Eine Methode, um den C924T-Polymorphismus von Thromboxan-A2-Rezeptor-Gens zu studieren

Zusammenfassung

In der vorliegenden Studie, beschreiben wir eine Methodik zur Analyse des Genotyps C924T. Das Protokoll besteht aus drei Phasen: DNA-Extraktion, Verstärkung durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Analyse von der Beschränkung Fragment-Länge Polymorphismus (RFLP) auf Agarosegel.

Zusammenfassung

Das Thromboxan A2-Rezeptor (TBXA2R)-gen ist ein Mitglied der G-Protein-gekoppelten-Superfamilie mit sieben-Transmembranproteins Regionen. Es ist in der Atherogenese fortschreiten, Ischämie und Myokardinfarkt beteiligt. Hier präsentieren wir eine Methodik der Patienten Genotypisierung posttranskriptionale Rolleder C924T Polymorphismus (rs4523) befindet sich an der 3' Region des TBXA2-Rezeptor-Gens zu untersuchen. Diese Methode beruht auf DNA-Extraktion aus Vollblut, Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Verstärkung der TBXA2 gen Teil enthält die C924T-Mutation und Identifizierung von Wildtyp und/oder mutierten Genotypen mit einer Restriktionsanalyse verdauen, insbesondere eine Beschränkung Fragment Länge Polymorphismus (RFLP) auf Agarose-gel. Darüber hinaus wurden die Ergebnisse durch das TBXA2R Gen Sequenzierung bestätigt. Diese Methode bietet mehrere Vorteile, wie hohe Effizienz und die schnelle Identifizierung von C924T Polymorphismus von PCR und Restriktionsenzym Analyse. Dieser Ansatz ermöglicht eine vorausschauende Studie für die Bildung von Plaque und Progression der Atherosklerose durch die Analyse von Patienten Genotypen für den TBXA2R C924T-Polymorphismus. Anwendung dieser Methode hat das Potenzial, Themen zu identifizieren, die anfälliger für atherothrombotischer Prozesse in bestimmten Fächern in einer Gruppe mit hohem Risiko, Aspirin behandelt werden.

Einleitung

TBXA2R ist Mitglied der G-Protein-gekoppelten-Superfamilie mit sieben-Transmembranproteins Regionen, die allgemein ausgedrückt und lokalisiert die Zellmembranen oder auf intrazelluläre Strukturen^1,2. TBXA2R-Signalweg ist an fortgeschrittene atherosklerotische Prozesse³beteiligt. Erhöhte Expression des TBXA2-Rezeptors wurde während der Atherogenese Progression nachgewiesen und klinische und experimentelle Studien zeigten seine wichtige Rolle in Ischämie und Myokardinfarkt⁴. C924T, ein Einzel-Nukleotid Polymorphie (SNP) des TBXA2R-Gens wurde als eine funktionale Polymorphismus bei gesunden Probanden erkannt und zu klinischen Erkrankungen⁵verknüpft wurde. Darüber hinaus nachweislich unsere vorherigen Studie⁶ Transkript Stabilität der C924T Polymorphismus des TBXA2R-Gens beteiligt ist; insbesondere ist eine erhöhte Instabilität der mutierten (TT) Typ Abschrift gegenüber dem Wildtyp (CC). Darüber hinaus induzierte mehrere Reize wie Adenosin-diphosphat (ADP), Epinephrin und Kollagen in verschiedenen Konzentrationen Thrombozytenaggregation weniger wirksam für den mutierten Typ (TT). Dies steht im Einklang mit einer reduzierten Thrombusbildung und Blutstillung. So könnte die Instabilität der TBXA2R Abschrift und die damit verbundene Reduktion der Thrombozytenaggregation eine Schutzfunktion für die TBXA2R TT-Genotyp gegen Atherothrombosis und seine Komplikationen bei Patienten mit hohem Risiko Aspirin behandelt^{6 zugeordnet sein} .

Hier beschreiben wir eine Methodik für die Patienten Genotypisierung posttranskriptionale Rolleder C924T Polymorphismus (rs4523) befindet sich an der 3' Region des TBXA2-Rezeptor-Gens zu untersuchen. Diese Methode beruht auf den folgenden Schritten: (1) DNA-Extraktion aus Vollblut, (2) PCR Verstärkung der TBXA2R gen Teil mit der C924T-Mutation, und (3) Ermittlung der Wildtyp und/oder mutierten Genotypen mit Beschränkung Fragment-Länge Polymorphismus (RFLP) auf Agarosegel. RFLP ist eine Technik, die Variationen in homologen DNA-Sequenzen⁷nutzt. Diese Anwendung wurde DNA-Polymorphismen, vor allem SNPs zu erkennen und zu finden und zuordnen biologische Relevanz Genvariationen⁸verwendet. Polymorphismus, die zum ersten Mal mit der RFLP-PCR in Menschen analysiert wurde die ABO-Blut-⁹. Die RFLP-PCR-Methode ermöglicht die Analyse von genetischen Mutationen in homologen DNA-Sequenzen durch die Anwesenheit von Fragmenten unterschiedlicher Längen nach der DNA-Verdauung mit hochspezifischen Beschränkung Endonucleases¹⁰auswerten.

In vergangenen Jahren, die folgenden Methoden sind verwendet worden für die SNP-Analyse mit Hilfe der PCR-Technik: Hybridisierung von kurzen Allel-spezifische Oligonukleotide¹¹, Allel-spezifische PCR¹², Grundierung Erweiterung auf DNA-Microarrays¹³, Oligonukleotid Ligatur assay¹⁴, direkte DNA Sequenzierung für identifizierende Position-spezifische Einzel-Nukleotid-Polymorphismen¹⁵, Taqman-Methode¹⁶, Extraktion Matrix Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight) MALDI-TOF) Massenspektrometrie¹⁷und Genchip¹⁸. Diese Techniken sind nicht einfach zu bedienen und erfordern teure Ausrüstung. Umgekehrt, die PCR-RFLP-Methode ist kostengünstig, einfach zu bedienen, bequem, hat einen hohen Wirkungsgrad und ermöglicht die schnelle Identifizierung von C924T Polymorphismus. Darüber hinaus haben wir die Ergebnisse durch Sequenzierung des TBXA2R-Gens mit der Sanger-Methode¹⁵bestätigt.

Dieser Ansatz ermöglicht eine prädiktive Untersuchung der Plaquebildung und Progression der Atherosklerose durch die Analyse von Patienten Genotypen für den TBXA2R C924T-Polymorphismus. Diese Methode könnte Themen anfälliger für atherothrombotischer Prozesse, insbesondere diejenigen unter risikoreichen, Aspirin-behandelten Patienten identifizieren.

Protokoll

Das Protokoll folgt den Richtlinien der medizinischen Forschung-Ethik-Kommission der Universität Chieti.

(1) Reagenz Setup

1. Vorbereiten der Tris-EDTA (TE)-Puffer (pH 8,0). 200 µL EDTA 0,5 M, 1 mL der Tris-Cl 1 M in ein Becherglas und bringen auf 100 mL mit sterilem Wasser. TE-Puffer Endkonzentration: 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA. Lagerung bei Raumtemperatur (RT).
2. Bereiten Sie 1 L 10 x Stammlösung Elektrophorese Puffer (FSME). 108 g Tris-Base, 55 g Borsäure und 40 mL EDTA auflösen 0,5 M (pH 8) in ein Becherglas und zum Volumen von 1 L mit sterilem Wasser bringen. Shop bei RT
3. Bereiten Sie das Gel Farbstoff beladen. 0,25 g Bromophenol blue, 0,25 g Xylol Cyanol FF, 50 g Glycerin, 1 mM EDTA (pH 8) in 60 mL entionisiertem oder destilliertem Wasser auflösen, und auf ein Volumen von 100 mL mit sterilem Wasser zu bringen. Speichern Sie bei 4 ° C (für ein paar Monate) oder bei-20 ° C (seit Jahren)
4. Bereiten Sie 200 mL 2 % Agarosegel. Verwendung es frisch oder, Alternativ, speichern erstarrt bei RT für bis zu mehreren Wochen.
   1. 4 g Agarose in 200 mL 1 X TBE-Puffer in einem 600 mL-Becherglas auflösen. Rühren Sie mit einem magnetischen Mixer für ca. 5 min, bis die Agarose vollständig suspendiert ist.
   2. Erhitzen Sie die 2 % Agarose-Lösung in kochendem Wasser oder auf einer heißen Platte (für ca. 10 min, bis die Agarose vollständig gelöst ist). Beachten Sie, dass das Becherglas mit dem Agarosegel mit Alufolie abgedeckt werden muss. Alternativ erhitzen Sie den ungedeckten Becher in der Mikrowelle bei hoher Temperatur ca. 3 – 5 Minuten.
   3. Schwenken Sie die 2 % Agarose-Lösung mit einem magnetischen Mischer, prüfen, ob die Agarose komplett aufgelöst ist.
      Hinweis: Partikel der Agarose erscheinen als transluzente Körner vor der völligen Auflösung. Es kann wärmen Partikel für einige Minuten (ca. 5 – 10 min) erforderlich.
   4. Wenn eine gespeicherte Teil des dient das Agarosegel, erhitzen Sie das Becherglas, mit Alufolie bedeckt, ein Warmwasser-Bad (bei etwa 60 ° C) bis die Agarose wird aufgelöst. Entfernen Sie mit einer Pasteurpipette keine "Spuren" von erstarrten Agarose von der Oberfläche vor dem Gießen.

(2) DNA-Reinigung

1. Gehen folgendermaßen Sie vor Beginn der Reinigung:
   1. Verwenden Sie menschliche frischem Vollblut-Proben, oder Vollblut gefrorene Proben schnell (für ca. 2 – 3 min.) in einem Wasserbad (bei 37 ° C) eine leichte Unruhe Anwendung Auftauen und dann equilibrate zu RT vor Gebrauch.
   2. Mischen Sie frisch oder aufgetaut Blutproben invertieren die Röhren mehrmals.
2. Starten Sie die Reinigungsprozedur durch Ausführen des Lieferers Protokolle für 100 µL der Elution Volumen.
3. Quantifizieren und berechnen Sie die Reinheit der DNA, die Messung der Extinktion bei 260, 280 und 320 nm.
   1. Verwenden Sie steriles Wasser, um die Proben zu verdünnen und Spektralphotometer zu kalibrieren.
   2. Wenden Sie die folgende Formel zur Berechnung der Konzentration der DNA-Probe = 50 µg/mL x (eine₂₆₀ − A₃₂₀) x Verdünnungsfaktor und die Reinheit der DNA (ein₂₆₀ − A₃₂₀) = / (ein₂₈₀ − A₃₂₀), mit einem akzeptablen Verhältnis zwischen 1,7 und 1,9.

(3) PCR-Amplifikation von DNA-Proben

1. Bereiten Sie 25 µL des Reaktionsgemisches in einem 0,2 mL Mikro-Verstärkung Rohr, wie in Tabelle 1dargestellt.
2. Führen Sie eine PCR-Amplifikation der die gereinigten DNA-Proben mit einer automatisierten Thermocycler, nach dem Verstärkung-Programm in Tabelle 2dargestellt.
3. Am Ende der PCR-Amplifikation die PCR-Reaktionen zu stoppen, indem man die DNA-Proben bei 4 ° c

4. RFLP der PCR-Produkte

1. Bereiten Sie 22,5 µL Master-Mix-Lösung für jede Probe, so dass die ausgewählten Restriktionsenzym die PCR-Produkte, verdaut wie in Tabelle 3dargestellt.
2. Übertragen Sie 2.5 µL des PCR-Produktes auf eine neue PCR-Röhre für jede Probe mit Hilfe einer Pipette und Filtertips.
3. Die Rohre mit dem PCR-Produkt von jeder Probe mit Hilfe einer Pipette und Filtertips fügen Sie 22,5 µL Aufschlusslösung Master-Mix hinzu.
4. Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch (Master-Mix Lösung und PCR-Produkt) bei 37 ° C für 4 h.

(5) Gel-Elektrophorese Analyse von PCR-RFLP Proben

1. Fleck das Agarosegel indem Sie das Gel für 10 min. EtBr Interkalation Bromid (EtBr) bei 0,5 µg/mL hinzufügen bindet an die DNA, die unter ultraviolettem (UV) Licht visualisiert werden können.
   Achtung: Es ist wichtig, während der Handhabung, Lagerung und Entsorgung von EtBr, Handschuhe und andere Schutzeinrichtungen zu verwenden, weil es ein Mutagen mit potenziellen Karzinogenität ist.
2. Gießen Sie die vorbereiteten Agarosegel in ein Gel-Tablett mit den gut Kamm in Ort und warten Sie bis es erstarrt ist.
3. Legen Sie die erstarrten Agarosegel in Gel Box (Elektrophorese Einheit).
4. Füllen Sie die Gel-Box mit 1 X TBE bis das Gel bedeckt ist.
5. Laden Sie mit einer Pipette und Filtertips 6 µL des verstärkten Digest DNA (insbesondere Last 5 µL jeder Probe und 1 µL Farbstoff beladen-Gel) in die Vertiefungen der Agarose-Gel. Fügen Sie einen DNA Größe Marker in einem separaten, gut und parallel zu den Proben.
6. Führen Sie das Gel für 20-30 min bei 100 V.
7. Mit einem UV-Transilluminator die gespalten DNA-Fragmente zu visualisieren oder unverdaute PCR-Produkte, verglichen mit der DNA Fragmente Größe Marker und die Ergebnisse von der Fotografie, die Anweisungen des Herstellers registrieren.
   Achtung: Verwenden Sie Schutzeinrichtungen (Schutzbrille oder eine Gesichtsmaske) um UV-Lichtquellen.

Ergebnisse

Das Ziel dieser Methode ist, Thromboxane A2-Rezeptor Genotyp in Bezug auf den C924T-Polymorphismus zu bewerten. Das menschliche TBXA2R gen befindet sich auf 19p13.3, erstreckt sich über 15 Kbp und besteht aus drei Exons, getrennt durch zwei Introns. Die C924T-Polymorphismen des TBXA2R-Gens (von 539 bp) wurde unter Verwendung der PCR Zündkapseln in Abbildung 1dargestellte die ausgereifte, eine bestimmte DNA-Region, aber keine ortholog oder paralogous unspezifische Region zu verstärken wurden verstärkt. Darüber hinaus eine RFLP-Analyse mit einem RsaI Restriktionsenzym (Abbildung 1) auf die PCR-Produkte wurde durchgeführt und die Ergebnisse wurden auf einem Agarosegel, um die spezifischen studierte SNP charakterisieren visualisiert.

Basierend auf das Vorhandensein von anderen Fragment Längen nach Verdauung der DNA, ist es möglich, ein Patient Genotyp für den C924T-Polymorphismus zu unterscheiden. In der Tat zeigt, wie auf Abbildung 2dargestellt, die Reinerbigkeit des großen Allels (CC) zwei Bands (395 und 144 bp), da das Restriktionsenzym genau den TBXA2R gen Teil am C924T Polymorphismus Standort schneidet. Die Reinerbigkeit des kleinen Allels (TT) wird durch ein einzelnes Band gezeigt (539 bp), da das Restriktionsenzym schneiden nicht auftritt. Die heterozygote (CT)-Allel zeigt drei Bänder (539, 395 und 144 bp). Wie in Abbildung 2dargestellt, die C924T-Polymorphismus, definiert durch RsaI Verdauung auf PCR-Produkt, Sequenzanalyse bestätigt.

Komponente	Volumen (µL)	Endkonzentration
10 x PCR Puffer Tween-20 (15 M MgCl2)	0,25	1.5 MgCl2 Mmol/L
dNTP-Mix (10 mM)	1	200 ΜM
Grundierung (nach vorne) (10 Pmol/µM)	1	0,4 ΜM/ΜL
Grundierung (reverse) (10 Pmol/µM)	1	0,4 ΜM/ΜL
Taq Polymerase (5 U/µL)	0,2	1 U/ΜL
Probieren Sie DNA (42 ng/µL)	1	42 ng/µL
DNase-Wasser	20,55
gesamt	25

Tabelle 1: PCR Verstärkung Setup. Ein 25 µL Master-Mix Reaktionsgemisch eingerichtet in einem 0,2 mL PCR-Röhrchen, eine einzelne DNA-Probe zu verstärken.

Standard-PCR
Aktivierende Startschritt	5 min		95 ° C
3-Stufen-Radfahren
Denaturierung	30 s		94 ° C
Glühen	60 s		55 ° C
Erweiterung	60 s		72 ° C
Anzahl der Zyklen		30 Zyklen
Letzte Erweiterung	8 min		72 ° C

Tabelle 2: PCR-Amplifikation Programm. Richten Sie eine automatisierte Thermocycler um eine PCR und die Schablone DNA zu verstärken. PCR-Reaktionen werden durch Kühlung bei 4 ° c gestoppt

Komponente	Volumen (µL) (n = 1)	Volumen (µL) (n = 10) *
10 x Enzym Puffer	2.5	27.5
Restriktionsenzym (5 U/µL)	0,5	5.5
DNase-Wasser	19.5	214,5
gesamt	22.5	247,5

Tabelle 3: Beschränkung Enzym Verdauung von PCR-Produkten. Eine Master-Mix-Lösung ist vorbereitet, so dass die ausgewählten Restriktionsenzym die PCR-Produkte verdaut. *: Um eine Master-Mix-Lösung für 10 Proben einzurichten, fügen Sie 10 % mehr, schließlich, aus denen 11 Proben.

Abbildung 1: PCR Primer und Restriktionsenzym RsaI. Die Forward- und reverse Primer entwickelt, zur Verstärkung des TBXA2R gen teils 539 bp mit den C924T-Polymorphismus. RsaI ist das Restriktionsenzym ausgewählt, um die AGB-Seiten zu erkennen. ˅: Schneiden Website RsaI Enzyms. C(/T): C924T Polymorphismus. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: elektrophoretische Muster und DNA-Sequenz-Analyse. (A) die C924T der RFLP Genotyp anerkannt ist-Muster nach der Verdauung mit dem spezifischen RsaI Enzym. (B) DNA-Sequenz Analyse: nach der Verdauung mit der RsaI Restriktionsenzym von RFLP erzielten Ergebnisse wurden bestätigt mit Sequenzanalyse zeigt den C924T Polymorphismus. Diese Zahl wurde von De Iuliis Et Al., Prostaglandine und andere Lipid Mediatoren⁶geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Diskussion

In der vorliegenden Studie haben wir eine Methode beschrieben, mit dem Patienten Genotypisierung um die posttranskriptionelle Rolleder C924T Polymorphismus (rs4523) befindet sich an der 3' Region des TBXA2R-Gens zu untersuchen können. Erstens setzt diese Methode auf DNA-Extraktion aus dem Vollblut. Insbesondere besteht dieser ersten Prozess der Reinigung der gesamten menschlichen DNA, genomische und mitochondriale aus Vollblut-Proben, frisch oder gefroren, mit EDTA (Zitrat oder Heparin) behandelt. Für kurzfristige Lagerung von Vollblut-Proben für bis zu 10 Tagen bei 2 bis 8 ° C lagern. Für die Lagerung speichern Sie über 10 Tage Proben bei-70 ° C. Die automatisierte Reinigung erfolgt in 4 Schritten: lysiert, binden, waschen und eluieren. Zweitens setzt die Methode auf PCR Verstärkung der TBXA2R gen Teil enthält die C924T-Mutation. Schließlich erfolgt die Identifizierung der Wildtyp und/oder mutierten Genotyp mit einem Restriktionsenzym Analyse (RFLP) auf Agarosegel.

Wichtige Schritte im Protokoll sind die folgenden: (i) In dem Fall, die ein Teil der Agarosegel bei gelagert RT verwendet, die erstarrten Agarose kann über dem kochenden Wasserbad (bei 60 ° C für ca. 15-20 min) wieder aufgelöst oder in der Mikrowelle (3-5 min) vor dem Gießen. Hinweis: lösen Sie die Kappe beim Agarose in einer Flasche wieder schmelzen. (Ii), darüber hinaus bei der Agarose, Nacherwärmung Verdunstung eine Erhöhung der Konzentration bewirkt. Aus diesem Grund wäre es nützlich, indem man eine kleine Menge Wasser zu kompensieren. (Iii) DNA-Fragmente von weniger als 1.000 bp waren unterscheiden sich durch Agarosegel und TBE-Puffer wird empfohlen, die beste mögliche Trennung zu erhalten. (iv) wir lieber ein Agarosegel, anstatt ein Polyacrylamid-Gel zu verwenden, da die Zubereitung des letzteren schwieriger ist, und es viel länger dauert einzurichten. (V) die Wahl der Laufzeit die Gelelektrophorese stützt sich auf die erwartete Größe der Amplifikationsprodukte. Basierend auf dieses Protokoll, ist es ausreichend, eine Elektrophorese für 20-30 min bei 100 V in 2 % Agarosegel durchführen, da die Größe der PCR-Fragmente reicht von 100 bis 500 BP (vi). es ist zwingend erforderlich, um 10 bis 50 erhalten ng eine gute Vorlage aus humanen Proben extrahierte DNA . Aus diesem Grund bevorzugen wir eine automatisierte DNA Reinigung eher als ein semi-automatisch oder manuell. (Vii) bereiten Sie die Master-Mix Reaktion für PCR-Amplifikation und die Master-Mix-Lösung für PCR-Produkte Verdauung, Hinzufügen von 10 % mehr (um Flüssigkeitsverlust beim Pipettieren berücksichtigen), das Volumen berechnet, multipliziert mit der Anzahl der Proben für die benötigte Menge für eine DNA-Probe.

Die häufigste Falle der Methode ist das Vorhandensein von zusätzlichen Amplifikationsprodukte aufgrund einer falschen Thermocycler-Programm, eine falsche Verstärkung-Master-Mix-Vorbereitung oder eine DNA-Vorlage-Kontamination. Darüber hinaus möglicherweise das Fehlen der PCR-Produkte aufgrund von inaktivierten Taq Polymerase oder eine falsche Thermocycler ausgeführt. Darüber hinaus kann das Vorhandensein von unerwarteten Fragmente durch PCR-Produktverschmutzung oder durch eine unvollständige Verdauung von inaktivierten Enzyms, zu wenig Restriktionsenzym Volumen oder eine zu kurze Inkubationszeit sein.

In den letzten Jahren haben die folgenden Methoden für die SNP-Analyse mit Hilfe der PCR-Technik verwendet worden: Hybridisierung von kurzen Allel-spezifische Oligonukleotide¹¹, Allel-spezifische PCR¹², Grundierung Erweiterung auf DNA-Microarrays¹³ , Oligonukleotid Ligatur assay¹⁴, direkte DNA-Sequenzierung zur Identifizierung von Position-spezifische Einzel-Nukleotid-Polymorphismen¹⁵, Taqman-Methode¹⁶, Extraktion Matrix Laser Desorption/Ionisierung Time-Of-Flight (MALDI-TOF) Massenspektrometrie¹⁷und Genchip¹⁸. Diese Methoden sind nicht ideal, denn sie nicht einfach sind zu verwenden und/oder teure Ausrüstung erfordern. Umgekehrt, die in dieser Studie beschriebene PCR-RFLP-Methode ist kostengünstig, einfach zu bedienen, bequem, hat einen hohen Wirkungsgrad und ermöglicht die schnelle Identifizierung von C924T Polymorphismus. Eine Beschränkung auf das vorliegende Verfahren ist, dass es nur für eine kleine Anzahl von SNPs und ein paar Proben in einer Arbeitssitzung verwendet werden kann.

Für zukünftige Anwendungen kann diese Methode für prädiktive Untersuchungen in Bezug auf Bildung von Plaque und Progression der Atherosklerose durch die Analyse der Patienten Genotypen für den TBXA2R C924T-Polymorphismus verwendet werden. Darüber hinaus könnte diese Methode Themen anfälliger für atherothrombotischer Prozesse identifizieren, insbesondere Risikopatienten mit Aspirin behandelt. Schließlich könnten diese Methode angewandt werden, um andere Polymorphismen in der personalisierten Medizin für bestimmte Medikamente (z. B. Antikoagulantien und Antikonvulsiva) Beteiligten zu studieren, um zu verstehen, die geeignete Dosierung und den einzelnen pharmakologischen und klinisches Ansprechen für jeden Patienten vor Beginn der Therapie und Nebenwirkungen zu vermeiden.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
QIAsymphony SP	QIAGEN	937055
Spectrophotometer	EPPENDORF	6131-02222
UV-transilluminator	UVP	732-110
PCR tubes	EPPENDORF	H0030121589
PCR thermal cycler	EPPENDORF	5331-03721
Pipettors and filter tips	EPPENDORF	H4910000018/42/69 AND 0030067037/10/02
Horizontal minigel electrophoresis apparatus	DIATECH PHORESIS 10	RI002-10
Dry block heater	TWIN INCUBATOR	DG210
QIAsymphony DNA Midi Kit	QIAGEN	931255
10x PCR buffer (usually supplied by the manufacturer with the Taq polymerase)	DIATECH AND TAKARA	T0100 AND R0001DM
Taq polymerase	TAKARA	R0001DM
dNTP mixture	DIATECH  pharmacogenetics	NM001	dNTP MIX 10x 100 microliters, 10 mM
PCR primers	DIATECH  pharmacogenetics	\\
Restriction enzyme RsaI	New England biolabs	R0167L
Restriction enzyme 10x buffer	New England biolabs	R0167L
Agarose	Sigma	A9539	DNA fragments are best separated in TBE buffer
Tris base	Sigma	T6066
Boric acid	Sigma	B7901
0.5 M EDTA, pH 8.0	Sigma	E7889
10% (wt/vol) ammonium persulfate	Sigma	E3678	prepared fresh each time
EtBr (0.5 μg/μL)	Sigma	E8751
Bromophenol blue	Sigma	B0126
Xylene cyanol FF	Sigma	X4126
Glycerol	Sigma	G5516
DNA size marker	DIATECH  pharmacogenetics	R1002-10	Plasmide pBluescript II SK (+) restrict MSPI
Sterile water (autoclaved)	DIATECH  pharmacogenetics	\\