JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כרומטין ולגמישות מופיע להיות מעורב הפוטנציאל ההתפתחותי של blastomeres. עם זאת, לא ידוע אם כרומטין ולגמישות יכול לשמש כאינדקס אמין עבור פוטנציאל התפתחותי של העוברים. . הנה, תואר מערכת ניסיונית שבה כרומטין הערכה ולגמישות מופרות יכולים לפתח את הקדנציה.

Abstract

הדמיה חיה הוא כלי רב עוצמה המאפשר הניתוח של האירועים המולקולריים המתרחשים במהלך ontogenesis. לאחרונה, ולגמישות כרומטין או פתיחות הוכח להיות מעורב בהם פוטנציאל התמיינות של תאי גזע עובריים pluripotent. בעבר דווח כי לעומת עם תאי גזע עובריים, מופרות הנמל מבנה מאוד התיר כרומטין, מציעה את השיוך שלו עם totipotency שלהם. עם זאת, עד עכשיו, זה לא טופלה אם זה מאוד התיר/פתיחה הכרומטין חשוב עבור עובריים פוטנציאל התפתחותי. במחקר הנוכחי, כדי לבדוק השערה זו, מערכת ניסויית ב אשר מופרות נותחו על ידי קרינה פלואורסצנטית התאוששות לאחר הלבנת-צילום יכול לפתח למונח ללא נזק משמעותי פותחה. חשוב לציין, מערכת ניסויית זו צריך רק תנור פלייט-תרמוס בנוסף לייזר קונפוקלי מיקרוסקופ סורק. ממצאי מחקר זה מראים מהגמילה פלורסצנטיות לאחר הלבנת-צילום ניתוח ניתוח (FRAP) יכול לשמש כדי לחקור האירועים המולקולריים כרומטין zygotic חשוב להתפתחות מלא לטווח.

Introduction

לאחר ההפריה, הכרומטין משתנה באופן דינמי, הכרומטין zygotic מכן הוקמה בסופו של דבר1,2. בתקופה זו, pronuclei אבהית, החלבון כרומטין דומיננטי משתנה מ-? מה לעזאזל קרה לתוך היסטון. כרומטין וכתוצאה מכך שונה מאוד מזו של תאי זרע, נקבה oocytes בכמה נקודות (למשל, הרכב משתנה היסטון, שינוי היסטון). לפיכך, בנוי כרומטין zygotic נחשב חשוב להתפתחות עוברית עוקבות. עם זאת, למרות המאמצים לחשוף את הפרטים של הכרומטין zygotic על פני תקופות ארוכות, שיטות להערכת איכות מופרות או לחזות את התפתחותם מלא לטווח בשלב אחד-תא על-ידי ניתוח שלהם הכרומטין. מעולם לא הייתי הקים.

במחקר הקודם, הוא גילה כי מופרות יש מבנה של כרומטין התיר מאוד3. כיום, ולגמישות כרומטין או פתיחות הוא האמין להיות גורם חשוב עבור פוטנציאל תאי גזע עובריים (ES)4התמיינות. ES תאים לא מוצג הומוגניות בטבע, אבל הם מעדיפים הטרוגניות; במושבות תא ES, כמה transiently רוכשים את פוטנציאל התמיינות גבוהה יותר דומה blastomeres של שני תאים בשלב עוברי. במהלך המעבר הזה לתוך התא-השני כמו המדינה, כרומטין ולגמישות ב ES תאים שינויים לתוך מה משולה עם שני תאים בשלב עוברי5. לפיכך, כרומטין ולגמישות נראה להיות חשוב עבור פוטנציאל התמיינות וזה אפשרי בהרחבה פתח כרומטין ב מופרות שימושית לצורך הערכת הפוטנציאל ההתפתחותי zygotic.

הדמיה חיה הוא כלי רב עוצמה המאפשר הניתוח של האירועים המולקולריים המתרחשים במהלך ontogenesis מכיוון ששיטה זו מאפשרת פיתוח עוקבות, אפילו מלא לטווח פיתוח6. בתור אחד של שיטות הדמיה בשידור חי, שימש FRAP ניתוח לבחון כרומטין ולגמישות של העוברים, ES תאים3,4,5. אם ניתן לנתח אותם ולגמישות כרומטין zygotic על ידי ניתוח FRAP ללא השפעה מזיקה על פיתוח מלא לטווח, זה עשוי להיות כלי רב ערך עבור הערכת איכות העוברים בשלב אחד-cell. עם זאת, ההשפעות על פיתוח מלא לטווח בשיטה ניסויית זו לא נבדקו. לאחרונה פותחה מערכת ניסויית באמצעות FRAP להעריך כרומטין zygotic ולגמישות. משום שזוהי מערכת תצפית חדשה עבור מופרות, זה היה כינה FRAP zygotic (zFRAP). zFRAP לא השפיעה באופן ביקורתי פיתוח מלא לטווח ומאז דווח במקום7. בדו ח זה, מתואר הפרוטוקול של שיטה ניסויית זו.

Protocol

מחקר זה בוצע בהתאמה קפדנית עם ההמלצות במדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה של האוניברסיטה של יאמאנאשי. הפרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים של האוניברסיטה של יאמאנאשי (מספר היתר: A24-50). כל הניתוחים בוצעו בהרדמה tribromoethanol, נעשה כל מאמץ כדי למזער את הסבל. הצגה מאוירת של נהלים, בזמן-טבלת מוצגים באיור 1 ו- 1 בטבלה, בהתאמה.

1. הכנת RNA שליח (חוץ גופית של שעתוק של eGFP-ויזת עבודה H2B mRNA)

  1. Linearize µg 5 של תבנית ה-DNA pTOPO-eGFP-ויזת עבודה H2B3,7 עם 30 U של לא אני ב µL 50 ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  2. איסוף µL 1.5 של DNA מתעכל לאישור אם מתעכל לחלוטין על ידי אלקטרופורזה.
    1. החל 1.5 µL µL 3-5 של DNA מעוכל עם טעינת לצבוע אל הבאר של ג'ל agarose 2%, בהתאמה, ובכפוף אלקטרופורזה.
      הערה: אם מתעכל לחלוטין, להקה אחת (כ- 5 kb) הוא ציין. DNA מעוכל משמש פקד, אשר מופיע במיקום שונה.
  3. להוסיף µL 151.5 ddH2O ל- 200 µL באלכוהול פנול/כלורופורם/isoamyl (25:24:1) שנותרו מתעכל הדנ א.
    1. מערבבים היטב על ידי מערבולת.
    2. צנטריפוגה-המהירות המרבית למשך 15 דקות.
  4. לשחזר את תגובת שיקוע ולאחר מכן להוסיף 200 µL של כלורופורם.
    1. מערבבים היטב על ידי מערבולת.
    2. צנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך 15 דקות.
  5. לשחזר את תגובת שיקוע ולאחר מכן להוסיף 20 µL של 3 מ' סודיום אצטט ו 1.5 µL של ethachinmate.
    1. מערבבים היטב על ידי מערבולת.
    2. הוסף µL 550 של 100% אתנול, ואז לערבב נמרצות על ידי מערבולת.
    3. צנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך 15 דקות.
    4. למחוק את תגובת שיקוע ולאחר מכן לשטוף את גלולה עם 70% אתנול.
    5. יבש בגדר אידוי למשך 5-10 דקות.
  6. להמיס פלסמיד זירז DNA ב 8 µL של נוקלאז ללא מים.
  7. להעריך פלסמיד ריכוז (ריכוז הצפוי הוא על 300-500 ng/µL) עם nanodrop על-ידי ביצוע ההוראות של היצרן.
  8. לבצע תמלול במבחנה של mRNA קידוד eGFP-ויזת עבודה H2B עם µg 1 של ה-DNA מטוהרים כתבנית ב 20 µL של התגובה הכולל אמצעי אחסון על-ידי ביצוע ההוראות של היצרן.
    1. לאחר במבחנה שעתוק, להוסיף μL 36 של מים ולאחר מכן לשחזר 1.5 µL µL 56 של mRNA מסונתז לניתוח על ידי אלקטרופורזה (כפי ללא poly A).
  9. בצע poly A עוקב עבור mRNA מסונתז באמצעי אחסון התגובה µL 100 לפי הוראות היצרן.
  10. להוסיף 60 µL של ליתיום כלוריד משקעים פתרון פולי mRNA זנב של eGFP-ויזת עבודה H2B, ואז מערבבים היטב.
    1. מגניב ב-30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    2. צנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך 15 דקות.
    3. למחוק את תגובת שיקוע ולאחר מכן לשטוף את גלולה עם 70% אתנול.
    4. יבש בגדר אידוי למשך 5-10 דקות.
  11. להמיס את גלולה עם 20 µL של מים נטולי נוקלאז על ידי חימום ב 55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  12. להעריך את ריכוז mRNA precipitated עם nanodrop. לדלל כדי 500 ng/µL עם מים ללא נוקלאז וחנות ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.
  13. לאשר המועדף לייצור mRNA; נושא 1 µL של mRNA עם/בלי (להשיג ב 1.8.1 והשלבים 1.12, בהתאמה) פוליפוני זנב מעורבב עם 1.5 µL של 0.1 mg/mL אתידיום ברומיד µL 3 של הטעינה דוגמת צבע לניתוח אלקטרופורזה. אמצעי האחסון השימושית היה 5.5 µL.
    הערה: אם A פולי עוקב הצליח, הלהקה שהוסטו בהשוואה של mRNA בלי פולי עוקב להתייחס (איור 2 א).

2. אופן ההכנה של עיקור עכברים זכרים

  1. שוקלים עכברים גברית ICR בגיל 8-12 חודשים באמצעות סרגל משקל.
  2. Intraperitoneally להזריק עכברים זכרים 0.7 - 0.9 מ ל 1.2% tribromoethanol הרדמה.
    הערה: הסכום של ההרדמה תלוי בגודל של העכבר. לדוגמה, לעכבר השוקל 40 g מוזרק עם 0.8 מ של tribromoethanol הרדמה.
  3. הרטב את ברי עם 70% אתנול.
  4. לבצע קטן וחתכו ברי (3-5 מ מ) ולאחר מכן לבצע חתך בדופן שריר בעזרת מספריים.
    הערה: מלקחיים ומספריים כדאי לנקות עם אתנול 70% לפני תחילת הניתוח.
  5. אחיזה כרית השומן עם מלקחיים, משוך אותו בעדינות. לאחר מכן, testis של צינור הזרע יופיעו.
    הערה: צינור הזרע הוא צינור בצורת U עם כלי דם אדום.
  6. . תקשור צינור הזרע -שתי נקודות עם התפרים כירורגי ולאחר מכן לחתוך את החלק האמצעי בין נקודות קשור.
  7. בעדינות לדחוף בחזרה את fat pad, testis ברי.
    1. חזור על הניתוח עם בזרמה הנותרים.
  8. לתפור את הקיר שריר עם שני תפרים עם תפירה.

3. הפריה חוץ גופית

  1. להזריק 8 - 10 - בן שבועיים B6D2F1 הנשי עכברים (BDF1) intraperitoneally עם 7.5 IU אקווין גונדוטרופין כוריוני (א), גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG) במרווח h 46-50.
  2. להכין טיפות של 300 µL האנושי תובל נוזלים (HTF)8 מדיה capacitation, הזרעה יום אחד לפני IVF בקערה 30 מ מ, מכסה את הטיפות האלה עם שמן מינרלי על הספסל מעבדה, ואז preincubate באינקובטור למשך הלילה.
  3. להקריב התבגר-זכר ICR עכברים מאת נקע בצוואר הרחם. לנתח יותרת האשך תסמונת עם מחט 27 ג'י ולאסוף תא זרע. תרבות אותם עבור capacitation ב 300 µL של HTF מדיה עבור h 1-2-38 מעלות צלזיוס.
  4. 16 שעות לאחר הזרקת hCG, להקריב עכברים נקבה סופר ovulated על ידי נקע בצוואר הרחם. להעביר oviduct ampulla לתוך שמן מינרלי ליד HTF מדיה, ואז לשלות cumulus תאים, oocytes מורכבים ampulla oviduct זו על ידי מחט 30-G לתוך המדיום הזרעה preincubated-HTF.
    הערה: בחלק מהעכברים הנשי אינם מראים לעיתים קרובות הביוץ למרות הטיפול ביוץ סופר. Oviduct מוגדלת ampulla הוא סימן של הביוץ.
  5. לאחר capacitation, להעביר 2-3 µL של תא זרע capacitated המדיה הזרעה-HTF שבו נאספו את oocytes ovulated.
  6. h 1 לאחר הפריה, לאסוף את מופרות מופרית ולפנק אותם עם hyaluronidase-µg/mL 100 10 דקות בתקשורת9 CZB.
    הערה: כאשר הפריה מבוצע כהלכה, h 1 לאחר הפריה, מופרות מופרית בגופה קוטב 2nd שנצפו. אם פחות או באיכות נמוכה הזרע משמש, רק מעט מופרות עם גוף קוטב 2nd שנצפו. כמו כן, אם זרע רבים משמשים עבור הזרעה, polyspermy מתרחשת. הפריה תקין מוביל מופרות עם pronuclei זכר ונקבה. באמצעות קריטריונים אלה, זה אפשרי למצוא אם ההפריה נעשית טוב או לא.
    1. לאחר הרחצה בתקשורת CZB, נושא את מופרות עם גוף קוטב שני microinjection עם eGFP-ויזת עבודה H2B mRNA.

4. הכנת קאמרית, Microinjection סיליקון

  1. לדלל RNA קידוד eGFP-ויזת עבודה H2B באמצעות מים נטולי נוקלאז בריכוז של 250 ng/µL.
  2. להכין 2-3 טיפות של PVP-HTF eGFP-ויזת עבודה H2B טיפות mRNA ו 5-6 טיפות Hepes buffered טיפות CZB (H-CZB) על המנה 60 מ מ. מכסים את הטיפות האלה עם שמן מינרלי.
    הערה: ניתן לבצע הכנות אלה על הספסל מעבדה. יש אין דרישה לשימוש זרימת אוויר למינריות הקבינט.
  3. משוך זכוכית בורוסיליקט עם פולר micropipette (למשל, P = 500, חום = 825, משיכה = 30, ול = 120, וזמן = 200)
  4. לאחר שבירת קצה הפיפטה כופפי את פיפטה microinjection זכוכית משך קרוב הקצה (מיקרומטר −300 חזרה) בסביבות 30 מעלות תוך שימוש microforge.

5. microinjection

  1. כבה את התנור צלחת על הבמה של micromanipulator כדי למנוע הריגת מופרות עם אלמנט פייזו במהלך ההזרקה mRNA.
  2. רוחצים את בחלק הפנימי של מחטים הזרקת ב HEPES-באגירה-HTF המכיל 10% PVP (PVP-HTF).
  3. לאסוף את מופרות מופרית עם גוף קוטב 2nd (איור 2B) והעבר 20-25 מופרות על גבי התא של השלב מיקרוסקופ שמצורפת micromanipulator.
  4. למלא את eGFP מדולל-ויזת עבודה H2B mRNA לתוך נימי זכוכית בורוסיליקט מן העצות.
  5. להחזיק את הזיגוטה עם פיפטה אחזקות ולאחר מכן מחלקים את pellucida zona ואת קרום cytosolic עם כונן piezo.
  6. להזריק בערך 10 pL של mRNA לתוך הציטופלסמה של מופרות. סיום mRNA-הזרקת בתוך 10 דקות כדי למנוע את הנזק שנגרם על ידי יותר culturing את מופרות בחוץ החממה.
    הערה: אמצעי האחסון הזרקת צריך להיות גדול כמו הגוף קוטב 2nd . אם הסכום של ה-mRNA מוזרק גדול מדי, זה אפשרי לגרום השבר eGFP חינם-ויזת עבודה H2B, העשויים להשפיע על השבר ניידים.
  7. 10 דקות לאחר microinjection, לכבס במים לפחות 3 טיפות, ואז תרבות את מופרות מוזרק ב- CZB ב 38 ° C עד zFRAP ניתוח.

6. zFRAP ניתוח

  1. h 1 לפני ניתוח zFRAP, להפעיל את הלייזר ואת פלטה צמוד לשלב של מיקרוסקופ קונפוקלי. הגדר את הטמפרטורה ב- 38 מעלות צלזיוס.
  2. לשים µL 6-10 של מדיה CZB HEPES באגירה מכוסה שמן מינרלי על המנה התחתון 60 מ מ זכוכית חמה על המזגן עד אוסף זיגוטה.
  3. 8 - 12 שעות לאחר ההפריה, לאסוף 5-10 מופרות eGFP-ויזת עבודה H2B-הבעת ' והעברת לתוך µL 6-10 של טרום חימם ירידה בינונית באגירה HEPES CZB.
    הערה: כדי להימנע culturing יותר מחוץ חממה, 5-10 eGFP-ויזת עבודה H2B-הבעת ' מופרות שימשו-כל ניתוח. 5-10 מופרות ניתן לנתח בתוך 1 h.
  4. הגדר את הלבנת ותנאי הדמיה לפי הוראות היצרן. המקרה לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ (טבלה של חומרים) מוצג להלן:
    1. שימוש 60 X עדשה שמן (60 X 60 X / 1.35 שמן).
      הערה: עדשות עם רגישות גבוהה יותר הצג ההגדלה (מפתח נומרי גבוה יותר) גבוהה יותר.
    2. הגדר סריקה מהירות 4.0 µs/פיקסל והגודל כמו "512" על "רכישת הגדרה" (משלימה איור 1).
    3. הגדלת זום דיגיטלי כדי "5" (משלימה איור 1).
      הערה: A זום גבוה יותר נדרש לזהות אם המוקד להיסחף מתרחש או לא.
    4. פתח רשימת צבען (משלימה איור 1), ואז לבחור "EGFP". להגדיר זמן התבוננות 1.6 s (מרווח מוגדר בהגדרת "ריצה חופשית") (משלימה באיור 1)
      הערה: תצפיות יותר עלול לגרום יותר נתונים מפורטים, אך זה עלול גם לגרום phototoxicity. בניתוח zFRAP, זמן התבוננות 1.6 s נראה מספיק כדי לזהות את האסימטריה הורים של כרומטין ולגמישות.
    5. הגדר את המספר של תמונות כמו 12 בסך הכל (משלימה איור 1).
    6. להתחיל "גירוי הגדרה" לוח ולאחר מכן לחץ "ראשי" ב- UseScanner. הגדר סריקה מהירות כמו 10.0 µs לפיקסל. לחץ על "הפעלה של סדרת" ולאחר מכן הגדר PreActivation "3 מסגרות" והשעה הפעלה כמו "5 שניות" (משלימה איור 1).
    7. לחץ על "פוקוס x 2", כוון את הפוקוס ולאחר מכן "Stop".
    8. הגדר הלבנה והדמיה עוצמת הלייזר (477 ננומטר)-110 ו-15 µW, בהתאמה, על ידי התאמת "לייזר gage כוח" (משלימה איור 1).
      הערה: הלבנת מאוד חזקה עלולה לגרום אזור מולבן גדול יותר, מה שגורם לקשיים לניתוח כמותי. למדידת עוצמת הלייזר, השתמש מד הכוח. חשוב לאשר את עוצמת הלייזר כדי למנוע את השפעת הרעת הקשורות זמן עוצמת הלייזר.
    9. לחץ על "קליפ מלבני" (משלימה באיור 1) בחלונית הגדרת גירוי. הגדרת האזור של הריבית (רועי; אדום; רועי #1B) 40 x 40 פיקסלים (7.6 מיקרומטר2). הכנת אזור הפניה (REF; ירוק; רועי #2), ועל רקע (BG; כחול; רועי #3) "באמצעות העתק ROI" והדבק "רועי" (לחצן העכבר הימני על העכבר).
      הערה: ניתן להגדיר את גודל הפיקסל דרך "רועי מנהל" אשר יכול להיקרא על ידי לחיצה על הלחצן הימני של העכבר כשהסמן מצביע על רועי. ROIs גדולים יותר הם חשבו להיות טוב יותר שכן הם באפשרותך לתקנן את הפיזור של התוצאה zFRAP. עם זאת, גדול מדי של רועי אינם יכולים לשמש עבור ניתוח זה כי זה עושה את זה קשה להימנע מבשר גרעינון הגוף (NPB). eGFP-ויזת עבודה H2B במחלקה הזו היה נחשב חינם מכרומטין והראה מדהים ניידות גבוהה3. רועי ואזורי REF להפרידם ככל האפשר. אם אלה שני אזורים קרובים, הלבנת עשוי להשפיע גם על האזור של שופט.
    10. לחץ על "חי" על הבר כלי ולאחר מכן להתחיל "Live עלילה" (משלימה איור 1).
      הערה: עלילת חיים מצביע על ידי קרינה פלואורסצנטית עוצמת האות בתוך כל רועי והוא משמש להתאמת עוצמת הלייזר באמצעות HV. שים לב כי אם רועי לא נבחרה, זו לא היתה עוצמה יתגלה בלוח מגרש בשידור חי.
    11. קביעת המיקום רועי
      הערה: רועי ניתן להעביר על ידי גרירת אל המיקום הרצוי ב- pronuclei. (1) להיות בטוח למנוע את גרעינון, (2) להתאים את רועי כולו לתוך נוקלאופלזמה. אינם מכילים את האזור מחוץ לאזור של קרום גרעיני (ציטופלזמה) ב- ROI. הלוקליזציה של eGFP-ויזת עבודה H2B הוא מוגבל מאוד לתוך נוקלאופלזמה כך שיהיה קל למצוא אם רועי מכיל הציטופלסמה או לא על ידי על ידי קרינה פלואורסצנטית של eGFP-ויזת עבודה H2B. Pronuclei זכר נוטים להיות גדולים יותר מאלה של נשים, לעתים קרובות הלוקליזציה ליד הגופה קוטב 2nd . תוך שימוש בקריטריונים אלה, לשפוט את pronuclei זכר או נקבה.
    12. לחץ על "פוקוס x 2" (משלימה באיור 1) ולאחר מכן התאם את HV כוח gage של הערוץ עבור EGFP לתוך עוצמת קרינה פלואורסצנטית בסביבות 2000 (עוצמת קרינה פלואורסצנטית ניתן לראות בחלון "מזימה בשידור חי").
  5. לחץ על "הזמן" ולאחר מכן "XY" (משלימה באיור 1) כדי להתחיל את הניתוח zFRAP.
    הערה: אם כפתור "הזמן" נבחר כראוי, "t" מופיעה על כפתור "XY".
    1. לחץ על "סדרת עשה" (משלימה איור 1), אשר מופיעה לאחר FRAP הדמיה ליד כפתור"XY" ולאחר מכן לקבל נתונים מנותח FRAP.
    2. שמור את הקובץ "2D תמונת נוף-כאשר XXXXX" בתור קובץ בשם המועדפת (oib-תבנית קובץ) על ידי "שמור בשם" (Ctrl + Shift + S יכול גם לשמש).
    3. רועי, שופט, BG ולאחר מכן לוחצים על (Ctrl + A יכול גם לשמש) "סדרת ניתוח" בחלון "תמונת תצוגה 2D".
    4. לקבל נתונים FRAP שורה ולאחר מכן לחץ על "הלחצן בחלון מגרש בשידור חי שמור".
      הערה: שורת נתונים כמותיים FRAP נשמר כקובץ csv.
  6. אין שליטה zFRAP, שים חלק מופרות הזריק mRNA על המסירה, שנמצא בקצה כלי הזכוכית התחתונה כדי למנוע את ההשפעה של זריחה תצפית.

7. נתוני חישוב

  1. תוך שימוש נתונים כמותיים המתקבלים, להפוך את הגרף של "עיקול שחזור" ו- "שבר ניידים" על-ידי Excel כמוצג3,הפניות7 עם מספר שינויים (ראה להלן ומשמש כתוספת קובץ excel).
  2. לחשב שהבוטות היחסית על-ידי חיסור הערך של BG מאלו של רועי, שופט ב 12 תמונות עבור כל נקודת זמן.
  3. לחלק את הערך של רועי על ידי השופט. כתוצאה מכך, ניתן להשיג ציונים 12 מתוקננת שהבוטות היחסית בכל נקודה בזמן.
  4. לחשב את הממוצע של הציון היחסי עבור רועי 3 תמונות שצולמו לפני צילום הלבנת.
  5. לחשב את קצב ההחלמה. לחלק שה-12 השיג ציונים היחסי עבור ROI של תמונות שצולמו לכל נקודת זמן (להשיג אצל 7.1.2.) לפי הממוצע של הציון היחסי לפני צילום הלבנה (להשיג אצל 7.1.3.). צייר עקומה התאוששות עם שימוש בציונים (2E איור).
  6. לחשב את קצב הלבנת.
    הערה: הלבנת קצב (%) = 100 - קצב ההתאוששות של 4ה image.
  7. לחשב את השבר ניידים (MF) באמצעות הנוסחה כפי שמוצג להלן10,11,12
    MF (%) = 12th שחזור קצב (נקודת הקצה) - קצב ההתאוששותה 4 / הלבנת קצב × 100.

8. השתלת

  1. חבר התבגר ICR נקבות בגיל 8-12 חודשים עם עיקור עכברים ICR זכר בלילה לפני העובר להעביר על ידי נותן להם להיות באותו הכלוב בן לילה.
  2. לאסוף את העוברים היו מנותח zFRAP, נחוש לפתח לשלב שני תאים.
  3. Intraperitoneally להזריק עכברים הנשי להרדמה tribromoethanol 1.2% 0.7 - 0.9 מ ל או עם 0.35 - mL 0.45 מהסוכנים 0.75/4/5mg/kg medetomidine/midazolam/butorphanol מעורב לפני השתלת.
    הערה: הנפח של ההרדמה נקבע לפי משקל הגוף של עכברים. Tribromoethanol: 0.2 מ"ל/10 גרם של משקל הגוף; medetomidine/midazolam/butorphanol מעורב סוכנים: 0.1 מ"ל/10 גרם של משקל הגוף.
    1. העברת העוברים שלב שני תאים אלה לתוך oviducts של pseudopregnant-נקבה ICR עכברים עם תקע הנרתיק-ימים 0.5 פוסט coitum (dpc).
    2. לאחר המעבר העובר, לשים העכברים הנשי החימום להגדיר ב 37 ° C עד שיתעורר.
  4. 18.5 dpc, להקריב את פונדקאית מאת נקע בצוואר הרחם, לשחזר את הגורים נגזר מופרות מנותח zFRAP בניתוח קיסרי. חלק הגורים התאושש נמסרו עם האמא המאמצת, משקל הגוף שלהם היו העריכו כל שבוע.

תוצאות

ניתוח zFRAP עם eGFP-ויזת עבודה H2B

כראוי המיוצר mRNA קידוד eGFP-מקש ויזת עבודה-H2B, אשר נראה כי להקה שהוסטו הנגרמת על ידי פוליפוני עוקב (איור 2 א), היה מוזרק לתוך הציטופלסמה של מופרות עם גוף קוטב 2 ב 1-3 h הזרעה (איור 2B). 8-12 שעו?...

Discussion

כפי גילה במחקר זה, הניתוח zFRAP אינו גורם נזק קריטי להתפתחות מלא לטווח, מציע שיטה זו הוא כלי מאוד שימושי כדי לחשוף את הקשר בין אירועים מולקולריים עובריים פוטנציאל התפתחותי. במהלך התיכנות לתוך התא-השני כמו מצב של תאים ES, שלפיו הפוטנציאל דיפרנציאלית של תאים אלה הופך גבוהה כמו זו של שני תאים בשלב...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים Kishigami סטושי סאיאקה וואקאיאמה, Hiroaki Nagatomo, Kamimura סטושי, קאנה Kishida על מתן תגובות ביקורתיות ותמיכה טכנית. עבודה זו מומן בחלקו על ידי משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה התוכנית לקידום הרפורמה של האוניברסיטאות לאומי כדי הפעולה; החברה יפן לקידום המדע (16H 02593), אסדה למדע של קרן המדע טקדה כדי T.W. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Confocal laser scaning microscopeOlympusFV1200FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7)
Thermo plateTokai HitTP-110RH26
Inverted microscopeOlympusIX71
Micro manupilatorNarishigeMMO-202ND
Pieze Micro MicromanipulatorPrime techPMAS-CT150
35 mm culture dishFalcom35100835 x 100 mm style; for IVF
60 mm culture dishFalcom35100760 x 15 mm style; for embryo culture
50 mm culture dishFalcom35100650 x 9 mm style; for manipulation on the stage
50 mm glass bottom dishMatsunamiD91040050 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis
Mineral oilOrganic spceiality chemicals625071For FRAP analysis on the glass bottom dishes
Mineral oilSigmaM8410-1LFor IVF and embryo culture
glass capillaryDrummond1-000-1000For handling mouse zygotes
Borosilicate glassPrime techB100-75-10-PTFor microinjection of mRNA
Micropipett pullerSutter instrumentP-97/IVFFor preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) 
Microforge NarishigeMF-900
mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kitThermo
Fisher scientific		AM1340
Poly (A) tailing kitThermo
Fisher scientific		AM1350
PVP solution 10% (PVP-HTF)IrvineSceientific99311HEPES buffered HTF containing 10% PVP
Sodium HEPESSigmaH3784
pTOPO eGFP-H2BTemplate plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6)
NorthernMax Gly Sample loading Dye Thermo
Fisher scientific		AM8551For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA
Phenol chloroform isamyl alcoholnacalai tesque25970-14
Chloroformnacalai tesque 08401-65
Not ITOYOBONOT-111X
EthachinmateWAKO318-01793
3664 Otical power meterHioki3664 Power meter for laser power
StereomicmicroscopeOlympusSZX16

References

  1. Burton, A., Torres-Padilla, M. E. Epigenetic reprogramming and development: a unique heterochromatin organization in the preimplantation mouse embryo. Brief Funct Genomics. 9, 444-454 (2010).
  2. Okada, Y., Yamaguchi, K. Epigenetic modifications and reprogramming in paternal pronucleus: sperm, preimplantation embryo, and beyond. Cell Mol Life Sci. 74, 1957-1967 (2017).
  3. Ooga, M., Fulka, H., Hashimoto, S., Suzuki, M. G., Aoki, F. Analysis of chromatin structure in mouse preimplantation embryos by fluorescent recovery after photobleaching. Epigenetics. 11, 85-94 (2016).
  4. Meshorer, E., et al. Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells. Dev Cell. 10, 105-116 (2006).
  5. Boskovic, A., et al. Higher chromatin mobility supports totipotency and precedes pluripotency in vivo. Genes Dev. 28, 1042-1047 (2014).
  6. Yamagata, K., Ueda, J. Long-term live-cell imaging of mammalian preimplantation development and derivation process of pluripotent stem cells from the embryos. Dev Growth Differ. 55, 378-389 (2013).
  7. Ooga, M., Wakayama, T. FRAP analysis of chromatin looseness in mouse zygotes that allows full-term development. PLoS One. 12, e0178255 (2017).
  8. Quinn, P., Begley, A. Effect of human seminal plasma and mouse accessory gland extracts on mouse fertilization in vitro. Australian journal of biological sciences. 37, 147-152 (1984).
  9. Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium. Biology of reproduction. 42, 432-440 (1990).
  10. Bae, J., Sung, B. H., Cho, I. H., Song, W. K. F-actin-dependent regulation of NESH dynamics in rat hippocampal neurons. PLoS One. 7, e34514 (2012).
  11. Dieteren, C. E., et al. Defective mitochondrial translation differently affects the live cell dynamics of complex I subunits. Biochim Biophys Acta. 1807, 1624-1633 (2011).
  12. Subramanian, V., et al. H2A.Z acidic patch couples chromatin dynamics to regulation of gene expression programs during ESC differentiation. PLoS Genet. 9, e1003725 (2013).
  13. Hayashi-Takanaka, Y., et al. Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling. Nucleic Acids Res. 39, 6475-6488 (2011).
  14. Yamazaki, T., Yamagata, K., Baba, T. Time-lapse and retrospective analysis of DNA methylation in mouse preimplantation embryos by live cell imaging. Dev Biol. 304, 409-419 (2007).
  15. Puschendorf, M., et al. PRC1 and Suv39h specify parental asymmetry at constitutive heterochromatin in early mouse embryos. Nat Genet. 40, 411-420 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

136zFRAPzygotic

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved