写真漂白後のココヤシの蛍光回復により、完全な長期的開発クロマチン緩みの解析

要約

クロマチンの緩みは卵割球の進化の潜在性に関与することが表示されます。ただし、クロマチンの緩みを胚の発達の可能性を信頼性の高い指標として使用ことができるかどうかは知られていません。ここでは、クロマチン緩み評価受精卵が生じる完全な言葉こと実験的システムが記載されています。

要約

ライブ イメージングは、個体発生時分子事象の分析を可能にする強力なツールです。最近では、クロマチンの緩みや開放性多能性胚性幹細胞の細胞分化に関与する示されています。それは以前を比較した報告された胚性幹細胞と受精卵港の全能性との関連を示唆している非常にゆるめられた chromatin の構造。しかし、今までは、それが解決されていないこの非常に緩和/オープン クロマチン構造は萌芽期の進化の潜在性のために重要かどうか。本研究ではこの仮説を調べる蛍光によって分析されたどの受精卵の写真漂白後の回復の重要な損傷なしに開発することが実験的システムが開発されました。重要なは、この実験システムには、共焦点レーザー走査型顕微鏡に加えて魔法瓶プレート ヒーターのみが必要があります。この研究の調査結果は、写真漂白 (FRAP) 解析は, クロマチンの分子のイベントは完全な長期的開発のために重要かどうかを調査する使用ことができます後の蛍光回復をお勧めします。

概要

受精後クロマチン構造を動的に変更し、, クロマチン構造は最終的に確立された^1,2。この間、父方の前核の支配的なクロマチン蛋白はヒストンにプロタミンから変更されます。結果クロマチンは精子と女性の卵子 (例えば、ヒストン バリアント組成、ヒストン修飾) いくつかの点で非常に異なる。したがって、形成された胚性クロマチンはその後の胚発生に重要であると考えられます。ただし、長期間にわたって, クロマチン構造の詳細を明らかにするための努力にもかかわらず受精卵の質を評価するまたは彼らのクロマチン構造を分析することによって 1 セル段階で完全な長期的開発を予測する方法はなかった設立。

以前の研究では、受精卵が非常に緩んでクロマチン構造³ある発見します。現在、クロマチンの緩みや開放性は、胚性幹 (ES) 細胞⁴潜在的な細胞の分化の重要な要因であると考えられています。ES 細胞、本質的に同質性を示さないが、むしろ異種;ES 細胞コロニーのいくつかは一過性高い微分の潜在性の 2 つのセル段階の胚の割球に匹敵するを取得します。この過渡期状態のような 2 つのセルに ES でクロマチン緩みセル 2 細胞期胚⁵と同等であるかに変更をします。したがって、クロマチンの緩みは、重要である細胞微分の潜在性、それは受精のクロマチンを広く開くことが可能とはココヤシの進化の潜在性の評価に有用なようです。

ライブ イメージングは、以来、このメソッドは、後続の開発とも完全な長期的開発⁶個体発生時分子事象の分析を可能にする強力なツールです。ライブ イメージングの方法のひとつとして、FRAP 解析は、着床前の胚や ES 細胞^3,4,5におけるクロマチンの緩みを確認する使用されています。FRAP 解析による胚性クロマチン緩みを完全な長期的開発に悪影響を及ぼすことがなく分析する場合、1 セル段階の胚の質の評価のための貴重なツールがあります。しかし、この実験法によって完全な長期的発達に及ぼす影響を行った。最近では、ココヤシのクロマチンの緩みを評価する FRAP を用いた実験機が開発されました。これは、受精卵のための新しい観測システムは、ので、ココヤシ FRAP (zFRAP) と名付けられました。zFRAP は完全な長期的開発を批判的に影響しなかったし、されている⁷は別途報告します。本報告ではこの実験法のプロトコルの説明します。

プロトコル

本研究は、ケアと山梨大学の実験動物の使用のためのガイドの推奨事項に厳密に従って行った。プロトコルは山梨大学の動物実験の倫理委員会によって承認された (許可番号: A24 50)。Tribromoethanol 麻酔下ですべての手術を行った、すべての努力が苦しみを最小限に抑えるために作られました。手順とタイム テーブルの説明された概要はそれぞれ図 1と表 1のとおりです。

1. 調製されたメッセンジャー RNA (eGFP H2B mrnaの生体外のトランスクリプション)

1. 30 Uのテンプレート DNA pTOPO eGFP H2B^3、7の 5 μ g をリニア化私37 ° C で 50 μ L で一晩します。
2. 電気泳動法で完全に消化されるかどうか確認のため消化の DNA の 1.5 μ L を収集します。
   1. 1.5 μ L と未消化の DNA, 2% の agarose のゲルの井戸の中に染料を読み込むとあり、電気泳動の 3-5 μ L を適用します。
      注: 完全に消化して、単一のバンド (約 5 kb) が観察されます。未消化の DNA は、別の位置に表示されるコントロールとして使用されます。
3. 追加 ddH₂O の 151.5 μ L、200 μ L 残りのフェノール/クロロホルム/イソアミル アルコール (25:24:1) の DNA を消化します。
   1. 渦によって精力的にミックスします。
   2. 15 分の最大速度の遠心分離機します。
4. 上清を回復し、クロロホルムの 200 μ L を追加します。
   1. 渦によって精力的にミックスします。
   2. 15 分の最大速度の遠心分離機します。
5. 上清を回復し、20 μ L の 3 M 酢酸ナトリウムと ethachinmate の 1.5 μ L 追加。
   1. 渦によって精力的にミックスします。
   2. 100% エタノールの 550 μ L を追加し、精力的に渦によるミックスします。
   3. 15 分の最大速度の遠心分離機します。
   4. 上澄みを廃棄し、その後、70% エタノールでペレットを洗います。
   5. 5-10 分の蒸発によって沈殿を乾燥させます。
6. ヌクレアーゼ フリー水の 8 μ L で沈殿したプラスミド DNA を溶解します。
7. プラスミド濃度の評価 (予想される濃度は約 300-500 ng/μ L) の製造元の指示に従って、nanodrop と。
8. 製造元の指示に従い、全反応量の 20 μ L のテンプレートとして浄化された DNA の 1 μ g と eGFP H2B をエンコーディング mRNAの in vitro転写を実行します。
   1. In vitro転写後水の 36 μ L を追加し、(ポリ A) なし、電気泳動による分析合成された mRNA の 56 μ L から 1.5 μ L を回復します。
9. 100 μ L 反応量の合成された mRNA のポリ A テーリングを実行するには、製造元の指示に従ってください。
10. EGFP H2B の尾 mRNA ポリにリチウム塩化物の沈殿物溶液の 60 μ L を追加し、精力的にミックスします。
    1. -30 ° c で 30 分間冷やします。
    2. 15 分の最大速度の遠心分離機します。
    3. 上澄みを廃棄し、その後、70% エタノールでペレットを洗います。
    4. 5-10 分の蒸発によって沈殿を乾燥させます。
11. 30 分の 55 ° C に加熱することにより、ヌクレアーゼ フリー水の 20 μ L でペレットを溶解します。
12. Nanodrop で沈殿した mRNA の濃度を評価します。使用するまでヌクレアーゼ フリー水と-80 ° c ストア 500 ng/μ L に希釈します。
13. 最寄りの mRNA 生産; を確認します。対象有無による mRNA の 1 μ L (それぞれ 1.8.1 と 1.12 の手順で得られた) ポリ臭化エチジウム 0.1 mg/mL の 1.5 μ L と 3 μ L の電気泳動分析サンプル読み込み色素混合尾。適用されたボリュームは、5.5 μ だった。
    注: ポリ A のテーリングが成功した場合ポリ、テーリングなく mRNA と比較してシフトのバンドには (図 2 a) が観察すべき。

2. 精管男性マウスの作製

1. 体重計を使用して 8-12 ヶ月で icr 系雄マウスの重量を量る。
2. 0.7 - 0.9 mL 1.2 %tribromoethanol 麻酔雄マウス腹腔内注入します。
   注: 麻酔の量は、マウスのサイズによって異なります。たとえば、マウスの体重 40 g 0.8 mL tribromoethanol 麻酔の注射します。
3. 70% エタノールでベリーを濡れています。
4. 小さな果実 (3 ~ 5 mm) を切り、はさみの助けを借りて筋肉壁に切開をするをします。
   注: ハサミ、鉗子で手術を開始する前の 70% エタノールで洗浄する必要があります。
5. 脂肪パッドを鉗子でつかんで、ゆっくりと引き出します。その後、精巣と輸精管が表示されます。
   注:輸精管は、U 字管と赤い血管。
6. 手術用縫合糸の 2 つの時点の輸精管を縛るし、結ばれたポイント間の中間部分を切り出してください。
7. ゆっくり押し戻します脂肪パッドと精巣ベリー。
   1. 残りの精巣の手術を繰り返します。
8. 手術用の縫合糸で 2 針で筋肉壁を縫います。

3. 体外受精

1. 8 - 10 週間の古い女性 B6D2F1 を注入 (BDF1) マウス腹腔内 7.5 IU 馬絨毛性ゴナドトロピン (eCG) とひと絨毛性ゴナドトロピン (hCG) 46-50 h 間隔で。
2. 精子の授精 30 mm 皿の体外受精前に 1 日 300 μ L 人間卵管液 (HTF)⁸メディアの滴を準備、実験室ベンチに鉱物油とこれらの滴をカバーし、インキュベーターで一晩 preincubate。
3. 頚部転位によって成熟雄 ICR マウスを犠牲に。27 G 針と馬尾精巣上体を解剖し、精子を収集します。HTF のメディアに 38 ° C で 1-2 時間の 300 μ L 精子受精能獲得のためそれらを文化します。
4. hCG 注射後 16 h は、頚部転位によって超排卵の雌マウスを犠牲します。HTF のメディアの横にある鉱物油に卵管膨大部に転送し、引いて卵丘細胞と卵母細胞の複雑なこの卵管膨大部から 30 G 針による授精授精 HTF 媒体に。
   注:いくつかのメスのマウスは、しばしば、スーパー排卵治療にもかかわらず排卵を表示されません。拡大卵管膨大部は、排卵のサインです。
5. 精子受精能獲得後、排卵卵子が収集された授精 HTF メディアに容量制約をもつ精子の 2-3 μ L を転送します。
6. 1 h、授精後受精受精卵を収集し、100 μ g/mL CZB⁹メディアで 10 分間でヒアルロニダーゼとそれらを扱います。
   注:人工授精は正しく実行されると、1 h、授精後 2^nd極体と受精受精卵が観察されます。以下または低品質の精子を使用する場合は、2^nd極体と小さな受精卵のみが観察されます。また、多くの精子は授精用、多精子侵入が発生します。適切な人工授精は、男性と女性の前核と受精卵につながります。これらの基準を使用して、かに人工授精を行うかどうかを見つけることが可能です。
   1. CZB メディアで洗浄後、eGFP H2B mRNA マイクロインジェクションの第二極体と受精卵を対象します。

4. 準備室とマイクロインジェクション ピペット

1. エンコード eGFP H2B ヌクレアーゼ フリー水を使用して 250 ng/μ L の濃度を取得する RNA を希釈します。
2. PVP HTF の 2 〜 3 滴を準備、および eGFP H2B mRNA が値下がりしましたし、5-6 滴 Hepes バッファー 60 mm ディッシュに CZB (H CZB) が値下がりしました。鉱物油とこれらの滴をカバーします。
   注: これらの準備作業は、研究室のベンチに実行できます。薄層流れのキャビネットを使用する必要はありません。
3. ホウケイ酸ガラス マイクロ ピペットの引き手を引く (例えばP = 500、熱 825、プルを = = 30、ヴェル = 120 と時間 = 200)
4. ピペットの先端を分解した後、マイクロフォージを使用して 30 ° のまわりで引っ張られたガラス マイクロインジェクション ピペット チップ (−300 μ m バック) に近いを曲げます。

5. マイクロインジェクション

1. MRNA の注入中に、ピエゾと受精卵の殺害を防ぐためにマイクロマニピュレーターを舞台にプレート ヒーターの電源を切ります。
2. 洗ってコート HEPES バッファー HTF で注射針の内側 10% を含む対人 (PVP HTF)。
3. 2^nd極体 (図 2 b) と受精受精卵を収集し、商工会議所と接続されている顕微鏡ステージ上に 20-25 受精卵を転送します。
4. ホウケイ酸ガラス管先端からに希薄 eGFP H2B mRNA を入力します。
5. ホールディング ピペットで受精卵を押しながら、透明帯とピエゾ ドライブとゾル性細胞質膜を破る。
6. 約 10 の注入、受精卵の細胞質に mRNA の pL。長い保育器外受精卵の培養による被害を防ぐために 10 分以内 mRNA 注入を終了します。
   注:注入量は、2^nd極体と同じ大きさにする必要があります。注入 mRNA の量が大きすぎる場合、無料 eGFP H2B の分数は、モバイルの割合に影響を与える可能性がありますが発生する可能性は。
7. マイクロインジェクション後、10 分は少なくとも 3 滴で洗うし、zFRAP 解析まで 38 ° C で CZB で注入された受精卵を培養します。

6. zFRAP 分析

1. zFRAP 分析の前に 1 h は、レーザーと共焦点顕微鏡のステージにホット プレートを入れます。38 ° C の温度を設定します。
2. HEPES バッファー CZB メディアの 6-10 μ L 60 mm ガラス底皿に鉱物油で覆われて、暖かいに置くヒーター受精卵のコレクションまで。
3. 8 - 受精後 12 h は、収集 5 10 eGFP H2B 表現する受精卵との 6-10 μ L に転送で加温 HEPES バッファー CZB 中型ドロップ。
   注: 5-10 eGFP H2B 表現する受精卵はインキュベーター外長く培養を避けるため、各解析で使用されました。5 に 10 の受精卵は、1 h 内で分析できます。
4. 製造元の指示に従って漂白と撮像条件を設定します。共焦点レーザー走査型顕微鏡 (材料表) の場合を以下に示します。
   1. 使用油レンズ X 60 (60 X 60 X 1.35/オイル)。
      注: レンズ高倍率 (高い開口数) を高い感度で。
   2. 「取り込み設定」(補足図 1) の「512」として 4.0 μ s/ピクセルとサイズのスキャン速度を設定します。
   3. 「5」(補足図 1) にデジタル ズームを拡大します。
      注: より高いズーム フォーカス ドリフトが発生したかどうかを認識する必要です。
   4. 染料一覧 (補足図 1) と、選んだ「EGFP」を開きます。1.6 と観測時刻を設定 s (間隔は「フリーラン」で設定されて) (補足図 1)
      注: より多くの観測点より詳細なデータを引き起こす可能性がありますが、それはまた、光毒性を引き起こすことがあります。ZFRAP 分析で 1.6 s 観測時間はクロマチン緩みの親の非対称性を検出する十分なようです。
   5. 合計 (補足図 1) の 12 の画像の数を設定します。
   6. 「刺激の設定」パネルを起動し UseScanner の「メイン」をクリック。スキャン 10.0 μ s/ピクセルとして速度を設定します。「シリーズの活性化」をクリックし、「5 秒」(補足図 1) として「3 フレーム」とアクティベーション時間自動アクティブを設定します。
   7. 「フォーカス x 2」をクリックして、フォーカスを設定し、"Stop"。
   8. 漂白とレーザー パワーをイメージング設定 (477 nm) 110 と 15 μ で、それぞれ調整することによって「レーザー ゲージ力」(補足図 1)。
      注: 非常に強力な漂白剤定量分析のための困難を引き起こす大きい漂白周辺地域を引き起こす可能性があります。レーザー パワーの測定、電源メーターを使用します。レーザー パワーの時間による劣化の影響を避けるためのレーザー出力を確認することが重要です。
   9. 刺激の設定パネルで「クリップ Rect」(補足図 1) をクリックしてします。(ROI; 赤の関心領域を設定します。ROI # 1 b) 40 x 40 ピクセル (7.6 μ²) として。準備参照地域 (REF; 緑;投資収益率 #2) とバック グラウンド (BG; 青;投資収益率 #3) を使用して「ROI"コピペ」投資収益率"(マウスの右ボタン)。
      注: ピクセル サイズは、ROI にカーソルがあるときにマウスの右ボタンをクリックして呼び出すことができます「ROI マネージャー」で設定できます。大きい・ ロワは、zFRAP スコアのばらつきを標準化するには良いと考えられています。ただし、投資収益率が大きすぎるは使用できませんこの分析の核小体の前駆体 (NPB) を避けることは困難といえます。この区画に eGFP H2B はクロマチンから自由であると考えられて、驚くべき高いモビリティ³を示した。可能な限り、ROI と REF の領域を区切ります。これらの 2 つの領域が近い場合に漂白可能性がありますも REF の地域が影響します。
   10. ツール ・ バーの「ライブ」をクリックし、「ライブ プロット」(補足図 1)。
       メモ: ライブ プロットごとの ROI 内の蛍光信号強度を示します、HV を使用してレーザー出力を調整するため使用されます。ROI を選択しない場合、ライブ プロット パネルのない強度だろう検出されることに注意してください。
   11. ROI の位置を決定します。
       注: 投資収益率は、前核の目的の位置にドラッグして移動できます。(1) 核小体を避けるために、(2) 核質に全体の投資収益率を合わせてください。ROI の原子膜 (細胞質) の領域の外側の領域は含まれません。EGFP H2B のローカリゼーションは、投資収益率に細胞質が含まれているかどうかまたはない eGFP H2B の蛍光性を見つけやすいように高い核質に制限されています。男性の前核は 2^nd極体近くローカライズされます多くの場合、女性のものよりも大きくなる傾向があります。これらの基準を使用している間、男性または女性の前核を判断します。
   12. 「フォーカス x 2」をクリックして (補足図 1) し、2000 年頃に蛍光強度に EGFP のチャンネルの HV 電源ゲージを調整 (蛍光強度は「ライブ プロット」ウィンドウで見ることができる)。
5. ZFRAP 分析を開始するには、「時間」し、"XY"(補足図 1) をクリックします。
   注:「Time」ボタンを適切に選択すると、"t"が"XY"ボタンに表示されます。
   1. 「やったシリーズ」(補足図 1)、FRAP イメージング「XY ボタン」に近いし、、FRAP 解析データを入手した後に表示されるをクリックします。
   2. 「2 d ビュー画像 XXXXX」で最寄りの名前付きファイル (oib。 ファイル形式) として"として保存"ファイルを保存 (Ctrl + Shift + S も使用できます)。
   3. BG、REF、ROI を選択し、クリックして (Ctrl キーを押しながら A キーも使用できます) 2次元画像を表示」ウィンドウで「時系列解析」。
   4. FRAP の行データを取得し、「保存」ライブ プロット ウィンドウでボタンをクリックします。
      注: 行 FRAP 定量的データは csv ファイルとして保存されます。
6. ZFRAP コントロールなしの蛍光観察を避けるためにガラス底培養皿の縁に近いドロップに mRNA を注射された受精卵のいくつかを置きます。

7. データの計算

1. 使用しながら得られた量的データは (以下、補足を参照してください excel ファイル) いくつかの変更を参照^3,7に示すように「回復曲線」と Excel で「モバイル率」グラフを作る。
2. 各時点の 12 枚の写真でこれらの投資収益率と REF から BG の値を減算して相対強度を計算します。
3. REF の投資収益率の値を分割します。その結果、各時点での 12 の標準化された相対強度スコアが得られます。
4. 写真漂白の前に撮影した 3 つの画像の ROI の相対的なスコアの平均値を計算します。
5. 回収率を計算します。分割、12 写真漂白 (7.1.3 で取得) の前に相対的なスコアの平均で各時点 (7.1.2 で取得) で撮影した画像の ROI の相対的なスコアを得られます。これらのスコアを使用して回復曲線を描画する (図 2 e)。
6. 漂白のレートを計算します。
   注: 漂白率 (%) = 100 - 4^thイメージの回収率。
7. 次のとおり^10、11,12として数式を使用してモバイルの割合 (MF) の計算します。
   MF (%) = (終点) - 12^回回収率 4^回回収率率 × 100 を漂白/。

8. 胚移植

1. 8-12 ヶ月雄 ICR マウスの精管胚転送一晩同じケージでそれらをさせることで前に、の晩に成熟した ICR 雌を仲間します。
2. ZFRAP 分析をされ、2 細胞期に開発する決定胚を収集します。
3. 腹腔 - 0.7 0.9 mL 1.2 %tribromoethanol 麻酔または 0.35 - 胚移植前に 0.75/4/5mg/kg メデトミジン、ミダゾラム、ブトルファノール混合剤の 0.45 mL 雌マウスを注入します。
   注: 麻酔の量は、マウスの体重によって決まります。Tribromoethanol: 0.2 mL/10 g の体重。メデトミジン/ミダゾラム/ブトルファノール混合剤: 体重の 0.1 mL/10 g。
   1. 0.5 日のポストの coitum (dpc) で膣にプラグと偽女性 ICR マウスの卵管にこれらの 2 つのセル段階の胚を転送します。
   2. 胚移植後に目を覚ますまでは 37 ° C に設定器の雌マウスを置きます。
4. 18.5 dpc で頚部転位によって代理母を犠牲にし、帝王切開による受精卵の zFRAP 分析から派生した子犬を復旧します。いくつかの回復された子犬は育てる母親に配信され、彼らの体重は毎週を評価しました。

結果

eGFP H2B と zFRAP 分析

適切に作られるエンコーディング eGFP-H2B、移されたバンドによるポリ (図 2 a) テーリングと見られている、mRNA は、授精 (図 2 b) 後 1-3 h、第 2 極体と受精卵の細胞質に注入されました。8 〜 12 の授精後 h、H2B eGFP の発現を示す 2 前核と受精卵は収集され、zFRAP 分?...

ディスカッション

本研究で明らかになった、zFRAP 解析は完全な長期的開発、このメソッドが分子イベントと胚の発育能の関係を明らかにする非常に有用なツールに重大な損傷を発生しません。それらの細胞の差動電位になる 2 つのセル段階の胚のほどまで ES 細胞の状態のような 2 つのセルにプログラムし直す時にクロマチン緩みは 2 細胞期胚⁵と対等であるに変わります。したがって、, クロ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Confocal laser scaning microscope	Olympus	FV1200	FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7)
Thermo plate	Tokai Hit	TP-110RH26
Inverted microscope	Olympus	IX71
Micro manupilator	Narishige	MMO-202ND
Pieze Micro Micromanipulator	Prime tech	PMAS-CT150
35 mm culture dish	Falcom	351008	35 x 100 mm style; for IVF
60 mm culture dish	Falcom	351007	60 x 15 mm style; for embryo culture
50 mm culture dish	Falcom	351006	50 x 9 mm style; for manipulation on the stage
50 mm glass bottom dish	Matsunami	D910400	50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis
Mineral oil	Organic spceiality chemicals	625071	For FRAP analysis on the glass bottom dishes
Mineral oil	Sigma	M8410-1L	For IVF and embryo culture
glass capillary	Drummond	1-000-1000	For handling mouse zygotes
Borosilicate glass	Prime tech	B100-75-10-PT	For microinjection of mRNA
Micropipett puller	Sutter instrument	P-97/IVF	For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm)
Microforge	Narishige	MF-900
mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit	Thermo Fisher scientific	AM1340
Poly (A) tailing kit	Thermo Fisher scientific	AM1350
PVP solution 10% (PVP-HTF)	IrvineSceientific	99311	HEPES buffered HTF containing 10% PVP
Sodium HEPES	Sigma	H3784
pTOPO eGFP-H2B			Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6)
NorthernMax Gly Sample loading Dye	Thermo Fisher scientific	AM8551	For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA
Phenol chloroform isamyl alcohol	nacalai tesque	25970-14
Chloroform	nacalai tesque	08401-65
Not I	TOYOBO	NOT-111X
Ethachinmate	WAKO	318-01793
3664 Otical power meter	Hioki	3664	Power meter for laser power
Stereomicmicroscope	Olympus	SZX16