Zygotic floresan kurtarma fotoğraf ağartma sonra analiz için tam dönemlik geliştirme sağlar kromatin gevşeklik

Özet

Kromatin gevşeklik blastomeres gelişim potansiyelini yer gibi görünüyor. Ancak, kromatin gevşekliği güvenilir bir dizin olarak embriyoların gelişim potansiyeli için kullanılıp kullanılamayacağını bilinmemektedir. Burada, kromatin gevşekliği tarafından değerlendirilmiş zigotları tam dönem için gelişebilir bir deneysel sistem tarif edilmiştir.

Özet

Canlı görüntüleme moleküler olayların analizi için ontogeni sırasında sağlayan güçlü bir araçtır. Son zamanlarda, kromatin gevşeklik veya açıklık pluripotent embriyonik kök hücre hücresel farklılaşma potansiyeli dahil olmak gösterilmiştir. Bu daha önce kıyasla bildirildi embriyonik kök hücreleri ile onların totipotency ile dernek düşündüren bir son derece gevşetti kromatin yapısı zigotları liman. Bu son derece gevşetti/aç kromatin yapısı embriyonik gelişim potansiyeli için önemli olup olmadığını ancak, şimdiye kadar bu giderilmiş değil. Bu da çalışmanın, floresans tarafından analiz edildi hangi zigotları içinde fotoğraf ağartma sonra kurtarma terime önemli zarar vermeden gelişebilir bir deneysel sistem bu hipotez incelemek için geliştirilmiştir. Önemlisi, bu deneysel sistem sadece bir termos-tabak ısıtıcı ek olarak confocal bir lazer mikroskobu tarama gerekir. Sonra çözümleme (sıkı bağlamak) fotoğraf ağartma zygotic kromatin moleküler olaylarda tam dönemlik geliştirme için önemli olup olmadığını araştırmak için kullanılabilir Bu çalışma bulguları bu floresan kurtarma öneririz.

Giriş

Gübreleme sonra dinamik olarak değişmiş kromatin yapısı, ve zygotic kromatin yapısı sonra sonunda kurulan^1,2. Baba tarafından pronuclei, bu döneminde sırasında baskın kromatin protein histon protamine değiştirilir. Elde edilen kromatin son derece spermlerinin ve birkaç puan (Örneğin, histon varyant kompozisyon, histon değişiklik) dişi yumurta farklıdır. Böylece, kurulan zygotic kromatin sonraki embriyonik geliştirme için önemli olduğu düşünülmektedir. Ancak, uzun sürelerle zygotic kromatin yapısı ayrıntıları ortaya çıkarmak için çabalara rağmen yöntemleri zigotları niteliğini değerlendirmek için veya onların kromatin yapısı analiz ederek tam dönemlik gelişimleri tek hücreli aşamada tahmin etmek hiç var kurulan.

Önceki çalışmada, bu zigotları son derece gevşetti kromatin yapısı³var keşfedilir. Şu anda, kromatin gevşeklik veya açıklık hücresel farklılaşma (ES) embriyonik kök hücreleri⁴' te potansiyel için önemli bir faktör olduğuna inanılıyor. ES hücreleri homojenliği doğada sergi değil, ama oldukça heterojen; ES Hücre koloniler halinde bazı geçici bir daha yüksek farklılaşma potansiyeli iki hücreli sahne embriyo blastomeres için karşılaştırılabilir elde etmek. Devlet gibi iki hücresine bu geçiş sırasında ES kromatin gevşekliği iki hücreli sahne embriyo⁵ile karşılaştırılabilir nedir içine değişiklikler hücreleri. Böylece, kromatin gevşekliği önemli hücresel farklılaşma potansiyeli için kapsamlı kromatin zigotları içinde açmak mümkün olduğu zygotic gelişim potansiyeli değerlendirme için yararlı gibi görünüyor.

Canlı görüntüleme sonraki geliştirme ve hatta tam dönemlik geliştirme⁶için bu yöntem sağlar beri moleküler olayların analizi için ontogeni sırasında sağlayan güçlü bir araçtır. Canlı görüntüleme yöntemlerinden birini kromatin gevşekliği Preimplantasyon embriyo ve ES hücreleri^3,4,5incelemek için sıkı bağlamak Analizi kullanılmıştır. Zygotic kromatin gevşekliği tam dönemlik geliştirme üzerinde zararlı bir etkisi olmadan sıkı bağlamak analiz tarafından çözümlenebilir, embriyo kalitesi değerlendirme tek hücreli aşamada için değerli bir araç olabilir. Ancak, bu deneysel yöntem tarafından tam dönemlik geliştirme etkileri inceledik değil. Son zamanlarda, deneysel bir sistemi zygotic kromatin gevşekliği değerlendirmek için sıkı bağlamak kullanarak geliştirilmiştir. Çünkü bu zigotları için yeni bir gözlem sistemi, zygotic sıkı bağlamak (zFRAP) olarak adlandırdığı oldu. zFRAP eleştirel tam dönemlik geliştirme etkilemez mi ve oldu başka bir yerde⁷bildirdi. Bu raporda, bu deneysel yöntemin protokolü tanımlanır.

Protokol

Bu çalışma Kılavuzu'nda bulunan öneriler için bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları Yamanashi Üniversitesi ile sıkı uygun olarak gerçekleştirildi. Protokol ve Yamanashi Üniversitesi hayvan deneyleri Etik Komitesi tarafından kabul edildi (izin numarası: A24-50). Tüm ameliyat tribromoethanol anestezi altında gerçekleştirilen ve tüm çabaları acı en aza indirmek için yapılmıştır. Yordamlar ve saatleri resimli bir bakış gösterilir Şekil 1 ve Tablo 1, anılan sıraya göre.

1. mesajcı RNA (mRNA eGFP-H2B,In Vitro transkripsiyonu) hazırlık

1. Şablon DNA pTOPO-eGFP-H2B^3,7 5 µg ile 30 U değil / linearize ben 37 ° C'de 50 µL gecede.
2. Onay sindirilir DNA'ın 1.5 µL olup olmadığını tamamen Elektroforez tarafından sindirilmiş toplamak.
   1. 1,5 µL ve 3-5 µL sindirilmemiş DNA boya de %2 özel jel, sırasıyla yükleme ile ve Elektroforez tabi geçerlidir.
      Not: Eğer tamamen sindirilmiş, tek bir bant (yaklaşık 5 kb) görülmektedir. Sindirilmemiş DNA farklı bir konumda görünür bir denetim olarak kullanılır.
3. GKD₂O 151.5 µL ekleyip 200 µL kalan için fenol/kloroform/izoamil alkol (25:24:1) DNA sindirilir.
   1. Gönderen vortex kuvvetle karıştırın.
   2. 15 dakika maksimum hızda santrifüj kapasitesi.
4. Süpernatant kurtarmak ve kloroform 200 µL ekleyin.
   1. Gönderen vortex kuvvetle karıştırın.
   2. 15 dakika maksimum hızda santrifüj kapasitesi.
5. Süpernatant yeniden elde etmek ve daha sonra 20 µL 3 M sodyum asetat ve ethachinmate 1,5 µL ekleyin.
   1. Gönderen vortex kuvvetle karıştırın.
   2. 550 µL % 100 etanol ekleyin ve sonra girdap tarafından kuvvetle karıştırın.
   3. 15 dakika maksimum hızda santrifüj kapasitesi.
   4. Süpernatant atın ve Öyleyse Pelet % 70 etanol ile yıkayın.
   5. Pelet buharlaşma için 5-10 dk tarafından kuru.
6. Çöktürülmüş plazmid DNA nükleaz ücretsiz su 8 µL'geçiyoruz.
7. Plazmid konsantrasyon değerlendirmek (beklenen konsantrasyonu olduğunu hakkında 300-500 ng/µL) üretici öğretim takip ederek nanodrop ile.
8. Vitro transkripsiyon mRNA üreticinin yönergelerini izleyerek eGFP-H2B ile 1 µg saf DNA'ın bir şablonu olarak toplam reaksiyon hacminin 20 µL kodlama için gerçekleştirin.
   1. Vitro transkripsiyon sonra 36 μL su ekleyin sonra 1,5 µL analiz için sentezlenmiş mRNA 56 µL Elektroforez tarafından (olmadan poli gibi A) olarak kurtarılır.
9. Poli A takip 100 µL tepki birimindeki sentezlenmiş mRNA için üreticinin yönergelerini izleyerek gerçekleştirin.
10. Lityum klorür yağış çözüm 60 µL poly eGFP-H2B kuyruklu bir mRNA ekleyin ve sonra kuvvetle karıştırın.
    1. -30 ° c 30 dk için serin.
    2. 15 dakika maksimum hızda santrifüj kapasitesi.
    3. Süpernatant atın ve Öyleyse Pelet % 70 etanol ile yıkayın.
    4. Pelet buharlaşma için 5-10 dk tarafından kuru.
11. Isıtma için 30 dk 55 ° C'de tarafından 20 µL nükleaz ücretsiz su ile Pelet geçiyoruz.
12. Nanodrop ile zarlarını mRNA konsantrasyonu değerlendirmek. İçin 500 ng/µL nükleaz ücretsiz su ve mağaza-80 ° c kadar kullanmak oranında seyreltin.
13. Tercih edilen mRNA üretim onaylamak; 1 µL/olmadan mRNA (1.8.1 ve 1.12 adımları sırasıyla elde) konu poli 0.1 mg/mL arasında etidyum bromür 1,5 µL ve Elektroforez analiz için örnek yükleme boya 3 µL ile karışık bir kuyruk. Uygulanan birim 5.5 µL yapıldı.
    Not: Poli A takip başarılı olursa, ötelenen grubun mRNA poli bir takip olmadan göre (Şekil 2A) dikkat edilmelidir.

2. Vasectomized erkek fareler hazırlanması

1. ICR erkek fareler 8-12 ayda bir ağırlık ölçeği kullanarak tartın.
2. İntraperitoneally erkek fareler 0.7 - 0.9 mL % 1.2 tribromoethanol anestezi ile enjekte et.
   Not: Anestezi fare boyutuna bağlıdır. Örneğin, 40 gr ağırlığında bir fare tribromoethanol anestezi ile 0.8 mL enjekte edilir.
3. Berry % 70 etanol ile ıslak.
4. Bir küçük berry (3-5 mm) kesilmiş ve sonra bir makas yardımı ile kas duvardaki bir kesi yapmak olun.
   Not: Makas ve forseps % 70 etanol ile ameliyat başlamadan önce temizlenmelidir.
5. Forseps ile yağ yastığı kavrama ve yavaşça çekin. Daha sonra testis ve vas deferens görünür.
   Not: Vas deferens U şeklinde bir tüp olduğunu ve bir kırmızı kan damarı ile.
6. Cerrahi sütür ile iki puan, vas deferens bağlayın ve sonra bağlı nokta arasındaki orta kısmını kesti.
7. Yavaşça geri yağ yastığı ve testis berry itin.
   1. Kalan testisin ameliyatla yineleyin.
8. Kas Duvar ile cerrahi sütür ile iki dikiş dikmek.

3. TÜP BEBEK

1. 8 - 10 - hafta eski kadın B6D2F1 enjekte 7.5 IU at koryonik gonadotropin (EKG) ve 46-50 h aralığında insan korionik gonadotropin (hCG) ile intraperitoneally (BDF1) fareler.
2. Capacitation ve döllenme 1 gün 30 mm çanak IVF öncesine damla 300 µL insan tubal sıvı (HTF)⁸ ortam hazırlamak, bu damlalar laboratuvar tezgah üzerinde mineral yağ ile kapak ve bir kuluçka makinesine bir gecede preincubate.
3. Olgunlaştı erkek ICR fareler tarafından servikal çıkığı kurban. Kauda epididim 27-G iğne ile incelemek ve spermatozoon toplamak. Onları 1-2 h 38 ° C'de HTF medyasının 300 µL içinde capacitation için kültür
4. hCG enjeksiyonu sonra 16 h tarafından servikal çıkık dişi fareler süper ovulated kurban. Mineral yağ HTF medya yanında içine ovidukt ampulla transfer ve kümülüs hücreleri ve yumurta karmaşık bu ovidukt ampulla tarafından 30-G iğne preincubated döllenme-HTF orta çizin.
   Not: Kadın bazı fareler genellikle yumurtlama süper yumurtlama tedaviye rağmen gösterme. Genişlemiş ovidukt ampulla yumurtlama belirtisidir.
5. Capacitation sonra 2-3 µL capacitated spermatozoon, hangi ovulated yumurta toplanmıştır tohumlama HTF medya içine aktarın.
6. 1 h tohumlama sonra döllenmiş zigotları toplamak ve onları 100 µg/mL CZB⁹ medya 10 dk, hyaluronidase ile tedavi.
   Not: Döllenme düzgün gerçekleştirildiğinde, tohumlama sonra 1 h 2^nd kutup beden ile döllenmiş zigotları gözlenir. Daha az veya düşük kaliteli sperm kullandıysanız, yalnızca küçük zigotları 2^nd kutup beden ile gözlenir. Ayrıca, birçok spermlerinin döllenme için kullanılması halinde, polyspermy oluşur. Uygun döllenme zigotları ile erkek ve dişi pronuclei yol açar. Bu ölçütleri kullanarak, tohumlama iyi ya da değil bitmiş bulmak mümkündür.
   1. CZB medya yıkandıktan sonra ikinci bir kutup gövdeli zigotları mikroenjeksiyon ile eGFP-H2B mRNA tabi.

4. Oda ve mikroenjeksiyon pipetler hazırlanması

1. EGFP-H2B nükleaz ücretsiz su 250 ng/µL bir konsantrasyon elde etmek için kullanarak kodlama RNA sulandırmak.
2. 2-3 damla PVP-HTF hazırlamak ve eGFP-H2B mRNA damla ve CZB (H-CZB) damla 60 mm çanak üzerinde 5-6 damla Hepes arabelleğe alınmış. Bu damla mineral yağ ile kapak.
   Not: Bu hazırlıklar laboratuvar tezgah üzerinde gerçekleştirilebilir. Laminer hava akımı kabine kullanmak için bir gereksinim vardır.
3. Çek borosilikat cam micropipette çektirme ile (Örneğin, P = 500, ısı 825, çekme = = 30, vel = 120 ve saat = 200)
4. Pipet Ucu kırdıktan sonra çekti cam mikroenjeksiyon pipet ucu (geri −300 µm) yakın bir microforge kullanarak yaklaşık 30 ° eğil.

5. mikroenjeksiyon

1. Tabak ısıtıcı bir piezo ile zigotları öldürülmesi mRNA enjeksiyon sırasında önlemek için micromanipulator aşamasında açın.
2. Yıkama ve enjeksiyon iğneler HEPES tampon HTF iç kat % 10 içeren PVP (PVP-HTF).
3. 2^nd kutup beden (Şekil 2B) ile döllenmiş zigotları toplamak ve 20-25 zigotları odası ile bir micromanipulator bağlı mikroskop sahne alanı'nın üzerine aktarın.
4. Seyreltilmiş eGFP-H2B mRNA borosilikat cam kılcal ipuçları içine doldurun.
5. Zigot holding pipet ile tutun ve sonra zona pelusida ve piezo sürücü ile sitozolik membran bölün.
6. Yaklaşık 10 enjekte pL mRNA zigotları sitoplazma içine. MRNA-enjeksiyon uzun kuluçka makinesi dışında zigotları kültür tarafından hasarları önlemek için 10 dakika içinde bitirmek.
   Not: Enjeksiyon hacmi 2^nd kutup gövde metni olarak büyük olması gerekir. MRNA enjekte miktarı çok büyük ise, mobil kesir etkileyebilir ücretsiz eGFP-H2B kesir neden mümkündür.
7. 10 dakika sonra mikroenjeksiyon, en az 3 damla yıkama ve zFRAP analiz kadar 38 ° C'de CZB içinde zigotları enjekte kültür.

6. zFRAP Analizi

1. Lazer ve confocal mikroskop sahne alanı'na bağlı Isıtma levhası 1s zFRAP Analizi önce açın. Sıcaklığı 38 ° C'de ayarlamak
2. 6-10 µL HEPES tampon CZB medya 60 mm cam alt çanak üzerinde mineral yağ ile kaplıdır ve sıcak ısıtıcısını zigot koleksiyonu kadar koymak.
3. 8 - 12 h tohumlama sonra toplamak 5-10 eGFP H2B ifade zigotları ve transfer içine 6-10 µL HEPES tampon CZB orta damla önceden ısındı.
   Not: uzun inkübatör dışında kültür önlemek için 5-10 eGFP H2B ifade zigotları her Analizi kullanılmıştır. 5-10 zigotları için 1s içinde analiz edilebilir.
4. Ağartma ve görüntüleme koşulları üreticinin talimatlarına göre ayarlayın. Durumda confocal bir lazer mikroskop (Tablo reçetesi) tarama aşağıda gösterilmiştir:
   1. Kullanım 60 X Petrol mercek (60 X 60 X / 1,35 petrol).
      Not: Lensler daha yüksek büyütme (daha yüksek sayısal diyafram) gösteri daha yüksek hassasiyet ile.
   2. Tarama hızı 4.0 µs/piksel ve boyut "512" "Satın alma ayarı" (Tamamlayıcı Şekil 1) olarak ayarlayın.
   3. Dijital zoom "5" (Tamamlayıcı Şekil 1) artırın.
      Not: Daha yüksek zoom odak kayması ya da değil oluşur tanımak için gereklidir.
   4. Boya listesi (ek Şekil 1) ve sonra seçti "EGFP" açın. Set gözlem zaman 1.6 s (aralığı "ücretsiz Çalıştır" ayarı olarak ayarlanır) (Tamamlayıcı Şekil 1)
      Not: Daha fazla gözlem noktaları daha ayrıntılı veri neden olabilir, ancak aynı zamanda fototoksisite neden olabilir. ZFRAP analizde, 1.6 s gözlem vakit kromatin gevşekliği ebeveyn asimetri algılamak için yeterli gibi görünüyor.
   5. Fotoğraf sayısı 12 toplam (Tamamlayıcı Şekil 1) olarak ayarlayın.
   6. Start "Uyarıcı ayarı" paneli ve "Ana" UseScanner'ı tıklatın. Tarama hızı 10.0 µs/piksel olarak ayarlayın. "Harekete geçirmek içinde" serisini ve PreActivation "5 sn" (Tamamlayıcı Şekil 1) "3 kare" ve harekete geçirmek zaman ayarlayın.
   7. "Odak x 2" tıklayın ve odağı ayarlayın ve sonra "Dur".
   8. Ağartma ve lazer güç görüntüleme ayarla (477 nm) 110 ve 15 µW at, sırasıyla, tarafından ayarlama "gage güç lazer" (Tamamlayıcı Şekil 1).
      Not: Çok güçlü ağartma Nicel analiz zorluğa neden oluyor daha büyük bir ağartılmış alan neden olabilir. Lazer Güç ölçüm için bir güç ölçer kullanın. Lazer güç zamanla ilgili bir bozulma etkisini önlemek için lazer güç onaylamak önemlidir.
   9. "Küçük Rect" (Tamamlayıcı Şekil 1) uyarıcı ayar panelinde tıklatın. Faiz (ROI; kırmızı; bölgesi ayarlayın YG #1B) 40 x 40 piksel (7.6 µm²) olarak. Hazırlamak bir başvuru bölgesi (REF; yeşil; Yatırım getirisi #2) ve bir arka plan (BG; mavi; Yatırım getirisi #3) kullanarak "ROI" kopyalayıp "ROI" (fare sağ tıklatma düğmesi).
      Not: Piksel boyutunu imleç yatırım getirisi üzerinde olduğunda fare sağ tuşa basarak denilen "ROI Yöneticisi" aracılığıyla ayarlanabilir. Daha büyük ROIs zFRAP puan dağılımı standartlaştırmak bu yana daha iyi olduğu düşünülür. Çekirdekçik habercisi vücut (NEH) önlemek zorlaştırıyor çünkü ancak, çok büyük bir yatırım getirisi, bu çözümleme için kullanılamaz. eGFP-H2B bu yerde kromatin ücretsiz olduğu düşünülen ve dikkate değer daha yüksek hareketlilik³gösterdi. Yatırım getirisi ve REF alanları mümkün olduğunca ayrılmalıdır. Bu iki bölgeye yakın iseniz, ağartma REF bölge da etkileyebilir.
   10. "Canlı" araç çubuğunda tıklatın ve "Live çıkart" (Tamamlayıcı Şekil 1) başlatın.
       Not: Canlı çizim floresans sinyal yoğunluğu içinde her yatırım getirisini gösterir ve lazer güç HV kullanarak ayarlamak için kullanılır. Yatırım getirisi seçilmemişse, hiçbir yoğunluğu canlı Arsa panelde algılanan unutmayın.
   11. Yatırım getirisi konum belirleme
       Not: Yatırım getirisi pronuclei istediğiniz konuma sürükleyerek hareket edebilir. (1) olmak emin çekirdekçik önlemek ve uygun (2) tüm ROI nucleoplasm. ROI içinde nükleer membran (sitoplazma) alanı dışında bölge içermez. Böylece ROI sitoplazma içerir olup olmadığını ya da değil eGFP-H2B floresans bulmak kolay eGFP-H2B lokalizasyonu nucleoplasm son derece sınırlıdır. Erkek pronuclei kez 2^nd kutup cesedin yanında lokalize kadın daha büyük olma eğilimindedirler. Bu kriterler kullanırken, erkek veya kadın pronuclei Yargıç.
   12. "Odak x 2" tıklatın (Tamamlayıcı Şekil 1) ve sonra HV güç gage kanal için EGFP içine floresan yoğunluğu yaklaşık 2000'e ayarlayın (floresan yoğunluğu "canlı komplo" penceresinde görülebilir).
5. ZFRAP analiz başlamak için "Zaman" ve sonra "XY" (Tamamlayıcı Şekil 1)'i tıklatın.
   Not: "Zaman" düğmesini uygun seçtiyseniz, "t" "XY" butonunu görünür.
   1. "Sıkı bağlamak görüntüleme"XY düğmesi"yakın ve sıkı bağlamak analiz verileri elde etmek sonra görünen bitmiş serisi" (Tamamlayıcı Şekil 1),'ı tıklatın.
   2. Kurtarmak belgili tanımlık eğe "2B görünümü-görüntü XXXXX" tarafından tercih edilen adlandırılmış dosya (ÖİB. dosya biçimi) olarak "farklı kaydet" (Ctrl + Shift + S da kullanılabilir).
   3. Yatırım getirisi, REF ve BG seçin ve tıklatın (Ctrl + A da kullanılabilir) "2B görünümü görüntü" penceresinde "serisi analizi".
   4. Satır sıkı bağlamak veri elde etmek ve sonra "Kaydet" canlı çizim penceresinde düğmesini tıklatın.
      Not: Satır sıkı bağlamak nicel veri bir csv dosyası olarak kaydedilir.
6. ZFRAP kontrol için bazı etkisi floresans gözlem önlemek için cam alt yemekleri kenarında yakın açılan mRNA ile enjekte zigotları koymak.

7. veri hesaplama

1. Kullanırken elde edilen nicel veri olun "kurtarma eğrisi" ve "mobil kısmı" tarafından Excel grafiği (bkz. aşağıdaki ile tamamlayıcı excel dosyası) bazı değişikliklerle başvurular^3,7 gösterildiği gibi.
2. Göreli yoğunluğunu 12 resimleri her zaman için yatırım getirisi ve REF BG değerini çıkararak hesaplar.
3. ROI değeri bu hakem tarafından bölün. Sonuç olarak, her zaman bir noktada 12 standart göreli yoğunluğunu puanları elde edilebilir.
4. 3 görüntüleri ağartma fotoğraf daha önce alınan yatırım getirisi için göreli puan ortalamasını hesaplamak.
5. Kurtarma oranını hesaplamak. 12 göreli puanları için yatırım getirisi, (7.1.2 elde edilen.) her zaman bir noktada (7.1.3 elde edilen.) fotoğraf beyazlatma daha önce göreli puanı ortalama tarafından çekilen görüntüler elde Böl. Bu sınavların kullanarak kurtarma eğri çizme (Şekil 2E).
6. Ağartma oranını hesaplamak.
   Not: ağartma oranı (%) = 100 - 4^th görüntü iyileşme oranı.
7. Aşağıdaki^10,11,12 olarak formül kullanarak mobil kesir (MF) hesaplama
   MF (%) = 12^inci kurtarma oranı (bitiş noktası) - 4^th iyileşme oranı / beyazlatma hızı × 100.

8. embriyo transferi

1. 8-12 ayda bir gece embriyo transferi önce gecede aynı kafese olmalarına izin vererek vasectomized erkek ICR fareler ile olgunlaştı ICR kadın dostum.
2. ZFRAP analiz edilmiş ve iki hücreli aşamaya geliştirmek için kararlı embriyo toplamak.
3. İntraperitoneally dişi fareler 0,35 - 0.75/4/5mg/kg medetomidine/midazolam/butorphanol karışık ajanların embriyo transferi önce 0,45 mL veya 0.7 - 0.9 mL % 1.2 tribromoethanol anestezi ile enjekte.
   Not: Anestezi hacmi fareler vücut ağırlığı tarafından belirlenir. Tribromoethanol: 0.2 mL/10 g vücut ağırlığının; medetomidine/midazolam/butorphanol ajanlar karışık: vücut ağırlığı 0.1 mL/10 g.
   1. Oviducts 0,5 gün sonrası coitum (dpc), vajinal bir fiş ile pseudopregnant kadın ICR farelerin içine bu iki hücreli sahne embriyo transfer.
   2. Embriyo transferi sonra onlar uyanıncaya kadar 37 ° C'de ayarla ısıtıcı dişi fareler koyun.
4. 18,5 dpc, taşıyıcı anne tarafından servikal çıkığı kurban ve zFRAP analiz zigotları sezaryenle türetilmiş pups kurtarmak. Bazı ve kurtarılan yavrularını üvey annesine teslim edildi ve kendi vücut ağırlıkları her hafta değerlendirildi.

Sonuçlar

eGFP-H2B ile zFRAP Analizi

Düzgün üretilen eGFP-H2B, ötelenen bir grup tarafından poly bir takip (Şekil 2A) neden olduğu gibi görülen kodlama mRNA zigotları 1-3 h 2 bir kutup gövdeli sitoplazma içine tohumlama (Şekil 2B) sonra enjekte ettiler. 8'e 12 h tohumlama sonra 2 pronuclei eGFP-H2B ifade gösterilen ile zigotları toplanmış ve zFRAP Analize (

Tartışmalar

Bu çalışmada ortaya gibi zFRAP analiz bu yöntem Birliği arasında moleküler olaylar ve embriyonik gelişim potansiyeli ortaya çıkarmak için çok yararlı bir araçtır düşündüren tam dönemlik gelişmeye kritik hasar neden olmaz. , ES hücre hangi tarafından bu hücreleri fark potansiyeli bu iki hücreli sahne embriyolar, olarak yüksek olur, devlet gibi iki hücresine yeniden programlama sırasında kromatin gevşekliği bu iki hücreli sahne embriyo⁵ile karşılaştırılabilir de?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Confocal laser scaning microscope	Olympus	FV1200	FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7)
Thermo plate	Tokai Hit	TP-110RH26
Inverted microscope	Olympus	IX71
Micro manupilator	Narishige	MMO-202ND
Pieze Micro Micromanipulator	Prime tech	PMAS-CT150
35 mm culture dish	Falcom	351008	35 x 100 mm style; for IVF
60 mm culture dish	Falcom	351007	60 x 15 mm style; for embryo culture
50 mm culture dish	Falcom	351006	50 x 9 mm style; for manipulation on the stage
50 mm glass bottom dish	Matsunami	D910400	50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis
Mineral oil	Organic spceiality chemicals	625071	For FRAP analysis on the glass bottom dishes
Mineral oil	Sigma	M8410-1L	For IVF and embryo culture
glass capillary	Drummond	1-000-1000	For handling mouse zygotes
Borosilicate glass	Prime tech	B100-75-10-PT	For microinjection of mRNA
Micropipett puller	Sutter instrument	P-97/IVF	For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm)
Microforge	Narishige	MF-900
mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit	Thermo Fisher scientific	AM1340
Poly (A) tailing kit	Thermo Fisher scientific	AM1350
PVP solution 10% (PVP-HTF)	IrvineSceientific	99311	HEPES buffered HTF containing 10% PVP
Sodium HEPES	Sigma	H3784
pTOPO eGFP-H2B			Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6)
NorthernMax Gly Sample loading Dye	Thermo Fisher scientific	AM8551	For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA
Phenol chloroform isamyl alcohol	nacalai tesque	25970-14
Chloroform	nacalai tesque	08401-65
Not I	TOYOBO	NOT-111X
Ethachinmate	WAKO	318-01793
3664 Otical power meter	Hioki	3664	Power meter for laser power
Stereomicmicroscope	Olympus	SZX16