שיטה ללמוד את פולימורפיזם C924T של הגן לקולטן של Thromboxane A2

Summary

בהווה לומדים, נתאר מתודולוגיה לניתוח של גנוטיפ C924T. הפרוטוקול מורכב משלושה שלבים: הפקת דנ א, ההגברה ידי תגובת שרשרת פולימראזית (PCR), וניתוח של ההגבלה שבר אורך פולימורפיזם (RFLP) על agarose ג'ל.

Abstract

הגן לקולטן (TBXA2R) thromboxane A2 הוא חבר של superfamily G-חלבון בשילוב עם אזורים transmembrane-7. זה מעורב atherogenesis התקדמות, איסכמיה, אוטם שריר הלב. כאן אנו מציגים מתודולוגיה של החולה genotyping לחקור את התפקיד post-transcriptional של פולימורפיזם C924T (rs4523) ממוקם באזור 3' של הגן הקולטן TBXA2. שיטה זו מתבססת על מיצוי DNA מדם שלם, פולימראז הגברה תגובת שרשרת (PCR) של החלק ג'ין TBXA2 שמכילה מוטציה C924T, וזיהוי של פראי סוג ו/או מוטציה אחרים באמצעות ניתוח תקציר ההגבלה, באופן ספציפי הגבלת שבר אורך פולימורפיזם (RFLP) על agarose ג'ל. בנוסף, התוצאות שאושרו על-ידי קביעת רצף הגן TBXA2R. שיטה זו כוללת מספר יתרונות פוטנציאליים, כגון יעילות גבוהה, זיהוי מהיר של פולימורפיזם C924T על ידי ה-PCR וניתוח אנזים הגבלה. גישה זו מאפשרת ניבוי מחקר על היווצרות הפלאק והתקדמות טרשת עורקים על ידי ניתוח החולה אחרים עבור פולימורפיזם TBXA2R C924T. יישום השיטה הזאת יש את היכולת לזהות נושאים רגישים יותר לתהליכים atherothrombotic, במקצועות מסוים בקבוצת סיכון גבוה, שטופלו אספירין.

Introduction

TBXA2R הוא חבר של superfamily G-חלבון בשילוב עם אזורים 7-transmembrane, אשר הביע נרחב ו לשפות אחרות או על קרום התא או על מבנים תאיים^1,2. מסלול איתות TBXA2R מעורב תהליכי טרשת עורקים מתקדמת³. ביטוי מוגבר של הקולטן TBXA2 הפגינו במהלך ההתקדמות atherogenesis, ומחקרים קליניים, ניסיוני מחקרים הראו תפקידה הרלוונטיים איסכמיה, אוטם שריר הלב⁴. C924T, פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד (הסנ פ) של הגן TBXA2R, הוכרו פולימורפיזם פונקציונלי מתנדבים בריאים, נקשר הפרעות קליניות⁵. יתר על כן, המחקר הקודם שלנו⁶ הפגינו פולימורפיזם C924T של הגן TBXA2R עוסקת התעתיק יציבות; באופן ספציפי, יש יציבות מוגברת של תמליל סוג מוטציה (TT) ביחס לסוג הפרוע (CC). בנוסף, מספר גירויים כגון אדנוזין diphosphate (ADP), אפינפרין, קולגן בריכוזים שונים המושרה צבירה טסיות פחות יעילים עבור סוג המוטציה (TT). . זה עקבי. עם היווצרות כגון מופחת, hemostasis. לפיכך, את חוסר היציבות של התעתיק. TBXA2R וצמצום המשויך של טסיות מצבור שעשויים להיות מקושרים עם תפקיד המגן גנוטיפ TBXA2R TT נגד atherothrombosis וסיבוכים שלה בחולים בסיכון גבוה שטופלו אספירין⁶ .

כאן, אנו מתארים מתודולוגיה genotyping המטופל לחקור את התפקיד post-transcriptional של פולימורפיזם C924T (rs4523) ממוקם באזור 3' של הגן הקולטן TBXA2. שיטה זו מתבססת על השלבים הבאים: (1) DNA החילוץ של דם, (2) PCR הגברה של החלק ג'ין TBXA2R המכיל את המוטציה C924T, וזיהוי (3) פראי סוג ו/או מוטציה אחרים באמצעות הגבלת אורך קטע פולימורפיזם (RFLP) על agarose ג'ל. RFLP היא טכניקה המנצלת וריאציות של רצפי DNA הומולוגי⁷. יישום זה נעשה שימוש כדי לאתר את ה-DNA פולימורפיזמים, במיוחד SNPs, וכדי למצוא ולשייך רלוונטיות ביולוגי וריאציות גנטיות⁸. פולימורפיזם מנותח בפעם הראשונה באמצעות RFLP-PCR בבני אדם היה דם ABO⁹. השיטה RFLP-PCR מאפשרת הניתוח של מוטציות גנטיות רצפי DNA הומולוגי המעריכה את הנוכחות של שברי באורכים שונים לאחר עיכול הדנ א באמצעות הגבלת ספציפי מאוד endonucleases¹⁰.

בהשנים האחרונות, למתודולוגיות הבאים כבר נעזרו הסנ פ ניתוח באמצעות טכניקת ה-PCR: הכלאה של קצר אלל ספציפי oligonucleotides¹¹, אלל ספציפי PCR¹², הארכת תחל ב DNA מיקרו-מערכים¹³, מצדו oligonucleotide assay¹⁴, ישיר DNA רצף עבור מיקום ספציפי נוקלאוטיד יחיד פולימורפיזמים מזהה¹⁵, שיטת Taqman¹⁶, מיצוי (Matrix-Assisted לייזר Desorption/יינון זמן-של-טיסה MALDI-TOF) ספקטרומטר מסה¹⁷, ו- GeneChips¹⁸. טכניקות אלה אינם פשוטים לשימוש, מחייבים ציוד יקר. לעומת זאת, בשיטת PCR-RFLP זולה, פשוטה לשימוש, נוח, יש יעילות גבוהה, ומאפשר זיהוי מהיר של פולימורפיזם C924T. בנוסף, אנחנו אישר את התוצאות על-ידי קביעת רצף הגן TBXA2R באמצעות שיטת סנגר ה¹⁵.

גישה זו מאפשרת מחקר חזוי של היווצרות הפלאק והתקדמות טרשת עורקים על ידי ניתוח החולה אחרים עבור פולימורפיזם TBXA2R C924T. שיטה זו יכולה לזהות נושאים רגישים יותר לתהליכים atherothrombotic, בפרט אלו בקרב חולים בסיכון גבוה, שטופלו אספירין.

Protocol

הפרוטוקול עוקב אחר הקווים המנחים של ועדת האתיקה במחקר הרפואי של האוניברסיטה של Chieti.

1. מגיב ההתקנה

1. הכנת המאגר טריס-EDTA (TE) (pH 8.0). להוסיף 200 µL של EDTA 0.5 M ו 1 מ"ל של Cl-טריס 1 מ' בתוך ולהביא 100 מ ל מים סטריליים. הריכוז הסופי של מאגר טה: 10 מ מ טריס-קלרנית, 1 מ"מ EDTA. לאחסן בטמפרטורת החדר (RT).
2. להכין 1 ליטר של 10 x פתרון מניות אלקטרופורזה מאגר (TBE). להמיס 108 גרם של טריס בסיס 55 גר' חומצת בור, 40 מ של EDTA 0.5 M (pH 8) לתוך גביע, ולהביא בנפח 1 ליטר מים סטריליים. החנות RT.
3. הכינו את הג'ל בטעינת צבע. להמיס 0.25 g של bromophenol כחול, 0.25 g של קסילן cyanol FF, 50 גרם של גליצרול, 1 מ מ EDTA (pH 8) ב 60 מ ל יונים או מים מזוקקים, ולהביא נפח של 100 מ ל מים סטריליים. לאחסן ב 4 ° C (במשך כמה חודשים) או ב-20 ° C (שנים)
4. להכין 200 מ של 2% agarose ג'ל. שימוש זה טרי או, לחילופין, לאחסן פני השטח למוצק-RT עבור עד מספר שבועות.
   1. להמיס 4 g של agarose ב 200 מ של מאגר x TBE 1 ב גביע 600 מ. מערבבים בעזרת מערבל מגנטי במשך כ- 5 דקות עד agarose מושעית לחלוטין.
   2. מחממים את הפתרון agarose 2% מים רותחים או על פלטה חמה (במשך כ 10 דקות, עד agarose זה התפרקה לחלוטין). שימו לב כי. הספל עם הג'ל agarose חייב להיות מכוסה ברדיד אלומיניום. לחלופין, מחממים את הספל חשפו במיקרוגל בטמפרטורה גבוהה למשך כ 3-5 דקות.
   3. מערבולת הפתרון 2% agarose באמצעות מערבל מגנטי, בודק agarose היא התפרקה לחלוטין.
      הערה: חלקיקי agarose מופיעים גם שקוף לפני התפרקות מוחלטת. יתכן צורך לחמם חלקיקים למשך מספר דקות (כ 5-10 דקות).
   4. אם חלק מאוחסנת של הג'ל agarose משמש, מחממים את הספל, מכוסה ברדיד אלומיניום, באמבט מים חמים (כ 60 מעלות צלזיוס) עד agarose מחוסלת. להסיר עם פיפטה פסטר "עקבות" של agarose הקרושה מפני השטח לפני לשפוך.

2. טיהור DNA

1. בצע את הפעולות הבאות לפני שמתחילים את הטיהור:
   1. השתמש דגימות דם אדם שלם טרי, או להפשיר דם קפוא דגימות מהר (במשך כ 2-3 דקות) באמבט מים (ב 37 מעלות צלזיוס) החלת של עצבנות קלה, ואז equilibrate כדי RT לפני השימוש.
   2. מערבבים דגימות דם טרי או המופשרים היפוך הצינורות מספר פעמים.
2. להתחיל את הליך טיהור על ידי ביצוע של הספק פרוטוקולים עבור 100 µL של • תנאי האחסון.
3. לכמת ולחשב את הטוהר של DNA מדידה את ספיגת-260, 280 ו- 320 ננומטר.
   1. להשתמש במים סטריליים כדי לדלל את הדגימות לכייל את ספקטרופוטומטרים.
   2. להחיל את הנוסחה הבאה, על מנת לחשב את הריכוז של דנ א = 50 µg/mL x (₂₆₀ − A₃₂₀) x פקטור דילול והטוהר של ה-DNA = (של₂₆₀ − A₃₂₀) / (₂₈₀ − A₃₂₀), עם יחס מקובל בין 1.7 1.9.

3. PCR הגברה של דגימות די אן איי

1. להכין µL 25 תערובת התגובה בשפופרת מיקרו-הגברה 0.2 מ"ל, כפי שמוצג בטבלה 1.
2. לבצע את ה-PCR-הגברה של דגימות ה-DNA מטוהרים באמצעות הצנטרפוגה תרמי אוטומטי, בעקבות התוכנית הגברה שמוצג בטבלה 2.
3. בסוף הגברה PCR, לעצור את תגובות PCR על ידי השארת דגימות ה-DNA ב 4 º C.

4. RFLP של מוצרי ה-PCR

1. מכינים 22.5 µL של מאסטר-מיקס פתרון עבור כל דגימה, כך אנזים הגבלה שנבחר מעכל את המוצרים PCR, כפי שמוצג בטבלה3.
2. העברת µL 2.5 של מוצר ה-PCR צינור PCR עבור כל דגימה, באמצעות פיפטה וטיפים מסנן.
3. להוסיף µL 22.5 של עיכול מאסטר-מיקס פתרון הצינורות המכילים המוצר PCR של כל דגימה, באמצעות פיפטה וטיפים מסנן.
4. דגירה תערובת התגובה (מאסטר-מיקס הפתרון והמוצר PCR) ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות.

5. ג'ל אלקטרופורזה ניתוח של ה-PCR-RFLP דגימות

1. הכתמים ג'ל agarose על-ידי הוספת אתידיום ברומיד (EtBr) ב- 0.5 µg/mL הג'ל במשך 10 דקות EtBr נקשר ל- DNA, אשר ניתן לאבחן מתחת לאור אולטרה סגול (UV).
   שים לב: חשוב להשתמש בכפפות והתקני הגנה אחרים במהלך הטיפול, אחסון, סילוק של EtBr, כי זה מוטגן עם פוטנציאל carcinogenicity.
2. יוצקים את הג'ל agarose מוכן לתוך מגש ג'ל עם המסרק טוב במקום, והמתן עד זה הינו פני השטח למוצק.
3. מקם את הג'ל agarose הקרושה לתוך התיבה ג'ל (אלקטרופורזה יחידה).
4. למלא את התיבה ג'ל עם 1 x TBE עד הג'ל מכוסה.
5. בעזרת פיפטה והעצות מסנן, טען µL 6 של התקציר מוגבר DNA (במיוחד, טען 5 µL של כל דגימה ו- µL 1 של ג'ל טעינת צבען) לתוך הבארות של הג'ל agarose. הוספת סמן גודל ה-DNA נפרדת היטב במקביל הדגימות.
6. הפעל את ג'ל למשך 20-30 דקות ב- 100 וולט.
7. עם UV-transilluminator, דמיינו שברי DNA cleaved או המוצרים PCR מעוכל, השוואת שברים עם דנ א גודל סמן, ויש לרשום את התוצאות על-ידי צילום ההוראות של היצרן.
   התראה: שימוש התקני הגנה (בטיחות משקפיים או מסיכת פנים) סביב מקורות אור UV.

תוצאות

מטרת שיטה זו היא להעריך את גנוטיפ קולטן Thromboxane A2 ביחס פולימורפיזם C924T. הגן האנושי TBXA2R ממוקם על 19p13.3, משתרע על פני 15 kbp, והיא מורכבת exons שלושה המופרדות על-ידי שני אינטרונים. C924T פולימורפיזמים של הגן TBXA2R (של 539 bp) היה מוגבר באמצעות תחל PCR שמוצג באיור 1, אשר היו מהונדסים כדי להגביר את אזור ה-DNA מסוים אבל לא של orthologous או אזור ספציפי paralogous. בנוסף, בוצע ניתוח RFLP באמצעות אנזים ההגבלה RsaI (איור 1) על המוצרים PCR, התוצאות היו דמיינו על ג'ל agarose, על מנת לאפיין את הסנ פ למדה ספציפיים.

בהתבסס על הנוכחות של אורכי קטעים שונים לאחר עיכול של ה-DNA, זה אפשרי להפלות גנוטיפ של החולה על פולימורפיזם C924T. למעשה, בדומה למוצג באיור 2, homozygosity של אלל הגדולות (CC) מציג שתי להקות (395, 144 bp), כי אנזים הגבלה בדיוק חותך את החלק ג'ין TBXA2R ב אתר פולימורפיזם C924T. Homozygosity של אלל מינור (TT) מומחש להקה יחיד (539 bp), מפני חיתוך אנזים הגבלה לא יתרחש. אלל (CT) משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים מציג שלוש להקות (539 395, 144 bp). כפי שמוצג באיור2, פולימורפיזם C924T, שהוגדרו על-ידי RsaI עיכול על מוצר ה-PCR, אושרה על ידי ניתוח רצף.

רכיב	נפח (µL)	ריכוז סופי
10 x PCR מאגר Tween-20 (15 מ' MgCl2)	0.25	1.5 MgCl2 mmol/L...
מיקס dNTP (10 מ מ)	1	מיקרומטר 200
תחל (קדימה) (10 pmol/מיקרומטר)	1	מיקרומטר 0.4/ΜL
תחל (הפוכה) (10 pmol/מיקרומטר)	1	מיקרומטר 0.4/ΜL
. אנזימים (U 5/µL)	0.2	U 1/ΜL
לטעום את ה-DNA (42 ng/µL)	1	42 ng/µL
DNase-חינם-מים	20.55
סה	25

טבלה 1: PCR הגברה ההתקנה. תערובת התגובה מאסטר-מיקס 25 µL להגדיר 0.2 מ ל PCR צינור כדי להגביר את דגימת DNA בודד.

תקן ה-PCR
צעד ראשוני הפעלת	5 דקות		95 ° C
3-צעד רכיבה על אופניים
דנטורציה	30 s		94 ° C
חישול	60 s		55 ° C
סיומת	60 s		72 ° C
מספר מחזורי		מחזורים
סיומת הסופי	8 דקות		72 ° C

בטבלה 2: PCR הגברה התוכנית. בצע כיוונון של הצנטרפוגה תרמי אוטומטי כדי לבצע PCR ומגבירים את תבנית ה-DNA. תגובות PCR מופסקים על ידי מצמרר על 4 מעלות צלזיוס.

רכיב	נפח (µL) (n = 1)	נפח (µL) (n = 10) *
10 x מאגר אנזים	2.5	27.5
אנזים הגבלה (U 5/µL)	0.5	5.5
DNase-חינם-מים	19.5	214.5
סה	22.5	247.5

טבלה 3: העיכול אנזים הגבלה של מוצרי ה-PCR- פתרון מאסטר-מיקס הינו מוכן כך אנזים הגבלה שנבחר מעכל את המוצרים ה-PCR. *: כדי להגדיר את פתרון מאסטר-מיקס 10 דוגמאות, להוסיף 10% יותר, ולבסוף ממציאה דגימות 11.

איור 1: PCR תחל, אנזים הגבלה RsaI. תחל ואחורה תוכנן עבור הגברה של חלק ג'ין TBXA2R 539 bp המכיל את פולימורפיזם C924T. RsaI הוא האנזים הגבלת שנבחרו כדי לזהות את האתרים GTAC. ˅: אתר חיתוך של האנזים RsaI. C(/T): C924T פולימורפיזם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: דפוס Electrophoretic ו- DNA רצף ניתוח. (א) C924T גנוטיפ מזוהה על-ידי RFLP התבנית לאחר עיכול עם האנזים RsaI ספציפיים. (B) DNA רצף ניתוח: התוצאות המתקבלות על-ידי RFLP לאחר עיכול עם האנזים הגבלת RsaI אומתו באמצעות ניתוח רצף מציג את פולימורפיזם C924T. איור זה השתנה מ דה Iuliis. et al., פרוסטגלנדינים & אחרים השומנים מגשרים⁶. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

במחקר הנוכחי, תארנו מתודולוגיה המאפשרת genotyping המטופל על מנת לחקור את התפקיד post-transcriptional של פולימורפיזם C924T (rs4523) ממוקם באזור 3' של הגן TBXA2R. ראשית, שיטה זו מסתמכת על מיצוי הדנ א של דם מלא. בפרט, התהליך הראשון מורכב הוא לטיהור סה כ- dna אנושי, גנומית, מיטוכונדריאלי, מדגימות דם טרי או קפוא, מטופלים עם EDTA (ציטראט או הפארין). לאחסון לטווח קצר של דגימות דם, לאחסן ב 2-8 ° C עד 10 ימים. עבור אחסון לאחסן מעל 10 ימים, דגימות ב-70 מעלות צלזיוס. תהליך טיהור אוטומטיות כולל 4 שלבים: lyse לאגד, לשטוף, elute. שנית, השיטה מסתמכת על PCR הגברה של החלק ג'ין TBXA2R המכיל את המוטציה C924T. לבסוף, מתבצע זיהוי פראי סוג ו/או מוטציה גנוטיפ באמצעות ניתוח אנזים הגבלה (RFLP) על agarose ג'ל.

השלבים הקריטיים בפרוטוקול הם הבאים: (i) במקרה שבו חלק של הג'ל agarose המאוחסן ב- RT משמש, agarose הקרושה יכול להיות מחדש מומס מעל אמבט מים רותחים (ב 60 מעלות צלזיוס במשך כ- 15-20 דקות) או בתנור מיקרוגל (3-5 דקות) לפני לשפוך. הערה: שחרר את הכובע כאשר מחדש נמס agarose בבקבוק. (ii), יתר על כן, כאשר חימום מחדש agarose, אידוי תגרום להגדלת הריכוז שלו. מסיבה זו, זה יכול להיות שימושי לפצות על-ידי הוספת נפח קטן של מים. (iii) DNA שברי פחות מ-1,000 bp היו מובחנת על ידי ג'ל agarose, מאגר TBE מומלץ על מנת לקבל את ההפרדה האפשרי הטוב ביותר. (iv) אנו מעדיפים להשתמש עם ג'ל agarose ולא ג'ל לזיהוי כי ההכנה של האחרונים קשה יותר, וזה לוקח הרבה זמן כדי להגדיר. (v) הבחירה של. משך בג'ל מסתמך על הגודל הצפוי של מוצרי הגברה. בהתבסס על פרוטוקול זה, זה מספיק לבצע אלקטרופורזה של 20-30 דקות ב- 100 וולט ב- 2% agarose ג'ל, כיוון הגודל של ה-PCR שברים נע בין 100-500 bp. (vi) היא חובה כדי לקבל 10 עד 50 ng של תבנית באיכות טובה שחולצו מן האדם דגימות ה-DNA . מסיבה זו, אנו מעדיפים להשתמש טיהור DNA אוטומטית במקום אחד חצי אוטומטית או ידנית. (vii) הכנת התגובה מאסטר-mix עבור הגברה PCR והפתרון מאסטר-מיקס לעיכול מוצרי ה-PCR, הוספת 10% יותר (לקחת בחשבון אובדן נוזלים במהלך pipetting) עוצמת הקול מחושב מוכפל במספר הדגימות עבור אמצעי האחסון הנדרש עבור אחד. דנ א.

מהמלכודת בתדירות הגבוהה ביותר של השיטה היא הנוכחות של מוצרי הגברה נוספת עקב תוכנית של שגוי הצנטרפוגה תרמי, הכנה מאסטר-מיקס של שגוי הגברה או זיהום תבנית ה-DNA. יתר על כן, העדר של מוצרי ה-PCR יכול להיות בגלל . אנזימים מוחלש או הצנטרפוגה תרמי שגוי של רוץ. בנוסף, הנוכחות של קטעים לא צפוי יכול להיות עקב זיהום מוצר ה-PCR או עיכול לא שלם של אנזים מוחלש, כמות קטנה מדי של אנזים הגבלה נפח, או זמן דגירה קצר מדי.

בשנים האחרונות, למתודולוגיות הבאים כבר נעזרו הסנ פ ניתוח באמצעות טכניקת ה-PCR: הכלאה של קצר אלל ספציפי oligonucleotides¹¹, אלל ספציפי PCR¹², הארכת תחל ב- DNA מיקרו-מערכים¹³ , oligonucleotide מצדו assay¹⁴, ישיר רצפי DNA לזיהוי מיקום ספציפי נוקלאוטיד יחיד פולימורפיזמים¹⁵, שיטת Taqman¹⁶, מיצוי Matrix-Assisted לייזר Desorption/יינון... ספקטרומטר מסה זמן-של-טיסה (MALDI-TOF)¹⁷, GeneChips¹⁸. שיטות אלה אינן אידיאלי מכיוון שהם אינם פשוטים להשתמש ו/או דורשים ציוד יקר. לעומת זאת, בשיטת PCR-RFLP המתוארים במחקר זה היא זולה, פשוטה לשימוש, נוח, יש יעילות גבוהה ומאפשרת זיהוי מהיר של פולימורפיזם C924T. מגבלה בשיטה הנוכחית היא כי זה יכול לשמש רק על מספר קטן של SNPs ועל כמה דוגמאות בהפעלה של עבודה.

עבור יישומים עתידיים, שיטה זו יכול לשמש ללימודי חזוי בדבר היווצרות הפלאק התקדמות טרשת עורקים על ידי ניתוח של אחרים החולה עבור פולימורפיזם TBXA2R C924T. יתר על כן, שיטה זו יכולה לזהות נושאים רגישים יותר לתהליכים atherothrombotic, בפרט, חולים בסיכון גבוה שטופלו עם אספירין. בסופו של דבר, יכול להיות מיושם בשיטה זו ללמוד אחרים פולימורפיזמים מעורב רפואה אישית עבור תרופות ספציפיות (לדוגמה, תרופות נגד קרישת דם, פרכוסים) על מנת להבין את המינון המתאים סמים ואת הפרט תרופתי ו תגובה קלינית עבור כל מטופל לפני תחילת הטיפול, כדי למנוע תופעות לוואי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
QIAsymphony SP	QIAGEN	937055
Spectrophotometer	EPPENDORF	6131-02222
UV-transilluminator	UVP	732-110
PCR tubes	EPPENDORF	H0030121589
PCR thermal cycler	EPPENDORF	5331-03721
Pipettors and filter tips	EPPENDORF	H4910000018/42/69 AND 0030067037/10/02
Horizontal minigel electrophoresis apparatus	DIATECH PHORESIS 10	RI002-10
Dry block heater	TWIN INCUBATOR	DG210
QIAsymphony DNA Midi Kit	QIAGEN	931255
10x PCR buffer (usually supplied by the manufacturer with the Taq polymerase)	DIATECH AND TAKARA	T0100 AND R0001DM
Taq polymerase	TAKARA	R0001DM
dNTP mixture	DIATECH  pharmacogenetics	NM001	dNTP MIX 10x 100 microliters, 10 mM
PCR primers	DIATECH  pharmacogenetics	\\
Restriction enzyme RsaI	New England biolabs	R0167L
Restriction enzyme 10x buffer	New England biolabs	R0167L
Agarose	Sigma	A9539	DNA fragments are best separated in TBE buffer
Tris base	Sigma	T6066
Boric acid	Sigma	B7901
0.5 M EDTA, pH 8.0	Sigma	E7889
10% (wt/vol) ammonium persulfate	Sigma	E3678	prepared fresh each time
EtBr (0.5 μg/μL)	Sigma	E8751
Bromophenol blue	Sigma	B0126
Xylene cyanol FF	Sigma	X4126
Glycerol	Sigma	G5516
DNA size marker	DIATECH  pharmacogenetics	R1002-10	Plasmide pBluescript II SK (+) restrict MSPI
Sterile water (autoclaved)	DIATECH  pharmacogenetics	\\