АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Эта рукопись описывает подробный стандартизированный протокол высок объём 16S рРНК ампликонами последовательности. Протокол вводит комплексной, униформе, осуществимым и недорогой протокол, начиная от фекальных проб путем анализа данных. Этот протокол позволяет анализ большого числа проб с жестким стандартам и несколько элементов управления.

Аннотация

Человека кишечная микрофлора играет центральную роль в защите клеток от повреждения, в обработке энергии и питательных веществ и в содействии иммунитета. Отклонения от того, что считается здоровой микробиоты композиция (дисбактериоз) могут ухудшить жизненно важных функций, приводит к патологическим условий. Недавние и текущие исследовательские усилия были направлены на квалификацию ассоциаций между микробный состав и здоровье человека и болезни.

Достижения в технологии высокопроизводительного секвенирования позволяют характеристика микробный состав кишки. Эти методы включают в себя 16S рРНК ампликонами последовательность и последовательность ружье. 16S рРНК ампликонами последовательности используется для профилирования Таксономический состав, в то время как дробовик виртуализации предоставляет дополнительные сведения о Джин предсказания и функциональной заметки. Преимущество в использовании целевых последовательности метода переменной региона гена 16S рРНК является его значительно более низкой стоимости, по сравнению с ружьем последовательности. Различия последовательности гена 16S рРНК используются как микробных отпечатков пальцев для идентификации и количественной оценки различных таксонов в индивидуальный образец.

Крупные международные усилия привлекаются стандартов для 16S рРНК ампликонами последовательности. Однако несколько исследований сообщают общий источник изменения, вызванные пакетного эффектом. Чтобы свести к минимуму этот эффект, силовых протоколы для сбора, обработки и последовательности должен быть реализован. Этот протокол предлагает интеграцию широко используемых протоколов, начиная от фекальных проб для анализа данных. Этот протокол включает в себя столбец бесплатно, прямой ПЦР подход, который позволяет одновременной обработки и экстракции ДНК большого количества фекальных проб, наряду с амплификации PCR V4 региона. Кроме того протокол описывает анализ конвейера и предоставляет сценарий, используя последнюю версию QIIME (QIIME 2 версия 2017.7.0 и DADA2). Этот шаг за шагом протокол предназначен для тех, кто заинтересован в инициировании использование 16S рРНК ампликонами последовательности в устойчивый, репродуктивной, простой в использовании, подробное руководство.

Введение

Концентрированные усилия лучше понять разнообразие микрофлора и изобилия, как еще один аспект захвата различия и сходства между людьми в условиях здоровой и патологические. Возраст2,3, география4, образ жизни5,6, болезни5 были продемонстрированы и ассоциироваться с составом микрофлора кишечника, но многие условия и население еще не были полностью характеризуется. Недавно сообщалось, что микрофлора может быть изменено для терапевтического применения7,8,9. Таким образом дополнительные понять связь между различными физиологическими условиями и микробный состав является первым шагом на пути оптимизации потенциальных будущих изменений.

Методы традиционной микробные культуры ограничены низкой урожайности на10,11и задумана как двоичные государства, где бактерии либо представить в кишечнике или нет. Высокой пропускной способностью на основе ДНК последовательности революционизировало микробной экологии, позволяя захват всех членов сообщества микроорганизмов. Однако последовательности чтения длины и качества сохраняются значительные барьеры для точной таксономии назначения12. Кроме того высокой пропускной способностью на основе экспериментов могут страдать от последствий партии, где измерения подвержены переменных небиологических или научно-13. В последние годы были созданы несколько программ для изучения человеческого микрофлора, включая американский кишки проекта, проект человека микрофлора Соединенные Штаты (США) и Соединенное Королевство (Великобритания) MetaHIT проект. Эти инициативы породили огромное количество данных, которые не являются легко сопоставимы ввиду отсутствия согласованности в их подходах. Целый ряд международных проектов, таких как международного консорциума по микрофлора человека, стандарты микрофлора человека международного проекта и Национальный институт стандартов и технологий США (NIST) пытался решить некоторые из этих вопросов14 и разработал стандарты для измерения микрофлора, которые должны позволить достижение надежного репродуктивного результатов. Описанные здесь — это интегрированный протокол несколько широко используются методы,1516 для 16S рРНК высокопроизводительного секвенирования (16S-seq) начиная от фекальных проб через анализ данных. Протокол описывает столбец бесплатно ПЦР подход, первоначально предназначенные для прямого извлечения завода ДНК16, возможность одновременной обработки большого количества фекальных проб в относительно короткие сроки с высоким качеством усиленный ДНК для целевых секвенирование микробной переменной региона V4 на общей платформе виртуализации. Этот протокол направлен на руководство ученых, заинтересованных в инициировании использование 16S рРНК ампликонами последовательности образом надежные, репродуктивной, простой в использовании, подробную, используя важных элементов управления. С гидом и подробно шаг за шагом протокол может свести к минимуму эффект партии и таким образом позволит более сопоставимые результаты секвенирования между лабораториями.

протокол

Этические утверждения для изучения местного комитета по этике Шеба исследований и все методы были исполнены в соответствии с соответствующих руководящих принципов и правил. Протокол получил исключение согласия пациента от местных этические Наблюдательный Совет, с фекалии, которые были использованы были уже представлены в микробиологии основной в рамках клинических реакционной и без личной информации пациента кроме возраста, Пол и микробиологических результатов. Автор, информированное согласие было получено от здоровых добровольцев и институциональных Наблюдательный Совет одобрил исследование. Некоторые из этих образцов уже были включены в предыдущий анализ1.

1. Пример обработки

  1. Собрать примерно 5 мазка2 мм (примерно размер карандашной резинки) из свежих фекальных образца стерильным тампоном в тесте трубки (см. Таблицу материалы). Храните все мазки, содержащие фекальных проб-80 ° c в течение 24 ч. Фекальный тампоны могут оставаться там до дальнейшей обработки.

2. ДНК добыча

  1. Оттепель добычи и разбавления решения при комнатной температуре (см. Таблицу материалы).
  2. Передача, фекальные тампоном в коллекцию пустого 2 мл трубки (см. Таблицу материалы). Отрегулируйте размер палку тампоном, резки его с помощью чистой ножницы для включения закрытия трубу с минимальным перекрестное загрязнение. Добавьте 250 мкл раствора извлечения каждой коллекции трубка, содержащая фекальных тампоном и вихревой смешивать.
  3. Образцы для 10 мин на кипящей водяной бане нагреть (95 – 100° C). Добавьте 250 мкл раствора разбавления каждого образца и вихревой смешивать.
  4. Хранить 2 мл пробирки, содержащие ДНК и тампоном на 4 ° C.

3. ПЦР и подготовка библиотеки

Для шагов 3.1 и 3.2 работают в ПЦР рабочую станцию, которая обеспечивает чистый, шаблон и amplicon свободной среде.

  1. Грунтовки (Таблица 1) согласно их штрих-кода ярлык. Разбавить каждый грунт в двойной дистиллированной воде (DDW) до 50 мкм концентрации и хранить при-20 ° C.
  2. Используйте 96-луночных пластины для реакций PCR. Каждая пластина может содержать 32 различных образцов, которые помечены на 32 разных индекс грунтовки. Оттепель вперед грунтовка и 32 обратный грунты при комнатной температуре и их разбавляют до 5 мкм.
  3. Подготовка смеси реакции PCR для 100 реакций (окончательный объем в каждой скважине будет 20 мкл) путем смешивания 100 мкл 5 мкм вперед грунт, 1 мл 2 X ПЦР Мастер микс и 400 мкл DDW. Положите 15 мкл этой смеси ПЦР в каждой скважине (в общей сложности 96 скважин). Добавьте 1 мкл каждого обратного индексированных праймер 5 мкм до 3 различных скважин (32 различные грунтовки в triplicates дает в общей сложности 96 скважин).
  4. В pre ПЦР выделенную зону, означает чистый скамейке, шаблон и amplicon бесплатно, добавить 4 мкл каждого извлеченного образца ДНК реакция смеси (каждой извлеченной образец ДНК усиливается в трех экземплярах — 32 выборок на 96-луночных пластины).
  5. Запуск ПЦР со следующими параметрами: первоначальный денатурации 94 ° C 3 мин; После 35 циклов денатурации на 94 ° C за 1 мин, отжиг при температуре 55 ° C за 1 мин и расширение в 72 ° C в течение 1 мин; и окончательное расширение при 72 ° C для 10 мин.
  6. На лавочке другой, который будет определен как пост ПЦР выделенную зону, объединить каждого тройные реакции PCR в одном томе трубку (60 мкл на сэмпл).
  7. Чтобы оценить качество PCR ампликонами, запустите 4 мкл каждого комбинированные PCR реакции на ethidium окрашенных бромида 1% агарозном геле. При длине волны УФ 260 Нм, позитивные ампликонов появятся в размер ожидаемого диапазона 375 – 425 ВР. Только эти ампликонов будут включены в последующие шаги.
    Примечание: Каждый образец усиливается в трех экземплярах, означает, что каждый образец усиливается в 3 различных реакциях PCR. Не масштабировать до.

4. Библиотека количественной и очистка

  1. Для того чтобы получить пул эквимолярных концентрации всех образцов ПЦР, количественно каждый ампликон двойной мель ДНК (dsDNA количественно реагент) флуоресцентных нуклеиновых кислот пятна (см. Таблицу материалы), подходит для одновременного количественного определения большой количество образцов.
    Примечание: Поскольку диапазон размеров amplicon двусмысленно, фактический объем в нг используется для загрузки эквимолярных концентрации.
  2. Комбинат 500 нг каждого образца в единый, стерильных трубку. Вихрь смешивать.
  3. Запуск 200 мкл пуле библиотеки на геле агарозы 1% бромид Ethidium-витражи. Извлечение 375 – 425 bp полос из геля, используя набор извлечения геля согласно инструкциям производителя (см. Таблицу материалы) и элюировать Объединенные библиотеки в 80 мкл DDW.
    Примечание: Объединенные библиотеки должен быть размер выбранного уменьшить усиление неспецифической продуктов от хоста ДНК.
  4. Измерять концентрацию окончательный Библиотека, с помощью высокочувствительных dsDNA обнаружения комплект согласно инструкциям производителя (см. Таблицу материалы). Измерить размер Точная библиотеки с помощью высокочувствительных разделения и анализа kit для библиотек ДНК согласно инструкциям производителя (см. Таблицу материалы).

5. последовательность

  1. Разбавить Объединенные библиотеки до 7 вечера с добавлением 20% управления библиотеки (см. Таблицу материалы), согласно протоколу машины виртуализации.
  2. Для виртуализации, использование специально читать грунты, которые являются бесплатными для праймеров амплификации V4 (см. таблицу 1).
  3. Использование третьего пользовательских разработана последовательность грунт, который считывает штрих-код в дополнительный цикл (см. таблицу 1) и генерирует паре конец читает 175 баз в длину в каждом направлении, в соответствии со спецификациями изготовителя.
  4. Запустите машину секвенирования и получить файлы FASTQ по данным производителя протокол.

6. обработка данных

  1. Сшить и обработки перекрывающихся паре конец FASTQ файлов в конвейере курирование данных реализовано на QIIME 2 версия 2017.7.017. Демультиплексирования читает согласно образца конкретных штрих-кодов.
  2. Использование DADA218 для контроля качества и последовательности обнаружения вариант (СВС). Усечение читает на 13 баз из 3' конца и 15 баз от 5' конца, отменить читает с более чем 2 ожидаемые ошибки. Выявлять и устранять химер, используя метод консенсуса — химер обнаружены в пробах индивидуально, и последовательности, нашли химерных в достаточной доли образцы удаляются.
  3. Выполнять СВС таксономической классификации с использованием классификатора Байеса установлены, обучение на Август 2013 99% личность Greengenes базы данных6, 175 долго читает и реверса грунтовка набор.
  4. Разредить все образцы глубину 2146 последовательностей.
  5. Использование невзвешенных UniFrac для измерения β-разнообразия (между образца разнообразия19,20) на разреженной пробы, чтобы избежать эффекта размер выборки.
  6. Использование результирующей матрицы расстояние для выполнения анализа главных координаты (PCoA).
    Примечание: Файлы скрипта и сопоставления обработки данных предоставляются как дополнительный материал (дополнительный материал 1 и 2).

Результаты

На рисунке 1показано схематическое изображение протокола.

Проспективно мы собрали образцы стула от госпитализированных больных с подозрением инфекционной диарее. Эти образцы были представлены клинической лаборатори...

Обсуждение

16S рРНК ампликонами и метагеномики ружье последовательности завоевали популярность в клинической микробиологии приложения21,22,23. Эти методы являются выгодным в их повышенная способность захватить culturable и не culturable таксонов, предоставление данных о относ...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа частично поддержали программу-CORE (гранты № 41/11), Израиль научный фонд (Грант № 908/15) и Европейской крона и колит Организации (ЕСОП).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
PrimersIntegrated DNA Technologies (IDT)
Extraction solutionSigma-AldrichE7526
Dilution solutionSigma-AldrichD5688
Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR KitKAPABIOSYSTEMSKK2601PCR Master mix
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent kitInvitrogenP7589dsDNA quantify reagent
MinElute Gel extraction kitQiagen28606
AgaroseAmresco0710-250G
Ultra Pure Water Dnase and Rnase FreeBiological Industries01-866-1A
Qubit dsDNA HS assay kitMolecular probesQ32854dsDNA detecting kit
High Sensitivity D1000Agilent TechnologiesScreen Tape 5067-5582separation and analysis
Screen Tape AssayAgilent TechnologiesReagents 5067-5583for DNA libraries
PhiX Control v3Illumina15017666control library
MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle)IlluminaMS-102-2003
Ethidium BromideAmrescoE406-10mL-TAM
2 mL collection tubesSARSTEDT72.695.400Safe Seal collection tubes
Plastic stick swab in PP test tubeSTERILE INTERIOR23117
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
PCR MachineApplied Biosystems2720 Thermal Cycler
Sequncing MachineIlluminaMiseq
PCR workstationBiosanUV-cleaner
scissors
vortexerScientific IndustriesVortex-Genie 2

Ссылки

  1. Braun, T., et al. Fecal microbial characterization of hospitalized patients with suspected infectious diarrhea shows significant dysbiosis. Scientific Reports. 7, 1088 (2017).
  2. De Filippo, C., et al. Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 14691-14696 (2010).
  3. Yatsunenko, T., et al. Human gut microbiome viewed across age and geography. Nature. 486, 222-227 (2012).
  4. Rodriguez, J. M., et al. The composition of the gut microbiota throughout life, with an emphasis on early life. Microbial Ecology in Health and Disease. 26, 26050 (2015).
  5. Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
  6. McDonald, D., et al. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. The ISME Journal. 6, 610-618 (2012).
  7. Bakken, J. S., et al. Treating Clostridium difficile infection with fecal microbiota transplantation. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9, 1044-1049 (2011).
  8. Khoruts, A., Dicksved, J., Jansson, J. K., Sadowsky, M. J. Changes in the composition of the human fecal microbiome after bacteriotherapy for recurrent Clostridium difficile-associated diarrhea. Journal of Clinical Gastroenterology. 44, 354-360 (2010).
  9. Nood, E. V., et al. Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile. The New England Journal of Medicine. 368, 407-415 (2013).
  10. Koplan, J. P., Benfari Ferraro, M. J., Fineberg, H. V., Rosenberg, M. L. Value of stool cultures. The Lancet. 316, 413-416 (1980).
  11. Platts-Mills, J. A., Liu, J., Houpt, E. R. New concepts in diagnostics for infectious diarrhea. Mucosal Immunology. 6, 876-885 (2013).
  12. Bokulich, N. A., et al. Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing. Nature Methods. 10, 57-59 (2013).
  13. Leek, J. T., et al. Tackling the widespread and critical impact of batch effects in high-throughput data. Nature Reviews Genetics. 11, (2010).
  14. Dubilier, N., McFall-Ngai, M., Zhao, L. Create a global microbiome effort. Nature. 526, 631-634 (2015).
  15. Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. PNAS. 108, 4516-4522 (2011).
  16. Flores, G. E., Henley, J. B., Fierer, N. A direct PCR approach to accelerate analyses of human-associated microbial communities. PloS One. 7, (2012).
  17. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
  18. Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13, 581-583 (2016).
  19. Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 71, 8228-8235 (2005).
  20. Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: An effective distance metric for microbial community comparison. The ISME Journal. 5, 169-172 (2011).
  21. Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PloS One. 10, e0117617 (2015).
  22. Hiergeist, A., Gläsner, J., Reischl, U., Gessner, A. Analyses of intestinal microbiota: culture versus sequencing. ILAR Journal. 56, 228-240 (2015).
  23. Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13, 601-612 (2012).
  24. Salipante, S. J., et al. Rapid 16S rRNA next-generation sequencing of polymicrobial clinical samples for diagnosis of complex bacterial infections. PloS One. 8, e65226 (2013).
  25. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME Journal. 6, 1621-1624 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

13316SV4

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены