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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo manoscritto descrive un dettagliato protocollo standardizzato di alta-16S rRNA-amplicone sequenziamento. Il protocollo introduce un protocollo integrato, in uniforme, fattibile ed economico a partire dalla raccolta del campione fecale attraverso l'analisi dei dati. Questo protocollo consente l'analisi di un gran numero di campioni con rigorosi standard e diversi controlli.

Abstract

Il microbioma intestinale umano svolge un ruolo centrale nella protezione delle cellule dall'infortunio, nella trasformazione di energia e nutrienti e nel promuovere l'immunità. Deviazioni da quello che è considerato una composizione del microbiota sano (disbiosi) possono compromettere le funzioni vitali, portando a condizioni patologiche. Gli sforzi recenti e continue ricerche che sono state rivolte verso la caratterizzazione delle associazioni fra composizione microbica e la salute umana e la malattia.

Advances in tecnologie di sequenziamento ad alta velocità consente la caratterizzazione della composizione microbica dell'intestino. Questi metodi includono sequenziamento del 16S rRNA-amplicone e sequenziamento shotgun. Sequenziamento del 16S rRNA-amplicon viene utilizzata per analizzare la composizione tassonomica, mentre sequenziamento shotgun fornisce ulteriori informazioni su previsioni di gene e annotazione funzionale. Un vantaggio nell'utilizzo di un metodo di sequenziamento mirato della regione variabile del 16S rRNA gene è il suo costo notevolmente inferiore rispetto al sequenziamento shotgun. Differenze di sequenza nel gene del rRNA 16S vengono utilizzate come un'impronta digitale microbica per identificare e quantificare i diversi taxa all'interno di un singolo campione.

Principali iniziative internazionali hanno arruolato standard per sequenziamento del 16S rRNA-amplicon. Tuttavia, parecchi studi segnalano una fonte comune di variazione causato dall'effetto di batch. Per minimizzare questo effetto, in uniforme protocolli per la raccolta del campione, l'elaborazione e l'ordinamento deve essere implementato. Questo protocollo propone l'integrazione dei protocolli ampiamente utilizzati a partire dalla raccolta dei campioni fecali per analisi dei dati. Questo protocollo include un approccio diretto-PCR privo di colonna, che consente la gestione simultanea ed estrazione di DNA di un gran numero di campioni di feci, insieme con l'amplificazione di PCR della regione V4. Inoltre, il protocollo descrive la pipeline di analisi e fornisce uno script utilizzando l'ultima versione di QIIME (QIIME 2 versione 2017.7.0 e DADA2). Questo protocollo passo dopo passo si rivolge a chi è interessato a iniziare l'uso del sequenziamento del 16S rRNA-amplicone in modo robusto, riproduttivo, facile da usare e dettagliato guida.

Introduzione

Sono concentrato sforzi per comprendere meglio microbiome diversità e abbondanza, come un altro aspetto di catturare la differenza e le somiglianze tra individui in condizioni sane e patologiche. Età2,3, Geografia4, lifestyle5,6e malattia5 sono stati indicati per essere associati con la composizione del microbioma intestinale, ma molte condizioni e popolazioni non sono ancora state completamente caratterizzata. Recentemente è stato segnalato che il microbioma può essere modificato per applicazioni terapeutiche7,8,9. Di conseguenza, ulteriori approfondimenti sul rapporto tra varie condizioni fisiologiche e la composizione microbica sono il primo passo verso l'ottimizzazione di potenziali future modifiche.

I metodi tradizionali di coltura microbica sono limitati da basse rese10,11e sono concettualizzati come uno stato binario dove è un batterio presente nell'intestino o non. Alto-rendimento di sequenziamento del DNA ha rivoluzionato l'ecologia microbica, consentendo la cattura di tutti i membri della comunità microbica. Tuttavia, la sequenza legge lunghezza e qualità rimangono significativi ostacoli alla tassonomia accurata assegnazione12. Inoltre, esperimenti di basati ad alta velocità possono soffrire di effetti di batch, dove misure sono influenzate da variabili non biologico o non-scientifica13. Negli ultimi anni, diversi programmi sono stati istituiti per studiare il microbioma umano, compreso il progetto americano Gut, il progetto microbioma umano di Stati Uniti (US) e il progetto MetaHIT Regno Unito (UK). Queste iniziative hanno generato grandi quantità di dati che non sono facilmente paragonabili a causa di una mancanza di coerenza nei loro approcci. Una varietà di progetti internazionali come International Human Microbiome Consortium, il progetto di International Human Microbiome standard e il National Institute of Standards e tecnologia (NIST) ha tentato di risolvere alcuni di questi problemi14 e sviluppato standard per misure di microbiome che dovrebbero consentire il raggiungimento di risultati riproduttivi affidabile. È descritto qui un protocollo integrato di diversi metodi ampiamente usati15,16 per 16S rRNA high throughput sequenziamento (16S-seq) a partire dalla raccolta del campione fecale attraverso l'analisi dei dati. Il protocollo descrive un approccio privo di colonna PCR, originariamente progettato per estrazione diretta della pianta del DNA16, per abilitare la gestione simultanea di un numero elevato di fecale campioni in un tempo relativamente breve di alta qualità ha amplificato il DNA per mirati sequenziamento della regione V4 variabile microbica su una comune piattaforma di sequenziamento. Questo protocollo mira a guidare gli scienziati interessati a iniziare l'uso del sequenziamento del 16S rRNA-amplicone in modo robusto, riproduttivo, facile da usare, dettagliato, utilizzando controlli importanti. Avendo un protocollo guidate e dettagliate passo a passo può minimizzare l'effetto di batch e così vi permetterà risultati di sequenziamento più comparabili tra i laboratori.

Protocollo

Approvazione etica per lo studio è stato concesso dal comitato di etica Sheba locale ricerca e tutti i metodi sono stati eseguiti in conformità con le direttive e i regolamenti. Il protocollo ha ricevuto un'eccezione di consenso del paziente dal locale comitato di revisione etica, poiché il materiale fecale che sono stati utilizzati sono stati già presentati al nucleo di microbiologia come parte del workup clinico e senza informazioni identificabili paziente diverso da età, genere e microbiche risultati. Scritto, il consenso informato è stato ottenuto da volontari sani e Institutional Review Board ha approvato lo studio. Alcuni di quei campioni sono già stati inclusi in una precedente analisi1.

1. trattamento del campione

  1. Raccogliere una sbavatura di2 mm di circa 5 (circa le dimensioni di una gomma da matita) da un campione fecale fresco con un tampone sterile in un test tube (Vedi Tabella materiali). Memorizzare tutti i tamponi contenenti i campioni fecali a-80 ° C entro 24h. I tamponi fecali possono rimanere là fino al procedimento successivo.

2. DNA estrazione

  1. Scongelare le soluzioni di estrazione e diluizione a temperatura ambiente (Vedi Tabella materiali).
  2. Trasferimento il tampone fecale in un insieme vuoto 2 mL tubo (vedere Tabella materiali). Regolare le dimensioni di bastone di tampone di taglio utilizzando un paio di forbici pulita per consentire la chiusura del tubo con minima contaminazione incrociata. Aggiungere 250 μL di soluzione di estrazione per ogni provetta contenente il tampone fecale e vortexare per mescolare.
  3. Riscaldare i campioni per 10 min in un bagno di acqua bollente (95 – 100° C). Aggiungere 250 μL di soluzione di diluizione per ogni campione e vortexare per mescolare.
  4. Conservare i capillari di 2 mL contenente il DNA estratto e il tampone a 4 ° C.

3. PCR e preparazione di biblioteca

Ai punti 3.1 e 3.2, lavorare in una workstation PCR che fornisce pulito, ambiente privo di modello e amplicon.

  1. Etichettare i primer (tabella 1) secondo il loro codice a barre. Diluire ciascun primer in doppia acqua distillata (DDW) per un 50 μM concentrazione e conservare a-20 ° C.
  2. Utilizzare una piastra a 96 pozzetti per reazioni di PCR. Ogni piatto può contenere 32 campioni differenti, che sono contrassegnati da 32 primer indice diverso. Scongelare il primer forward e i 32 iniettori d'inversione a temperatura ambiente e diluirli a 5 μM.
  3. Preparare miscele di reazione di PCR per 100 reazioni (volume finale in ciascun pozzetto sarà 20 μl) con 100 µ l di primer in avanti di 5 μM, 1 mL 2 X PCR Master mix e 400 μL DDW. Mettere 15 μL di questo mix PCR in ciascun pozzetto (totale di 96 pozzetti). Aggiungere 1 μL di ogni primer indicizzata inverso 5 μM a 3 diversi pozzi (32 diversi primer in triplici copie dà un totale di 96 pozzetti).
  4. In una zona dedicata per pre-PCR, significato un banco pulito che è modello e amplicon gratis, aggiungere 4 μL di ciascun campione di DNA estratto a miscele di reazione (ogni campione di DNA estratto è amplificato in triplice copia — 32 campioni per piastra a 96 pozzetti).
  5. Eseguire PCR con le seguenti impostazioni: denaturazione iniziale di 94 ° C per 3 min; seguita da 35 cicli di denaturazione a 94 ° C per 1 min, ricottura a 55 ° C per 1 min e l'estensione a 72 ° C per 1 min; e un'estensione finale a 72 ° C per 10 min.
  6. Su un banco diverso, che viene definito come una zona dedicata per il post-PCR, combinare ogni reazione di PCR triplicate in un tubo singolo volume (60 µ l per campione).
  7. Per valutare la qualità degli ampliconi PCR, eseguire 4 μL di ogni reazione combinato-PCR su un gel di agarosio all'1% macchiato di bromuro di etidio. Sotto UV lunghezza d'onda di 260 nm, gli ampliconi positivi apparirà in una dimensione di banda prevista di 375 – 425 bp. Solo questi ampliconi saranno inclusi nei passaggi successivi.
    Nota: Ciascun campione viene amplificato in triplice copia, significato che ogni campione è amplificato in 3 differenti reazioni di PCR. Non scalabilità.

4. Biblioteca quantificazione e pulizia

  1. Al fine di ottenere una piscina di concentrazione equimolare di tutti i campioni PCR, quantificare ciascun amplicon di un DNA a doppio filamento (dsDNA quantificare reagente) fluorescente dell'acido nucleico macchia (Vedi Tabella materiali), adatto per la quantificazione simultanea di un grande quantità di campioni.
    Nota: Poiché la gamma di dimensioni del amplicon è equivoca, l'importo effettivo nei nanograms viene utilizzato per caricare una concentrazione equimolare.
  2. Combinare 500 ng di ciascun campione in un singolo tubo sterile. Vortice di mescolare.
  3. Eseguire 200 μL della biblioteca riunita su un gel di agarosio all'1% il bromuro di etidio-macchiato. Estrarre le bande di bp di 375 – 425 dal gel utilizzando un kit di estrazione del gel secondo le istruzioni del produttore (Vedi Tabella materiali) ed eluire la libreria riunita in 80 μL DDW.
    Nota: La libreria pool deve essere formato selezionato per ridurre i prodotti di amplificazione aspecifica da DNA ospite.
  4. Misurare la concentrazione finale libreria utilizzando un dsDNA altamente sensibile rilevare kit secondo le istruzioni del produttore (Vedi Tabella materiali). Misurare la dimensione di biblioteca accurato utilizzando un kit di separazione e analisi altamente sensibile per le librerie di DNA secondo le istruzioni del produttore (Vedi Tabella materiali).

5. sequenziamento

  1. Diluire la libreria riunita a 19 con aggiunta di libreria di controlli del 20% (Vedi Tabella materiali), secondo il protocollo di macchina di sequenziamento.
  2. Per il sequenziamento, progettato su misura uso leggere gli iniettori che sono gratuiti per i primer di amplificazione V4 (Vedi tabella 1).
  3. Primer di sequenziamento progettato personalizzato uso un terzo che legge il codice a barre in un ulteriore ciclo (Vedi tabella 1) e genera fine accoppiato letture di 175 basi di lunghezza in ogni direzione, secondo le specifiche del produttore.
  4. Eseguire la macchina di sequenziamento e ottenere file FASTQ secondo il protocollo del produttore.

6. elaborazione dei dati

  1. Cucire insieme ed elaborare i file FASTQ accoppiato-fine sovrapposti in una pipeline di curatela di dati implementato in QIIME 2 versione 2017.7.017. Demultiplex letture secondo campione specifici codici a barre.
  2. Utilizzare DADA218 per il rilevamento di variante (SVs) di controllo di qualità e sequenza. Troncare letture alle 13 basi dall'estremità 3' e 15 dall'estremità 5', scartare legge con più di 2 errori previsti. Identificare e rimuovere le chimere utilizzando il metodo del consenso — chimere vengono rilevate in campioni singolarmente e sequenze individuate chimerici in una frazione sufficiente di campioni vengono rimossi.
  3. Eseguire SVs classificazione tassonomica usando un classificatore Naive Bayes montato, addestrati su agosto 2013 99% identità Greengenes database6, per 175 lunghe letture e il set di primer Forward/Reverse.
  4. Rarefarsi tutti i campioni a profondità di 2.146 sequenze.
  5. Utilizzare UniFrac non ponderata per la misurazione della β-diversità (tra campione diversità19,20) sui campioni rarefatti, per evitare un effetto di dimensione del campione.
  6. Utilizzare la matrice delle distanze risultante per eseguire un'analisi di coordinate principali (PCoA).
    Nota: I file di script e mappatura di elaborazione dati vengono forniti come materiale supplementare (complementare materiale 1 e 2).

Risultati

Un'illustrazione schematica del protocollo è illustrato nella Figura 1.

Prospetticamente abbiamo raccolto campioni di feci da pazienti ospedalizzati con sospetta diarrea infettiva. Tali campioni sono stati presentati al laboratorio di microbiologia clinica presso il centro medico di Sheba tra febbraio e maggio 2015, come è stato descritto in precedenza1. Campioni di feci so...

Discussione

16S rRNA-amplicone e sequenziamento shotgun metagenomica hanno guadagnato popolarità in microbiologia clinica applicazioni21,22,23. Queste tecniche sono vantaggiose in loro una maggiore capacità di catturare taxa coltivabili e non coltivabili, fornendo dati relativi l'abbondanza relativa dell'inoculo di patogeno e la loro capacità di identificare più precisamente un polimicrobica infettiva 24di impronte digitali. I progressi nel campo ...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato in parte dal programma-CORE (concede n. 41/11), la Israel Science Foundation (concessione n. 908/15) e l'europeo di Crohn e colite organizzazione (ECCO).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
PrimersIntegrated DNA Technologies (IDT)
Extraction solutionSigma-AldrichE7526
Dilution solutionSigma-AldrichD5688
Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR KitKAPABIOSYSTEMSKK2601PCR Master mix
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent kitInvitrogenP7589dsDNA quantify reagent
MinElute Gel extraction kitQiagen28606
AgaroseAmresco0710-250G
Ultra Pure Water Dnase and Rnase FreeBiological Industries01-866-1A
Qubit dsDNA HS assay kitMolecular probesQ32854dsDNA detecting kit
High Sensitivity D1000Agilent TechnologiesScreen Tape 5067-5582separation and analysis
Screen Tape AssayAgilent TechnologiesReagents 5067-5583for DNA libraries
PhiX Control v3Illumina15017666control library
MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle)IlluminaMS-102-2003
Ethidium BromideAmrescoE406-10mL-TAM
2 mL collection tubesSARSTEDT72.695.400Safe Seal collection tubes
Plastic stick swab in PP test tubeSTERILE INTERIOR23117
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
PCR MachineApplied Biosystems2720 Thermal Cycler
Sequncing MachineIlluminaMiseq
PCR workstationBiosanUV-cleaner
scissors
vortexerScientific IndustriesVortex-Genie 2

Riferimenti

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