Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu el yazması yüksek üretilen iş 16S rRNA amplicon sıralama, detaylı bir standart protokolünü açıklar. Protokol dışkı örneği koleksiyonu veri analizleri ile başlayarak bir entegre, üniformalı, uygun ve ucuz protokol tanıttı. Bu protokol analiz örnekleri titiz standartları ile çok sayıda ve çeşitli denetimler sağlar.

Özet

İnsan bağırsak microbiome hücreleri yaralanmalara karşı korumak, enerji ve besin işleme ve dokunulmazlık teşvik merkezi bir rol oynar. Sağlıklı microbiota kompozisyon (dysbiosis) olarak kabul edilir ne gelen sapmalar hayati fonksiyonları için patolojik koşulları önde gelen bozabilen. Son ve devam eden araştırma çabalarının mikrobiyal kompozisyon ve insan sağlığı ve hastalık arasındaki ilişkilendirmeleri karakterizasyonu doğru yönetmen var.

Yüksek işlem hacmi sıralama teknolojileri gelişmeler bağırsak mikrobiyal kompozisyon karakterizasyonu etkinleştirin. Bu yöntemler 16S rRNA amplicon sıralama ve av tüfeği sıralamanın içerir. 16s rRNA amplicon sıralama av tüfeği sıralama gen Öngörüler ve fonksiyonel ek açıklama hakkında ek bilgi sağlarken taxonomical kompozisyon, profil için kullanılır. 16S rRNA gen değişken bölge hedefli sıralama yöntemini kullanarak bir av tüfeği sıralama için karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha düşük maliyet avantajdır. 16S rRNA gen farklılıkları sıra mikrobiyal parmak izi kadar tanımlamak ve farklı özellikleri tek tek bir örnek içinde ölçmek için kullanılır.

Büyük uluslararası çabalara 16S rRNA amplicon sıralama için standartlar kayıtlı. Ancak, çeşitli çalışmalarda ortak bir kaynaktan toplu etkisiyle neden varyasyon bildirin. Bu etki, üniformalı protokolleri için örnek koleksiyonu, en aza indirmek için işleme ve sıralamanın uygulanması gerekir. Bu iletişim kuralı veri analizleri için dışkı örneği koleksiyonundan başlayan genel olarak kullanılan protokolleri entegrasyonu öneriyor. Bu iletişim kuralını eşzamanlı kullanım ve DNA ekstraksiyon dışkı örnekleri, PCR güçlendirme V4 bölgesinin yanı sıra çok sayıda sağlar sütun-Alerjik, doğrudan-PCR yaklaşım içerir. Ayrıca, protokol analiz boru hattı açıklar ve QIIME (QIIME 2 yorum 2017.7.0 ve DADA2) en son sürümünü kullanarak bir komut dosyası sağlar. Adım adım bu protokolü ilgilenenler sağlam, üreme, kullanımı kolay ve ayrıntılı bir şekilde 16S rRNA amplicon sıralaması kullanımına başlatılıyor rehberlik etmek hedefleniyor.

Giriş

Yoğun çabaları microbiome çeşitlilik ve bolluk, fark ve sağlıklı ve patolojik koşullarda bireyler arasındaki benzerlikler yakalamak bir diğer yönü olarak daha iyi anlamak için yapılmıştır. Yaş2,3, coğrafi konum4, yaşam tarzı5,6ve hastalık5 gut microbiome kompozisyon ile ilişkili olduğu gösterilmiştir, ancak birçok koşul ve nüfus henüz tam olarak henüz karakterize. Son zamanlarda microbiome için tedavi uygulamaları7,8,9değiştirilebilir bildirilmiştir. Bu nedenle, çeşitli fizyolojik şartlarda ve mikrobiyal kompozisyon ilişkisi içine ek fikir potansiyel gelecek değişiklikler duruma getirilmesi doğru ilk adımdır.

Geleneksel mikrobiyal kültür yöntemleri düşük verimleri10,11tarafından sınırlı olduğunu ve ikili bir devlet ya da nerede bir bakteri kavramsallaştırma gut ya da mevcut. Yüksek işlem hacmi DNA tabanlı sıralama mikrobiyal ekoloji, mikrobiyal toplumun tüm üyelerinin yakalama etkinleştirme devrim yarattı. Ancak, sıra uzunluğu ve kalite önemli engelleri doğru taksonomi atama12kalır okuyun. Ayrıca, yüksek üretilen iş tabanlı deneyler nerede ölçümleri biyolojik olmayan veya bilimsel olmayan değişkenler13tarafından etkilenen toplu etkileri muzdarip olabilir. Son yıllarda, çeşitli programlar insan microbiome Amerikan Gut proje, Amerika Birleşik Devletleri (ABD) insan Microbiome projesi ve Birleşik Krallık (UK) MetaHIT projesi de dahil olmak üzere, eğitim için kurulmuştur. Bu girişimler tutarlılık onların yaklaşımlar eksikliği nedeniyle kolayca karşılaştırılabilir değildir verileri oluşturmuş. Bazı bu sorunları14 yönelik olarak uluslararası insan Microbiome Konsorsiyumu, uluslararası insan Microbiome Standartları Projesi ve National Institute of Standards ve Technology (NIST) gibi uluslararası projeler çeşitli çalıştı ve geliştirilen güvenilir üreme sonuçlar ulaşılmasına izin vermesi gerekir microbiome ölçümleri için standartları. Burada açıklanan 16S rRNA yüksek üretilen iş (16S-seq) sıralama veri analizleri aracılığıyla dışkı örneği koleksiyonundan başlatmak için birkaç genel olarak kullanılan yöntemlerin15,16 entegre bir protokoldür. Bitki DNA16doğrudan çıkarma için tasarlanan bir sütun ücretsiz PCR yaklaşım, protokolünü açıklar, dışkı çok sayıda eşzamanlı işlemeyi etkinleştirmek IÇIN örnekleri nispeten kısa sürede yüksek kalitede DNA hedef için güçlendirilmiş mikrobiyal değişken V4 bölgenin ortak bir sıralama platformu üzerinde sıralanıyor. Bu iletişim kuralı bilim adamları sağlam, üreme, kullanımı kolay, detaylı bir şekilde 16S rRNA amplicon sıralaması kullanımına başlatılıyor baktılar önemli denetimlerini kullanma kılavuzu amaçlamaktadır. Bir rehber eşliğinde ve detaylı adım-tarafından adım protokolü olan toplu etkisini en aza indirmek ve böylece daha karşılaştırılabilir sıralama sonuçları labs arasında izin verir.

Protokol

Etik onay çalışma için Sheba yerel araştırma Etik Komitesi tarafından kabul edildi ve tüm yöntemleri ilgili kurallara ve düzenlemelere uygun şekilde gerçekleştirilmiştir. İletişim kuralı bir hastanın rızası özel durum alınan yerel etik inceleme kurulu, kullanılan fekal madde beri zaten Mikrobiyoloji çekirdek klinik testleri ve yaş dışında hasta bilgilerinizi olmayan bir parçası olarak sunuldu toplumsal cinsiyet ve mikrobiyal sonuçları. Yazılı, aydınlatılmış onam sağlıklı gönüllülerden elde edildi ve kurumsal inceleme kurulu çalışma onayladı. Bu örnekleri bazıları zaten bir önceki analiz1' dahil ettik.

1. örnek işleme

  1. Toplamak bir yaklaşık 5 mm2 smear (kabaca bir Silgi boyutunu) testinde steril bir bez ile taze bir dışkı örnekten tüp ( Tablo malzemelerigörmek). 24 saat içinde-80 ° C'de dışkı örnekleri içeren tüm temizleme bezi saklayın. Dışkı temizleme bezi daha fazla işleme kadar orada kalabilir.

2. DNA ekstraksiyon

  1. Oda sıcaklığında çıkarma ve seyreltme çözümleri çözülme ( Tablo malzemelerigörmek).
  2. Transferi dışkı çubukla bir boş 2 mL koleksiyonu içine tüp ( Tablo malzemelerigörmek). Pamuklu çubuk sopa boyutu kesim tarafından tüp kapatma minimum Çapraz bulaşma ile etkinleştirmek için temiz bir makas kullanarak ayarlayın. Ayıklama çözüm 250 μL dışkı çubukla ve girdap karışımı içeren her koleksiyon tüp ekleyin.
  3. Örnekleri 10 min kaynar su banyosu için ısı (95-100° C). Seyreltme çözüm 250 μL her örnek ve girdap karışımı ekleyin.
  4. Ayıklanan DNA ve 4 ° C'de çubukla içeren 2 mL tüpler depolamak

3. PCR ve Kütüphane hazırlık

3.1 ve 3.2 adımlar için şablon ve amplicon ücretsiz ortam temiz, sağlayan bir PCR iş istasyonu içinde çalışır.

  1. Astar (Tablo 1) göre onların barkod etiket. Çift Kişilik distile su (DDW) bir 50 mikron konsantrasyon ve mağaza-20 ° C'de her astar sulandırmak
  2. 96-şey plaka PCR reaksiyonları için kullanın. Her plaka 32 farklı dizin astar tarafından etiketlenir 32 farklı örnekler içerebilir. İleri astar ve 32 ters astar oda sıcaklığında erimek ve onları için 5 mikron sulandırmak.
  3. PCR reaksiyon karışımları (her iyi son hacim 20 μl olacaktır) 100 reaksiyonlar için 5 mikron ileri astar, 1 mL 2 X PCR Master mix ve 400 μL DDW 100 μL karıştırarak hazırlayın. Bu PCR karışımı 15 μL her kuyuda (96 kuyu toplam) koymak. Her 5 mikron ters dizin oluşturulmuş astar 1 μL (32 farklı Astar boyaları triplicates verir toplam 96 Wells) 3 farklı wells için ekleyin.
  4. Pre-PCR adanmış bölgesinde reaksiyon karışımları için her ayıklanan DNA örneğinin 4 μL eklemek şablonu ve amplicon ücretsiz, temiz bir Bank anlamı (ayıklanan her DNA örneği nüsha güçlendirilmiş — 32 örnek / 96-şey plaka).
  5. PCR aşağıdaki ayarlarla çalıştırın: ilk denatürasyon 94 ° c 3 dakika; denatürasyon 94 ° C'de 35 döngüleri için 1 dk 1 dk ve uzantısı için 1 dk 72 ° C'de için 55 ° C'de tavlama, ardından; ve 10 dk 72 ° C'de son bir uzantısı.
  6. Bir post-PCR özel bölge olarak tanımlanacağını belirtiyor, farklı bir bankta bir tek birim tüp (örnek başına 60 μL) içine onaylatılacak her PCR reaksiyon birleştirin.
  7. PCR amplicons kalitesini değerlendirmek için üzerinde bir etidyum bromür lekeli % 1'özel jel her kombine-PCR reaksiyon 4 μL çalıştırın. Altında UV dalga boyu 260 nm, pozitif amplicons 375-425 bp beklenen grup boyutunda görüntülenir. Sadece bu amplicons sonraki adımda eklenecektir.
    Not: Her bir örneği her örnek içinde 3 farklı PCR reaksiyonları güçlendirilmiş onaylatılacak, anlamda güçlendirilmiş. Büyütmek değil.

4. Kütüphane miktar ve Temizleme

  1. Bir ekimolar toplama havuzu tüm PCR örnekleri almak için her amplicon bir çift iplikçikli DNA tarafından ölçmek (dsDNA ölçmek reaktif) floresan nükleik asit leke (bkz. Tablo reçetesi) geniş eşzamanlı miktar için uygun örnekleri miktarı.
    Not: amplicon boyutu aralığını belirsiz olduğu için nanogram gerçek tutarı ekimolar bir konsantrasyon yüklemek için kullanılır.
  2. Bir tek, steril tüp içine her örneğinin birleştirmek 500 ng. Girdap karıştırmak için.
  3. Havuza alınan Kütüphanesi 200 μL etidyum bromür lekeli % 1'özel jel üzerinde çalıştırın. Bir jel ekstraksiyon kiti üreticinin talimatlarına göre kullanarak jel 375-425 bp bantları ayıklamak ( Tablo malzemelerigörmek) ve havuza alınan kütüphanede 80 μL DDW elute.
    Not: Havuza alınan Kütüphane boyutu belirsiz amplifikasyon ürünleri ana bilgisayardan DNA azaltmak için seçili olmalıdır.
  4. Son derece hassas bir dsDNA kiti üreticinin talimatlarına göre algılama kullanarak son Kütüphane konsantrasyon ölçmek ( Tablo malzemelerigörmek). Üreticinin yönergelerine göre DNA kitaplıkları için son derece hassas bir ayrılık ve analiz kiti kullanarak doğru kitaplık boyutunu ölçmek ( Tablo malzemelerigörmek).

5. sıralama

  1. 7 de % 20 Denetim Kitaplığı eklenmesi ile havuza alınan kitaplığına seyreltik (bkz. Tablo reçetesi) sıralama makine protokolüne göre.
  2. Sıralama için tasarlanmış kullanımı özel (bkz. Tablo 1) V4 amplifikasyon astar ücretsizdir astar okuyun.
  3. Ek bir barkoda okur kullanım üçüncü özel tasarlanmış sıralama astar (bkz. Tablo 1) döngüsü ve üreticinin belirtimlerine göre her yöne doğru uzunlukta eşleştirilmiş uç okuma 175 üslerinin oluşturur.
  4. Sıralama makine çalıştırabilir ve FASTQ dosyaları üreticinin protokolüne göre elde edilir.

6. veri işleme

  1. Birleştirmek ve QIIME 2 sürüm 2017.7.017uygulanan veri küratörlüğü potansiyel örtüşen eşleştirilmiş uç FASTQ dosyalarında işlem. Örnek belirli barkodlar göre okuma demultiplex.
  2. DADA218 kalite kontrol ve sıra varyant (SVs) algılaması için kullanabilir. Okuma 3' sonundan itibaren 13 üsleri ve 15 üsleri 5' uç, üzerinden atma ile 2'den fazla beklenen hataları okur kesecek. Belirlemek ve uzlaşma yöntemiyle chimeras kaldırmak — chimeras örnekleri ayrı ayrı algılanır ve örnekleri yeterli bir kısmını chimeric bulundu dizileri kaldırılır.
  3. SVs taksonomik sınıflandırma bir Naive Bayes donatılmış Sınıflandırıcısı kullanarak gerçekleştirmek, Ağustos 2013 eğitim % 99 kimliği Greengenes veritabanı6, 175 için uzun ayarla ileri/geri astar ve okur.
  4. 2.146 dizileri derinliği için tüm örneklerini rarefy.
  5. Unweighted UniFrac β-çeşitlilik seyreltilmiş örnekleri (örnek çeşitlilik19,20) arası ölçüm için bir örnek boyutu etkisi önlemek için kullanın.
  6. Bir asıl koordinatları (PCoA) çözümlemesi için elde edilen mesafe matris kullanın.
    Not: Veri işleme komut dosyası ve eşleme dosyaları ek malzeme (ek malzeme 1 ve 2) sağlanır.

Sonuçlar

Şematik Protokolü'nün şekil 1' de gösterilen.

Biz prospektif şüpheli bulaşıcı ishal ile yatan hastalardan dışkı örneği toplanmıştır. Yukarıda açıklanan1olduğu gibi bu örnekleri Sheba Tıp Merkezi Şubat ve Mayıs 2015 yılları arasında Klinik Mikrobiyoloji Lab sunuldu. Dışkı örneği Klinik Mikrobiyoloji laboratuarında gerçekleştirilen gelenekse...

Tartışmalar

16s rRNA-amplicon ve metagenomics av tüfeği sıralamanın Klinik Mikrobiyoloji uygulamaları21,22,23popülerlik kazanmıştır. Bu teknikler artan yeteneklerini patojen inoculum ve yeteneklerini daha doğrusu bir polymicrobial bulaşıcı belirlemek için göreli bolluk hakkında veri sağlayan culturable ve culturable takson yakalamak için avantajlı olan 24parmak izi. Microbiome araştırma alanında gelişmeler çeşitli yaklaşımla...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser kısmen (No 41/11 verir)-CORE programı, İsrail Bilim Vakfı (grant No 908/15), Avrupa Crohn ve kolit organizasyon (ECCO) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
PrimersIntegrated DNA Technologies (IDT)
Extraction solutionSigma-AldrichE7526
Dilution solutionSigma-AldrichD5688
Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR KitKAPABIOSYSTEMSKK2601PCR Master mix
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent kitInvitrogenP7589dsDNA quantify reagent
MinElute Gel extraction kitQiagen28606
AgaroseAmresco0710-250G
Ultra Pure Water Dnase and Rnase FreeBiological Industries01-866-1A
Qubit dsDNA HS assay kitMolecular probesQ32854dsDNA detecting kit
High Sensitivity D1000Agilent TechnologiesScreen Tape 5067-5582separation and analysis
Screen Tape AssayAgilent TechnologiesReagents 5067-5583for DNA libraries
PhiX Control v3Illumina15017666control library
MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle)IlluminaMS-102-2003
Ethidium BromideAmrescoE406-10mL-TAM
2 mL collection tubesSARSTEDT72.695.400Safe Seal collection tubes
Plastic stick swab in PP test tubeSTERILE INTERIOR23117
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
PCR MachineApplied Biosystems2720 Thermal Cycler
Sequncing MachineIlluminaMiseq
PCR workstationBiosanUV-cleaner
scissors
vortexerScientific IndustriesVortex-Genie 2

Referanslar

  1. Braun, T., et al. Fecal microbial characterization of hospitalized patients with suspected infectious diarrhea shows significant dysbiosis. Scientific Reports. 7, 1088 (2017).
  2. De Filippo, C., et al. Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 14691-14696 (2010).
  3. Yatsunenko, T., et al. Human gut microbiome viewed across age and geography. Nature. 486, 222-227 (2012).
  4. Rodriguez, J. M., et al. The composition of the gut microbiota throughout life, with an emphasis on early life. Microbial Ecology in Health and Disease. 26, 26050 (2015).
  5. Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
  6. McDonald, D., et al. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. The ISME Journal. 6, 610-618 (2012).
  7. Bakken, J. S., et al. Treating Clostridium difficile infection with fecal microbiota transplantation. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9, 1044-1049 (2011).
  8. Khoruts, A., Dicksved, J., Jansson, J. K., Sadowsky, M. J. Changes in the composition of the human fecal microbiome after bacteriotherapy for recurrent Clostridium difficile-associated diarrhea. Journal of Clinical Gastroenterology. 44, 354-360 (2010).
  9. Nood, E. V., et al. Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile. The New England Journal of Medicine. 368, 407-415 (2013).
  10. Koplan, J. P., Benfari Ferraro, M. J., Fineberg, H. V., Rosenberg, M. L. Value of stool cultures. The Lancet. 316, 413-416 (1980).
  11. Platts-Mills, J. A., Liu, J., Houpt, E. R. New concepts in diagnostics for infectious diarrhea. Mucosal Immunology. 6, 876-885 (2013).
  12. Bokulich, N. A., et al. Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing. Nature Methods. 10, 57-59 (2013).
  13. Leek, J. T., et al. Tackling the widespread and critical impact of batch effects in high-throughput data. Nature Reviews Genetics. 11, (2010).
  14. Dubilier, N., McFall-Ngai, M., Zhao, L. Create a global microbiome effort. Nature. 526, 631-634 (2015).
  15. Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. PNAS. 108, 4516-4522 (2011).
  16. Flores, G. E., Henley, J. B., Fierer, N. A direct PCR approach to accelerate analyses of human-associated microbial communities. PloS One. 7, (2012).
  17. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
  18. Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13, 581-583 (2016).
  19. Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 71, 8228-8235 (2005).
  20. Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: An effective distance metric for microbial community comparison. The ISME Journal. 5, 169-172 (2011).
  21. Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PloS One. 10, e0117617 (2015).
  22. Hiergeist, A., Gläsner, J., Reischl, U., Gessner, A. Analyses of intestinal microbiota: culture versus sequencing. ILAR Journal. 56, 228-240 (2015).
  23. Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13, 601-612 (2012).
  24. Salipante, S. J., et al. Rapid 16S rRNA next-generation sequencing of polymicrobial clinical samples for diagnosis of complex bacterial infections. PloS One. 8, e65226 (2013).
  25. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME Journal. 6, 1621-1624 (2012).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyolojisay 133Microbiome16S rRNA s ralamasonraki nesil s ralamaV4 de i ken b lged k rneklerikitapl k haz rlama

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır