Zygotic 형광 복구 사진 표백 후 전체 기간 개발을 허용 하는 Chromatin 풀림에 대 한 분석

요약

Chromatin 설사 blastomeres의 발달 잠재력에 관련 된 것 처럼 보인다. 그러나, 그것은 알 수 없습니다 여부 chromatin 설사 배아에 대 한 발달 잠재력에 대 한 신뢰할 수 있는 인덱스로 사용할 수 있습니다. 여기, chromatin 설사 평가 zygotes 만기를 개발할 수 있는 실험 시스템 설명 하고있다.

초록

라이브 영상 ontogenesis 동안 분자 이벤트의 분석을 허용 하는 강력한 도구입니다. 최근, chromatin 풀림 또는 개방 만능 배아 줄기 세포의 세포질 감 별 법 잠재력에 포함 될 표시 되었습니다. 그것은 이전에 비해 알려졌다 배아 줄기 세포와 zygotes 항구 그들의 totipotency와의 연결을 제안 하는 매우 느슨하게 chromatin 구조를. 그러나, 지금까지 그것은 되지 해결 되었습니다이 매우 느슨하게/오픈 chromatin 구조 배아 발달 잠재력에 대 한 중요 한 인지. 현재 연구에서이 가설을 시험 하는 실험 시스템 형광에 의해 분석 된 어떤 zygotes 사진 표백 후 복구 기간 어떤 뜻깊은 손상도 없이 개발할 수 있는 개발 되었다. 중요 한 것은,이 실험적인 시스템만 보온병 플레이트 히터 confocal 레이저 스캐닝 현미경 이외에 필요 합니다. 이 연구의 결과 분석 (FRAP) 분석 사진 표백 zygotic chromatin에서 분자 이벤트 전체 기간 개발에 대 한 중요 한 인지 조사를 사용할 수 있는 후 그 형광 복구를 좋습니다.

서문

수정, 후 염색 질 구조를 동적으로 변경 하 고 zygotic 염색 질 구조는 다음 결국 설립된^1,2. 아버지 pronuclei에이 기간 동안 지배적인 chromatin 단백질 히스톤으로 protamine에서 변경 됩니다. 결과 chromatin sperms와 몇 가지 포인트 (예, 히스톤 변형 구성, 히스톤 수정) 여성 oocytes에서 매우 다르다. 따라서, 형성된 zygotic chromatin 이후의 배아 발달에 대 한 중요 한 것으로 생각 된다. 그러나, 오랜 기간 동안 zygotic chromatin 구조의 세부 정보를 공개 하는 노력에 불구 하 고 방법을 zygotes의 품질을 평가 하거나 1 셀 단계에서 그들의 전체-용어 개발의 염색 질 구조를 분석 하 여 예측 하는 적 설립.

이전 연구에서 그것은 발견을 zygotes 매우 느슨하게 chromatin 구조³. 현재, chromatin 풀림 또는 개방 세포 분화 배아 줄기 (ES) 세포⁴잠재력에 대 한 중요 한 요소가 될 여겨진다. ES 세포 자연, 동질성을 전시 하지 않습니다 하지만 오히려 다른 유형의; ES 세포 식민지, 일부 정도 높은 감 별 법 잠재력 blastomeres 2 셀 단계 배아의 비교를 획득. 상태 처럼 2 셀으로이 전환 중 ES에서 chromatin 설사 2 세포 단계 태아⁵와 비교에 변화 세포. 따라서, chromatin 설사 세포질 감 별 법 잠재력과 그것은 가능한 광범위 하 게 chromatin zygotes에서 열리는 중요 한 것 zygotic 개발 잠재력의 평가 위해 유용 하는 것 같다.

라이브 영상 때문에이 메서드는 후속 개발 및도 전체 용어 개발⁶수 있습니다 ontogenesis 동안 분자 이벤트의 분석을 허용 하는 강력한 도구입니다. 라이브 이미징 방법 중 하나로 FRAP 분석 preimplantation 배아와 ES 세포^3,,45chromatin 설사 검사를 사용 되었습니다. Zygotic chromatin 설사 FRAP 분석 개발 전체-용어에 해로운 효과 없이 분석할 수 있습니다, 만약 1 셀 단계에서 배아의 품질 평가 대 한 유용한 도구 수 있습니다. 그러나,이 실험 방법으로 전체 용어 개발에 효과 있다 하지 조사 되었습니다. 최근, FRAP를 사용 하 여 zygotic chromatin 풀림을 평가 하는 실험 시스템 개발 되었다. 왜냐하면이 zygotes 위한 새로운 관측 시스템, 그것 zygotic FRAP (zFRAP) 되 나 했다. zFRAP 전체 용어 개발을 비판적으로 미치지 않았다 고 되었습니다 보고 다른 곳에서⁷. 이 보고서에서이 실험 방법의 프로토콜을 설명 합니다.

프로토콜

이 연구는 관심과 야마나시 대학의 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에서 권장 사항을 따라에서 수행 되었다. 프로토콜 야마나시 대학의 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 (허가 번호: A24-50). 모든 수술 tribromoethanol 마 취하에 수행 했다 하 고 고통을 최소화 하기 위해 모든 노력 했다. 절차 및 타임 테이블의 그림된 개요는 각각 그림 1 및 표 1에 표시 됩니다.

1. 메신저 RNA (eGFP H2B mRNA의체 외에서 전사)의 준비

1. 하지 의 30 U 템플릿 DNA pTOPO eGFP H2B^3,7 의 5 µ g을 선형화 나 37 ° C에서 50 µ L에서 하룻밤.
2. 전기 이동 법에 의해 완전히 소화 여부 확인에 대 한 소화 DNA의 1.5 µ L를 수집 합니다.
   1. 1.5 µ L와 소화 되지 않은 DNA 전기 이동 법 및 2 %agarose 젤의 우물에 염료를 각각, 로드의 3-5 µ L를 적용 합니다.
      참고: 완전히 소화, 단일 밴드 (약 5 kb) 관찰 됩니다. 소화 되지 않은 DNA는 서로 다른 위치에 표시 되는 컨트롤으로 사용 됩니다.
3. DdH₂O의 151.5 µ L를 더하고 200 µ L 나머지를 페 놀/클로 프롬/isoamyl 알콜 (25:24:1)의 DNA를 소화.
   1. 적극적으로 소용돌이 의해 혼합.
   2. 15 분 동안 최대 속도로 원심.
4. 복구는 상쾌한 고 클로 프롬의 200 µ L를 추가 합니다.
   1. 적극적으로 소용돌이 의해 혼합.
   2. 15 분 동안 최대 속도로 원심.
5. 복구는 상쾌한 고 20 µ L 3 M 나트륨 아세테이트 및 ethachinmate의 1.5 µ L를 추가 합니다.
   1. 적극적으로 소용돌이 의해 혼합.
   2. 100% 에탄올의 550 µ L을 추가 하 고 적극적으로 소용돌이 의해 혼합.
   3. 15 분 동안 최대 속도로 원심.
   4. 삭제는 상쾌한 고 70% 에탄올과 펠 릿을 세척.
   5. 5-10 분에 대 한 증발에 의해 건조 한 펠 릿.
6. Nuclease 무료 물 8 µ L에서 침전 된 플라스 미드 DNA를 분해.
7. 플라스 미드 농도 평가 (예상된 농도 300-500 ng / µ L) 제조업체의 지시에 따라 nanodrop와 함께.
8. 제조업체의 지침에 따라 총 반응 볼륨의 20 µ L에서 템플릿으로 eGFP H2B 1 µ g의 정제 DNA와 인코딩 mRNA 녹음 방송 생체 외에서 수행 합니다.
   1. 녹음 방송 생체 외에서 후 물 36 μ를 추가한 다음 (로 하지 않고 폴 리 A) 전기 이동 법에 의해 분석에 대 한 합성된 mRNA의 56 µ L에서 1.5 µ L를 복구 합니다.
9. 제조업체의 지침에 따라 합성된 mRNA를 100 µ L 반응 볼륨에 대 한 폴 리 A 미행을 수행 합니다.
10. 폴 리의 eGFP H2B 꼬리 mRNA 리튬 염화 물 해결책 강수량의 60 µ L을 추가 하 고 적극적으로 섞는다.
    1. 30 분-30 ° C에 냉각 하십시오.
    2. 15 분 동안 최대 속도로 원심.
    3. 삭제는 상쾌한 고 70% 에탄올과 펠 릿을 세척.
    4. 5-10 분에 대 한 증발에 의해 건조 한 펠 릿.
11. 30 분 동안 55 ° C에 난방에 의해 nuclease 무료 물 20 µ L와 펠 릿을 디졸브.
12. Nanodrop와 침전 된 mRNA의 농도 평가 합니다. 사용까지 nuclease 무료 물과 저장소-80 ° C에서 500 ng / µ L를 희석.
13. 확인 기본 설정된 mRNA 생산; 제목/없이 mRNA의 1 µ L (얻은 1.8.1 1.12 단계, 각각) 폴 리 꼬리 0.1 mg/mL ethidium 평범한 사람의 1.5 µ L와 3 µ L 전기 이동 법 분석 샘플 로드 염료의 혼합. 적용 된 볼륨 5.5 µ L 이었다입니다.
    참고: 폴 리 A 미행에 성공 하면 폴 리는 미행 없이 mRNA에 비해 이동된 밴드 관찰 해야 (그림 2A).

2입니다. Vasectomized 남성 생쥐의 준비

1. ICR 남성 쥐 체중 규모를 사용 하 여 8-12 개월에 무게.
2. 0.7-0.9 mL 1.2 %tribromoethanol 마 취와 함께 남성 쥐를 주사 intraperitoneally.
   참고: 마 취의 크기는 마우스의 크기에 따라 달라 집니다. 예를 들어 마우스 무게 40 g tribromoethanol 마 취의 0.8 mL로 주사 된다.
3. 70% 에탄올과 베리 젖은.
4. 작은 베리에 (3-5 m m)를 잘라 이며가 위의 도움으로 근육 벽에 절 개를 확인 합니다.
   참고:가 위, 집게 청소 되어야 한다 70% 에탄올과 수술을 시작 하기 전에.
5. 집게와 지방 패드를 살짝 밖으로 당겨. 그러면, 고환과 vas deferens 나타납니다.
   참고: Vas deferens 는 U 자형 튜브와 빨간 혈관.
6. 수술 봉합 두 지점에서 vas deferens 에서 고 묶인된 점 사이의 중간 부분을 잘라.
7. 부드럽게 다시 지방 패드와 고환에 밀어 베리.
   1. 나머지 고환으로 수술을 반복 합니다.
8. 외과 봉합과 두 개의 바늘으로 근육 벽에 바느질도 해요.

3입니다. 시험관

1. 8-10 주 오래 된 여성 B6D2F1 주사 7.5 IU 말 chorionic 생식 샘 자극 호르몬 (eCG)와 인간의 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG) 46-50 h 간격에 intraperitoneally (BDF1) 쥐.
2. Capacitation 및 수정을 1 일전 30 mm 접시에는 IVF에 대 한 300 µ L 인간의 튜 유체 (HTF)⁸ 미디어의 방울을 준비 하 고 실험실 벤치에 미네랄 오일이 방울 커버 다음 하룻밤 인큐베이터에 preincubate.
3. 자 궁 경부 전위에 의해 성숙 된 남성 ICR 마우스를 희생. Cauda epididymis 27 G 바늘으로 해 부와 정자를 수집 합니다. 38 ° c.에 1-2 h HTF 미디어의 capacitation 300 µ L에 대 한 문화
4. hCG 주사 후 16 h는 자 궁 경부 전위에 의해 슈퍼 ovulated 여성 쥐를 희생. 수 란 관 ampulla HTF 미디어 옆 미네랄 오일으로 전송 하 고 후 적 운 세포와 복잡 한 oocytes에서에서 그릴이 수 란 관 ampulla 30 G 바늘 preincubated 인공 HTF 매체에.
   참고: 일부 여성 쥐 슈퍼 배 란 치료에도 불구 하 고 배 란 자주 표시 되지 않습니다. 확대 수 란 관 ampulla 배 란의 표시 이다입니다.
5. Capacitation, 후 2-3 µ L capacitated 정자의 수정을 HTF 미디어 ovulated oocytes 수집 된로 전송 합니다.
6. 1 시간 후에 수정, 수정 란된 zygotes 수집 하 고 hyaluronidase CZB⁹ 미디어에서 10 분 100 µ g/mL에서 그들을 치료.
   참고: 수정을 제대로 수행 되 면 수정, 후 1 h 2^nd 북극 시체와 함께 수정된 zygotes 관찰 된다. 또는 낮은 품질 정자를 사용 하는 경우 2^차 극 체와 작은 zygotes만 관찰 된다. 또한, 많은 sperms 수정을 위해 사용 하는 경우 polyspermy 발생 합니다. 적절 한 인공 zygotes 남성과 여성 pronuclei로 이끌어 낸다. 이러한 기준을 사용 하 여 수정을 잘 되었는지를 찾아야 가능 하다.
   1. CZB 미디어에서 세척, 후 두 번째 극 시체 zygotes eGFP H2B mRNA와 microinjection를 주제.

4. 준비 실 및 Microinjection의 펫

1. 희석 RNA eGFP H2B nuclease 무료 물 250 ng / µ L의 농도를 사용 하 여 인코딩.
2. PVP-HTF의 2-3 방울을 준비 및 eGFP H2B mRNA, 삭제 하 고 5-6 방울 Hepes 버퍼링 60 mm 접시에 드랍 스 CZB (H-CZB). 미네랄 오일이 방울을 커버.
   참고: 이러한 준비는 실험실 벤치에 수행할 수 있습니다. 공기 흐름을 층 류 캐비닛을 사용 하 여에 대 한 필요가 있다.
3. Micropipette 끌어당기는 사람와 붕 규 산 유리를 끌어 (예를 들어, P = 500, 열 = 825, 풀 30, 벨 = = 120, 및 시간 = 200)
4. 중단 후 피 펫, 팁은 microforge를 사용 하 여 30 °의 주위에 가져온된 유리 microinjection 피 펫 팁 (−300 다시 µ m) 주변을 구 부.

5입니다. microinjection

1. Micromanipulator mRNA 주입 중 한 피와 zygotes의 살인을 방지 하기 위해 무대에 플레이트 히터를 끕니다.
2. 워시와 HEPES 버퍼링 HTF에 주사 바늘의 내부 코트 10% 포함 된 PVP (PVP-HTF).
3. 2^차 극 체 (그림 2B)와 수정된 zygotes 수집 하 고는 micromanipulator와 연결 된 현미경 단계의 상공에 20-25 zygotes 전송.
4. 도움말에서 붕 규 산 유리 모 세관으로 희석된 eGFP H2B mRNA를 채우십시오.
5. 들고 피 펫과 접합 자 누른 다음 zona pellucida 및 피에 조 드라이브 cytosolic 막 휴식.
6. 약 10 주사는 zygotes의 세포질에 mRNA의 pL. 더 이상 인큐베이터 밖에 zygotes 경작으로 인 한 피해를 방지 하기 위해 10 분 이내 mRNA-주입 완료.
   참고: 사출 볼륨 2^nd 극 몸 만큼 큰 해야 합니다. 주입 하는 mRNA의 양을 너무 크면, 모바일 분수에 영향을 미칠 수 있습니다 무료 eGFP H2B 분수 발생 가능 하다.
7. microinjection, 후 10 분 이상 3 방울에 세척 하 고 zFRAP 분석까지 38 ° C에 CZB에 주입된 zygotes 문화.

6입니다. zFRAP 분석

1. zFRAP 분석, 이전 1 h 레이저 confocal 현미경의 단계에 연결 된 핫 플레이트에 설정. 38 ° c.에 온도 설정
2. 위에 6-10 µ L HEPES 버퍼 CZB 미디어의 60 m m 유리 하단 접시에 미네랄 오일으로 덮여와 따뜻한 히터 zygote 컬렉션까지.
3. 8-수정 후 12 h, 수집 5-10 zygotes eGFP H2B 표현 및 전송의 6-10 µ L로 미리 예 열 HEPES 버퍼 CZB 중간 드롭.
   참고: 인큐베이터 밖에 더 이상 경작을 피하기 위해, 5-10 eGFP H2B 표현 zygotes 각 분석에서 사용 되었다. 1 시간 이내 5 ~ 10 zygotes는 분석할 수 있습니다.
4. 제조업체의 지침에 따라 표백 및 이미징 조건을 설정 합니다. 경우는 confocal 레이저 스캐닝 현미경 (자료 테이블)는 아래와 같습니다.
   1. 사용 오일 렌즈 X 60 (60 X 60 X 1.35 / 기름).
      참고: 높은 배율 (높은 수 가늠 구멍) 쇼 높은 감도와 렌즈.
   2. 스캐닝 속도 4.0 µs/픽셀 및 크기 "512" "수집 설정" (보충 그림 1)로 설정 합니다.
   3. 증가 디지털 확대/축소 "5" (보충 그림 1).
      참고: 높은 줌 초점 드리프트 발생 하거나 하지 여부를 인식 해야 합니다.
   4. 염료 (보충 그림 1) 목록과 다음 선택 "EGFP"를 엽니다. 1.6 관측 시간 설정 s (간격 "무료 실행" 설정으로 설정 되어) (보충 그림 1)
      참고: 더 많은 관찰 포인트 더 자세한 데이터를 하지만 그것은 또한 phototoxicity를 발생할 수 있습니다. ZFRAP 분석에서 1.6 s 관측 시간 chromatin 풀림의 부모의 비대칭을 감지 하기에 충분 한 것으로 보인다.
   5. 총 (보충 그림 1)에서 12 그림의 수를 설정 합니다.
   6. "자극 설정" 패널을 시작 하 고 UseScanner에 "기본"을 클릭 합니다. 스캐닝 속도 10.0 µs/픽셀으로 설정 합니다. "시리즈에 활성화"를 클릭 하 고 설정 PreActivation "3 프레임" 및 활성화 시간으로 "5 초" (보충 그림 1).
   7. "포커스 x 2" 클릭 하 고 포커스를 설정 하 고 "중지".
   8. 표백 및 이미징 레이저 전원 설정 (477 nm) 110 및 15 µW에 각각으로 조정 "게이지 전원 레이저" (보충 그림 1).
      참고: 매우 강한 표백 정량 분석에 대 한 어려움을 일으키는 원인이 되는 더 큰 표백된 지역에 발생할 수 있습니다. 레이저 힘의 측정, 전력 측정기를 사용 합니다. 그것은 레이저 파워 레이저 힘의 시간 관련 저하의 효과 피하기 위해를 확인 하는 것이 중요입니다.
   9. 자극 설정 패널에서 "클립 Rect" (보충 그림 1)를 클릭 합니다. (투자 수익; 빨강; 관심 영역을 설정 투자 수익 #1B) 40 x 40 픽셀 (7.6 μ m²). 준비 참조 영역 (REF; 녹색; 투자 수익 #2), 그리고 배경 (BG; 파랑; 투자 수익 #3)를 사용 하 여 "ROI 복사" 및 "ROI 붙여넣기" (마우스 오른쪽 클릭 버튼).
      참고: 픽셀 크기는 커서가 ROI에 있을 때 마우스의 오른쪽 버튼을 클릭 하 여 호출할 수 있습니다 "ROI 관리자"를 통해 설정할 수 있습니다. 이후 그들은 zFRAP 점수의 분산을 표준화할 수 있습니다 나은 사람이 되도록 큰 ROIs 생각 된다. 그러나, ROI의 너무 큰 사용할 수 없습니다이 분석을 위해 그것은 어려운 핵소체 전조 몸 (일)을 방지 하기 때문에. 이 구획 eGFP H2B chromatin에서 자유를 생각 하 고 보여준 놀라운 높은 이동성³했다. 투자 수익 및 REF 영역 가능한 분리 되어야 한다. 이 두 영역은 긴밀, 표백 수 있습니다 또한 영향을 미칠 REF의 지역.
   10. 도구 모음에서 "라이브"를 클릭 한 다음 "라이브 플롯" (보충 그림 1)을 시작 합니다.
       참고: 라이브 작 각 ROI 내의 형광 신호 강도 나타냅니다 및 HV를 사용 하 여 레이저 파워를 조정 하기 위해 사용 됩니다. 투자 수익을 선택 하지 않으면 아무 강도 라이브 플롯 패널에 감지 것 참고.
   11. 투자 수익 위치 결정
       참고: 투자 수익 pronuclei의 원하는 위치로 드래그 하 여 이동할 수 있습니다. (1) 핵소체, 방지 하 고 (2)는 nucleoplasm에 전체 투자 수익 적합. 투자 수익에 핵 막 (세포질)의 영역 외부 영역을 포함 하지 않습니다. 쉽게 투자 수익 세포질 포함 여부 eGFP H2B의 형광을 찾을 수 있도록 eGFP H2B의 지역화는 매우는 nucleoplasm로 제한 됩니다. 남성 pronuclei 2^차 극 체 근처 지역화 종종 여성 보다 더 큰이 어 경향이 있다. 이러한 기준을 사용 하 여, 하는 동안 남성 또는 여성 pronuclei 판단.
   12. "포커스 x 2" 클릭 (추가 그림 1)는 HV 파워 게이지 채널의 EGFP 위한 형광 강도 약 2000으로 조정 (형광 강도 "라이브 음모" 창에서 볼 수 있습니다).
5. "시간" 및 다음 "XY" (보충 그림 1) zFRAP 분석 시작을 클릭 합니다.
   참고: "시간" 버튼 선택 적절 한 "t" "XY" 버튼에 표시 됩니다.
   1. 클릭 "시리즈 완료" (보충 그림 1), FRAP 이미징 후 나타나는 "XY 버튼" 근처 고 FRAP 분석 데이터.
   2. "2D 이미지 보기 XXXXX" 의해 기본 명명 된 파일 (oib. 파일 형식)으로 "다른 이름으로 저장" 파일을 저장 (Ctrl + Shift + S 또한 사용할 수 있습니다).
   3. REF, 수익과 BG를 선택 하 고 다음을 클릭 합니다 (Ctrl + A 또한 사용할 수 있습니다) "2D 이미지 보기" 창에서 "시리즈의 분석".
   4. 행 FRAP 데이터를 취득 하 고 "저장" 라이브 작 창에서 버튼을 클릭.
      참고: 행 FRAP 양적 데이터를 csv 파일로 저장 됩니다.
6. ZFRAP 통제, 형광 관찰에서 효과 피하기 위해 유리 하단 접시의 가장자리에 가까이 있는 드롭에서 mRNA와 주입 zygotes의 일부를 넣어.

7. 데이터 계산

1. 사용 하는 동안 얻은 정량적 데이터 참조^3,7 일부 수정 (참조 추가 하 고 아래 엑셀 파일)와 같이 "복구 곡선" 및 "모바일 분수" Excel에서 그래프를 확인 합니다.
2. 각 시간 지점에 대 한 12 그림에 투자 수익 및 REF의 BG의 값을 빼서 상대 강도 계산 합니다.
3. 심판의 투자 수익의 값을 나눕니다. 그 결과, 각 시간 지점에서 12 상대 강도 표준화 된 점수를 얻을 수 있습니다.
4. 3 이미지를 표백 하는 사진 전에 찍은 투자 수익에 대 한 상대 점수 평균을 계산 합니다.
5. 복구 속도 계산 합니다. 나누기 12 사진 (7.1.3에 획득) 표백 하기 전에 상대 점수의 평균 (7.1.2에서 획득) 각 시간 지점에서 촬영 한 이미지에 투자 수익에 대 한 상대 점수를 획득 합니다. 이 점수를 사용 하 여 복구 곡선 그리기 (그림 2E).
6. 표백 속도 계산 합니다.
   참고: 표백 비율 (%) = 100-4^번째 이미지의 복구 속도.
7. 다음과 같이^10,,1112 에서 수식을 사용 하 여 모바일 분수 (MF) 계산
   MF (%) = (끝점)-에서 12^번째 복구 속도 4^일 복구 속도 비율 × 100 표백 /.

8. 배아 전송

1. 8-12 개월 vasectomized 남성 ICR 마우스 배아 하룻밤 같은 장에 될 하 여 전송 하기 전에 밤에 성숙된 ICR 여성 친구.
2. ZFRAP 분석 되었고 냉동 단계로 개발 결정 배아를 수집 합니다.
3. 0.7-0.9 mL 1.2 %tribromoethanol 마 취 또는 0.35-0.45 mL 배아 전송 전에 0.75/4/5mg/kg medetomidine/midazolam/butorphanol 혼합된 대리인의 intraperitoneally 여성 쥐를 주입.
   참고: 마 취의 볼륨은 생쥐의 몸 무게에 의해 결정 됩니다. Tribromoethanol: 0.2 mL/10 g의 몸 무게; medetomidine/midazolam/butorphanol 에이전트 혼합: 몸 무게의 0.1 mL/10 g.
   1. 0.5 일 게시물 coitum (dpc)에서 질 플러그 pseudopregnant 여성 ICR 생쥐의 oviducts에 이들 2 세포 단계 배아를 전송 합니다.
   2. 배아 전송 후 37 ° C에서 설정 하는 그들이 깨어 때까지 히터에 여성 쥐를 넣어.
4. 18.5 dpc에서 대리 모 자 궁 경부 전위에 의해 희생 하 고 제왕 절 개에 의해 zFRAP 분석 zygotes에서 파생 된 새끼를 복구 합니다. 일부 복구 된 새끼 양 어머니에 게 전달 했다 고 그들의 몸 무게는 각 주를 평가 했다.

결과

eGFP H2B zFRAP 분석

제대로 생산 mRNA eGFP-H2B, 미행 (그림 2A) 폴 리로 인 한 이동된 밴드 볼, 인코딩 수정 (그림 2B) 후 1-3 h 2 극 시체 zygotes의 세포질으로 주입 했다. 8 12 수정 후 h, 2 pronuclei eGFP H2B의 식을 보여주는 함께 zygotes 수집 하 고 zFRAP 분석 (그림 2C)를 받게 했다. ?...

토론

이 연구에서 밝혀, zFRAP 분석 전체 용어 개발,이 방법은 분자 이벤트와 배아 발달 잠재력 사이 협회를 공개 하는 매우 유용한 도구 제안에 중요 한 손상을 발생 하지 않습니다. 그 세포의 차동 잠재력 된다 2 셀 단계 배아의 높은 ES 세포의 상태 처럼 2 셀으로 프로그래밍 하는 동안 chromatin 설사 변경으로 2 세포 단계 태아⁵와 비교 합니다. 따라서, zygotic chromatin 설사 배아 발달 잠재력...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Confocal laser scaning microscope	Olympus	FV1200	FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7)
Thermo plate	Tokai Hit	TP-110RH26
Inverted microscope	Olympus	IX71
Micro manupilator	Narishige	MMO-202ND
Pieze Micro Micromanipulator	Prime tech	PMAS-CT150
35 mm culture dish	Falcom	351008	35 x 100 mm style; for IVF
60 mm culture dish	Falcom	351007	60 x 15 mm style; for embryo culture
50 mm culture dish	Falcom	351006	50 x 9 mm style; for manipulation on the stage
50 mm glass bottom dish	Matsunami	D910400	50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis
Mineral oil	Organic spceiality chemicals	625071	For FRAP analysis on the glass bottom dishes
Mineral oil	Sigma	M8410-1L	For IVF and embryo culture
glass capillary	Drummond	1-000-1000	For handling mouse zygotes
Borosilicate glass	Prime tech	B100-75-10-PT	For microinjection of mRNA
Micropipett puller	Sutter instrument	P-97/IVF	For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm)
Microforge	Narishige	MF-900
mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit	Thermo Fisher scientific	AM1340
Poly (A) tailing kit	Thermo Fisher scientific	AM1350
PVP solution 10% (PVP-HTF)	IrvineSceientific	99311	HEPES buffered HTF containing 10% PVP
Sodium HEPES	Sigma	H3784
pTOPO eGFP-H2B			Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6)
NorthernMax Gly Sample loading Dye	Thermo Fisher scientific	AM8551	For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA
Phenol chloroform isamyl alcohol	nacalai tesque	25970-14
Chloroform	nacalai tesque	08401-65
Not I	TOYOBO	NOT-111X
Ethachinmate	WAKO	318-01793
3664 Otical power meter	Hioki	3664	Power meter for laser power
Stereomicmicroscope	Olympus	SZX16