר15,בשימוש רחב16 עבור מטוסי אף-16 rRNA תפוקה גבוהה רצף (16-seq) מתחיל דגימת צואה מקולקציית לצורך הערכה ניתוח נתונים. הפרוטוקול מתאר גישה ללא עמודים PCR, תוכנן במקור עבור חילוץ ישיר של צמח ה-DNA16, כדי לאפשר טיפול בו זמנית מספר גדול של צואה דגימות תוך זמן קצר יחסית עם איכות גבוהה מוגבר DNA עבור ממוקד קביעת רצף של אזור V4 משתנה חיידקים על פלטפורמה משותפת רצף. פרוטוקול זה שמטרתו להדריך מדענים מעוניין ליזום את השימוש מטוסי אף-16 rRNA-אמפליקון רצף בצורה איתנה, הרבייה, קל לשימוש, מפורט, באמצעות פקדי חשוב. יש פרוטוקול שלב מודרכים ומפורט אחר עשוי לצמצם את ההשפעה אצווה, ובכך יאפשר תוצאות דומות יותר רצף בין מעבדות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

אישור מוסרי לחקר הוענקה על ידי ועדת האתיקה שיבא מחקר מקומיים, כל השיטות בוצעו בהתאם ההנחיות הרלוונטיות והתקנות. הפרוטוקול קיבל החולה והסכמתו לחריגה מן הלוח המקומי ביקורת אתית, מאז החומר הצואתי ששימשו כבר הוגשו עד היסוד מיקרוביולוגיה כחלק של בדיקות קליניות, ללא מידע המאפשר זיהוי אישי, סבלני חוץ גיל, מגדר, ותוצאות מיקרוביאלי. נכתב, הסכמה מדעת היה המתקבלים מתנדבים בריאים, ועדת הבדיקה מוסדיים אישור המחקר. חלק את הדגימות כבר נכללו בניתוח הקודם1.

1. מדגם טיפול

  1. אוספים כ 5 מ מ2 השמצות (בערך בגודל של מחק עיפרון) של דגימת צואה טרייה עם מקלון סטרילי במבחן צינור (ראה טבלה של חומרים). לאחסן כל דגימות המכיל דגימות צואה ב-80 מעלות צלזיוס בתוך 24 שעות. הושארו צואה יכולים להישאר שם עד עיבוד נוסף.

2. הפקת דנ א

  1. להפשיר את החילוץ ופתרונות דילול בטמפרטורת החדר (ראה טבלה של חומרים).
  2. העברת הדגימה צואה לתוך אוסף ריק mL 2 צינור (ראה טבלה של חומרים). להתאים את גודל ספוגית מקל על ידי חיתוך באמצעות מספריים נקי כדי לאפשר סגירת שפופרת עם מינימום זיהום צולב. להוסיף 250 μL של פתרון מיצוי כל שפופרת אוסף המכיל את ספוגית צואתי ואת מערבולת לערבב.
  3. מחממים את הדגימות 10 דקות באמבט מים רותחים (95-100° C). להוסיף 250 μL של דילול פתרון לכל דגימה של מערבולת לערבב.
  4. מאחסנים צינורות 2 מ"ל המכיל את ה-DNA שחולץ הדגימה ב 4 º C.

3. PCR והכנת ספריית

עבור שלבים 3.1 ו- 3.2, עובד תחנת עבודה-PCR המספק נקי, תבנית סביבה אמפליקון חינם.

  1. תווית של תחל (טבלה 1) לפי ברקוד שלהם. לדלל כל תחל במים מזוקקים כפול (DDW) ריכוז μM 50 ו החנות ב-20 ° C.
  2. להשתמש בלוח 96-ובכן לתגובות PCR. כל צלחת יכול להכיל 32 מדגמים שונים, אשר מתויגות כברירת 32 תחל אינדקס שונים. להפשיר את פריימר לפנים, את צבעי יסוד הפוך 32 בטמפרטורת החדר, לדלל אותם כדי 5 μM.
  3. היכונו PCR התגובה mixes 100 תגובות (נפח סופי בכל טוב יהיה 20 μl) על ידי ערבוב μL 100 μM 5 פריימר לפנים, מיקס מאסטר PCR X 1 מ"ל 2 ו 400 μL DDW. הכניסו μL 15 של מיקס PCR הזה מכל קידוח (סה כ 96 וולס). להוסיף 1 μL של כל פריימר באינדקס ההפוך 5 μM 3 בארות שונות (32 שונים תחל ב- triplicates נותן סך של בארות 96).
  4. בתוך אזור ייעודי טרום-PCR, כלומר ספסל נקי תבנית, אמפליקון חינם, להוסיף 4 μL של כל מדגם ה-DNA שחולץ התגובה תערובות (כל מדגם ה-DNA שחולץ מוגבר שהפקידים — 32 דגימות לכל צלחת 96-ובכן).
  5. הפעל את ה-PCR עם ההגדרות הבאות: דנטורציה הראשונית של 94 º C למשך 3 דקות; ואחריו 35 מחזורי דנטורציה ב 94 ° C עבור 1 דקות, חישול ב 55 ° C 1 דקות, סיומת ב-72 מעלות עבור 1 דקות; ועם סיומת הסופי ב-72 מעלות למשך 10 דקות.
  6. על ספסל שונים, אשר תוגדר כאזור ייעודי פוסט-PCR, לשלב את כל התגובה PCR triplicate לתוך צינור אחסון יחיד (60 μL עבור דגימה).
  7. כדי להעריך את האיכות של ה-PCR amplicons, להפעיל 4 μL של כל תגובה משולב-PCR על ג'ל שהוכתמו ברומיד agarose 1% אתידיום. מתחת UV באורך גל של 260 ננומטר, amplicons חיובי יופיעו גודל של הלהקה הצפוי של bp 375-425. רק amplicons אלה ייכלל והשלבים הבאים.
    הערה: כל מדגם מוגבר במובן triplicate, כי כל מדגם מוגבר ב- 3 תגובות PCR שונות. לא תעשה זום

4. ספריית כימות וניקוי

  1. על מנת לקבל בריכת equimolar ריכוז של כל הדגימות PCR, לכמת כל אמפליקון על ידי ה-DNA נטושים כפול (dsDNA לכמת ריאגנט) חומצת גרעין נמכרות כתם (ראה טבלה של חומרים), מתאים כימות סימולטני של גדול כמות דגימות.
    הערה: מאז הטווח בגודל אמפליקון מפוקפקת, הסכום בפועל ב ננוגרם משמש לטעינת של ריכוז equimolar.
  2. שילוב 500 ננוגרם של כל מדגם לתוך צינור יחיד, סטרילי. מערבולת לערבב.
  3. הרץ μL 200 של הספרייה במאגר ג'ל שהוכתמו אתידיום ברומיד agarose 1%. לחלץ את הלהקות bp 375-425 מ הג'ל באמצעות ערכת חילוץ ג'ל על פי הוראות היצרן (ראה טבלה של חומרים) ו elute בספריה 80 μL DDW במאגר.
    הערה: הספרייה במאגר צריך להיות בגודל שנבחר כדי לצמצם מוצרים שאינם ספציפיים הגברה מהמארח הדנ א.
  4. למדוד את הריכוז ספריית הסופי באמצעות dsDNA רגישה מאוד גילוי הערכה על פי הוראות היצרן (ראה טבלה של חומרים). למדוד את גודל הספרייה מדויק באמצעות ערכת ההפרדה וניתוח רגישות גבוהה עבור ספריות DNA על-פי הוראות היצרן (ראה טבלה של חומרים).

5. רצף

  1. לדלל במאגר הספריה עד 7 בערב עם תוספת של 20% בקרת ספרייה (ראה טבלה של חומרים), לפי הפרוטוקול המכונה רצף.
  2. עבור רצף, מותאמים אישית לשימוש שנועדו לקרוא תחל זה ללא תשלום תחל הגברה V4 (ראה טבלה 1).
  3. פריימר רצף מעוצב מותאם אישית לשימוש שלישי שקורא הברקוד ב נוספים מחזור (ראה טבלה 1) ומייצר קריאות סוף-זיווג הבסיסים 175 אורך לכל כיוון, בהתאם למפרט היצרן.
  4. להפעיל את המכונה רצף ולקבל FASTQ קבצים על פי הפרוטוקול של היצרן.

6. עיבוד נתונים

  1. . סטיץ ' יחד ולעבד את קבצי FASTQ סוף-לזווג חופפים צינור curation נתונים מיושם QIIME 2 גירסה 2017.7.017. Demultiplex את הקריאות לפי מדגם ספציפי ברקודים.
  2. השתמש DADA218 עבור זיהוי משתנה (SVs) בקרת איכות, רצף. לחתוך קריאות-13 בסיסים מקצה 3' ובסיסים 15 5' מהקצה, להשליך קורא עם יותר מ- 2 שגיאות הצפוי. לזהות ולהסיר את כימרות באמצעות שיטת הקונצנזוס — כימרות מזוהים בדגימות באופן אינדיבידואלי, רצפים נמצאו chimeric בשבריר מספיק דוגמאות של יוסרו.
  3. לבצע סיווג טקסונומי SVs באמצעות מסווג Bayes נאיבי מצויד, על אוגוסט 2013 99% זהות Greengenes מאגר6, 175 זמן של קריאות של פריימר לפנים/הפוכה להגדיר.
  4. כל הדגימות לעומק של רצפי 2,146 להעלימה.
  5. השתמש Unweighted UniFrac למדידה של β-גיוון (בין מדגם גיוון19,20) על הדגימות דליל, כדי להימנע אפקט גודל המדגם.
  6. השתמש המטריצה המתקבלת מרחק כדי לבצע ניתוח נקודות הציון העיקריות (PCoA).
    הערה: קבצי script ומיפוי עיבוד הנתונים מסופקים כחומר משלים (חומר משלים 1 ו- 2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

איור סכמטי הפרוטוקול מוצג באיור1.

אספנו פרוספקטיבי דגימות צואה של מאושפזים חולים עם חשד שלשול זיהומיות. הדגימות הוגשו למעבדה למיקרוביולוגיה קלינית במרכז הרפואי שיבא בין פברואר מאי 2015, כפי שתואר לעיל1. דגימות ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מטוסי אף-16 rRNA-אמפליקון ורצף רובה metagenomics צברו פופולריות ב מיקרוביולוגיה קלינית יישומים21,22,23. טכניקות אלה הן יתרון ביכולת מוגברת שלהם לכידת taxa culturable ו- culturable, המספק נתונים אודות שפע יחסי של inoculum פתוגניים, ואת יכולתם לזהות ביתר דיוק זיהומיות polymicrobial טביעות אצבע...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמך בחלקה על ידי התוכנית-CORE (מעניקה מס 41/11), הקרן הלאומית למדע (גרנט מס 908/15), ואת אירופה קרוהן קוליטיס הארגון (ECCO).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
PrimersIntegrated DNA Technologies (IDT)
Extraction solutionSigma-AldrichE7526
Dilution solutionSigma-AldrichD5688
Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR KitKAPABIOSYSTEMSKK2601PCR Master mix
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent kitInvitrogenP7589dsDNA quantify reagent
MinElute Gel extraction kitQiagen28606
AgaroseAmresco0710-250G
Ultra Pure Water Dnase and Rnase FreeBiological Industries01-866-1A
Qubit dsDNA HS assay kitMolecular probesQ32854dsDNA detecting kit
High Sensitivity D1000Agilent TechnologiesScreen Tape 5067-5582separation and analysis
Screen Tape AssayAgilent TechnologiesReagents 5067-5583for DNA libraries
PhiX Control v3Illumina15017666control library
MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle)IlluminaMS-102-2003
Ethidium BromideAmrescoE406-10mL-TAM
2 mL collection tubesSARSTEDT72.695.400Safe Seal collection tubes
Plastic stick swab in PP test tubeSTERILE INTERIOR23117
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
PCR MachineApplied Biosystems2720 Thermal Cycler
Sequncing MachineIlluminaMiseq
PCR workstationBiosanUV-cleaner
scissors
vortexerScientific IndustriesVortex-Genie 2

References

  1. Braun, T., et al. Fecal microbial characterization of hospitalized patients with suspected infectious diarrhea shows significant dysbiosis. Scientific Reports. 7, 1088(2017).
  2. De Filippo, C., et al. Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 14691-14696 (2010).
  3. Yatsunenko, T., et al. Human gut microbiome viewed across age and geography. Nature. 486, 222-227 (2012).
  4. Rodriguez, J. M., et al. The composition of the gut microbiota throughout life, with an emphasis on early life. Microbial Ecology in Health and Disease. 26, 26050(2015).
  5. Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
  6. McDonald, D., et al. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. The ISME Journal. 6, 610-618 (2012).
  7. Bakken, J. S., et al. Treating Clostridium difficile infection with fecal microbiota transplantation. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9, 1044-1049 (2011).
  8. Khoruts, A., Dicksved, J., Jansson, J. K., Sadowsky, M. J. Changes in the composition of the human fecal microbiome after bacteriotherapy for recurrent Clostridium difficile-associated diarrhea. Journal of Clinical Gastroenterology. 44, 354-360 (2010).
  9. Nood, E. V., et al. Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile. The New England Journal of Medicine. 368, 407-415 (2013).
  10. Koplan, J. P., Benfari Ferraro, M. J., Fineberg, H. V., Rosenberg, M. L. Value of stool cultures. The Lancet. 316, 413-416 (1980).
  11. Platts-Mills, J. A., Liu, J., Houpt, E. R. New concepts in diagnostics for infectious diarrhea. Mucosal Immunology. 6, 876-885 (2013).
  12. Bokulich, N. A., et al. Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing. Nature Methods. 10, 57-59 (2013).
  13. Leek, J. T., et al. Tackling the widespread and critical impact of batch effects in high-throughput data. Nature Reviews Genetics. 11, (2010).
  14. Dubilier, N., McFall-Ngai, M., Zhao, L. Create a global microbiome effort. Nature. 526, 631-634 (2015).
  15. Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. PNAS. 108, 4516-4522 (2011).
  16. Flores, G. E., Henley, J. B., Fierer, N. A direct PCR approach to accelerate analyses of human-associated microbial communities. PloS One. 7, (2012).
  17. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
  18. Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13, 581-583 (2016).
  19. Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 71, 8228-8235 (2005).
  20. Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: An effective distance metric for microbial community comparison. The ISME Journal. 5, 169-172 (2011).
  21. Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PloS One. 10, e0117617(2015).
  22. Hiergeist, A., Gläsner, J., Reischl, U., Gessner, A. Analyses of intestinal microbiota: culture versus sequencing. ILAR Journal. 56, 228-240 (2015).
  23. Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13, 601-612 (2012).
  24. Salipante, S. J., et al. Rapid 16S rRNA next-generation sequencing of polymicrobial clinical samples for diagnosis of complex bacterial infections. PloS One. 8, e65226(2013).
  25. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME Journal. 6, 1621-1624 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

133Microbiome16 rRNAv4

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved