Thromboxane A2 reseptör gen C924T polimorfizmi çalışmak için bir yöntem

Özet

Mevcut çalışma, biz C924T genotip analiz etmek için bir metodoloji tarif. Protokol üç aşamadan oluşmaktadır: DNA ekstraksiyon, amplifikasyon Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) ve özel jel kısıtlama parça uzunluk polimorfizmi (RFLP) analizi.

Özet

Thromboxane A2 reseptör (TBXA2R) gen Yedi transmembran bölgeleri ile G-protein birleştiğinde süper bir üyesidir. Atherogenesis ilerlemesi, iskemi ve miyokard infarktüsü ilgilenmektedir. Burada bir metodoloji 3' bölgesinin TBXA2 reseptör gen yer alan C924T çok biçimlilik (rs4523) çoğu rolünü araştırmak için hasta Genotipleme mevcut. Bu yöntem tam kan, Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyon C924T mutasyon ve vahşi türü ve/veya mutant genotip bir kısıtlama Özet analizi kullanılarak kimliği içeren TBXA2 gen bölümünün DNA çıkarma dayanır, özellikle bir kısıtlama parça uzunluk polimorfizmi (RFLP) üzerinde özel jel. Ayrıca, sonuçları TBXA2R gen sıralama tarafından teyit edildi. Bu yöntem yüksek verimlilik ve C924T polimorfizmi analizi PCR ve restriksiyon enzimi tarafından hızlı tanımlaması gibi çeşitli potansiyel yararları bulunmaktadır. Bu yaklaşım, hasta genotip TBXA2R C924T çok biçimlilik için analiz ederek plak oluşumu ve ateroskleroz ilerleme için akıllı bir çalışma sağlar. Bu yöntemin uygulama Aterotrombotik süreçler, yüksek riskli, aspirin tedavi grubunda belirli konularda daha yatkındır konular tanımlamak için potansiyele sahiptir.

Giriş

TBXA2R yaygın olarak dile getirdi ve hücre zarlarında veya hücre içi yapılar^1,2lokalize Yedi transmembran bölgeleriyle G-protein birleştiğinde süper bir üyesidir. TBXA2R sinyal yolu gelişmiş aterosklerotik işlemleri³' te yer almaktadır. Artan ifade TBXA2 reseptör atherogenesis ilerleme sırasında gösterdiği ve klinik ve deneysel çalışmalar ilgili rolünü iskemi ve miyokard infarktüsü⁴' te gösterdi. C924T, TBXA2R gen tek nükleotit polimorfizmi (SNP) sağlıklı gönüllü bir işlevsel polimorfizmi olarak tanındı ve klinik bozukluklar⁵' e bağlanmıştır. Ayrıca, bizim önceki çalışma⁶ TBXA2R gen C924T polimorfizmi transkript istikrardır ilgilenmektedir gösterdi; Özellikle, mutant (TT) türü transkript vahşi türü (CC) ile ilgili olarak artan bir istikrarsızlık vardır. Buna ek olarak, adenozin nükleotittir (ADP), epinefrin ve kollajen farklı konsantrasyonlarda gibi çeşitli uyaranlara daha az etkili mutant türünün (TT) trombosit toplama indüklenen. Bu bir düşük trombüsü oluşumu ve hemostaz ile tutarlıdır. Böylece, TBXA2R transkript istikrarsızlık ve trombosit toplama ilişkili azaltılması için TBXA2R TT genotip atherothrombosis ve yüksek riskli aspirin tedavi edilen hastaların^{6 onun komplikasyonlara karşı koruyucu bir rol ile ilişkili olabilir} .

Burada, C924T çok biçimlilik (rs4523) 3' bölgesinin TBXA2 reseptör gen yer alan çoğu rolünü araştırmak hasta Genotipleme için bir metodoloji açıklayın. Bu yöntem için aşağıdaki adımları kullanır: tam kan (1) DNA çıkarılması, (2) PCR güçlendirme C924T mutasyon ve vahşi türü ve/veya kısıtlama parçası uzunluğu kullanarak mutant genotip (3) tanımlaması içeren TBXA2R gen bölümünün çok biçimlilik (RFLP) özel jel üzerinde. RFLP varyasyonları homolog DNA dizileri⁷kullanan bir tekniktir. DNA polimorfizmleri, özellikle SNPs, algılamak ve bulmak ve genetik varyasyonları⁸biyolojik alaka ilişkilendirmek için kullanılan bu uygulama. İnsanlarda RFLP PCR kullanarak ilk kez analiz çok biçimlilik ABO kan⁹yaşındaydım. RFLP-PCR yöntemi kullanarak çok özel restriksiyon¹⁰DNA sindirim sonra parçaları farklı uzunlukta varlığı değerlendirerek homolog DNA dizileri içinde genetik mutasyon analiz sağlar.

İçindeki son yıl, aşağıdaki yöntemleri PCR tekniği kullanarak SNP analiz için kullanılmıştır: kısa alleli özgü oligonucleotides¹¹, alleli özgü PCR¹², astar uzantısı DNA microarrays¹³, hibridizasyon Oligonükleotid ligasyonu¹⁴, doğrudan DNA Sekanslama belirleyici konuma özgü tek nükleotid polimorfizmleri¹⁵, Taqman yöntemi¹⁶, ayıklama için Matrix-Assisted lazer desorpsiyon/iyonlaşma zaman--uçuş (tahlil MALDI-TOF) kütle spektrometresi¹⁷ve GeneChips¹⁸. Bu tekniklerin kullanımı kolay değildir ve pahalı donanımları gerektirebilir. Tersine, PCR-RFLP yöntemi ucuz, kullanımı kolay, kullanışlı, yüksek verim ve C924T çok biçimlilik hızlı kimliği sağlar. Buna ek olarak, biz sonuçları¹⁵Sanger yöntemi kullanarak TBXA2R gen sıralama tarafından doğruladı.

Bu yaklaşım, hasta genotip TBXA2R C924T çok biçimlilik için analiz ederek plak oluşumu ve ateroskleroz ilerleme akýllý bir çalışma sağlar. Bu yöntem Aterotrombotik işlemleri için daha duyarlı konular özellikle yüksek riskli, aspirin tedavi edilen hastalar arasında bu teşhis edebilir.

Protokol

Protokol Chieti Üniversitesi tıbbi araştırma Etik Komitesi kuralları izler.

1. reaktif Kur

1. Tris-EDTA (TE) arabellek (pH 8.0) hazırlayın. 200 EDTA 0,5 M µL ve Tris-Cl 1 m 1 mL bir ölçek ekleyip 100 mL steril su ile getirmek. TE arabellek son konsantrasyonu: 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA. (RT) oda sıcaklığında saklayın.
2. 10 hisse senedi çözüm Elektroforez arabellek (TBE) x 1 L hazırlayın. 108 g Tris tabanının, Borik asit 55 g ve 40 mL EDTA dağıtılması içine bir ölçek 0, 5 M (pH 8) ve 1 L hacmi ile steril su getirmek. Mağazada RT.
3. Boya yükleme jel hazırlayın. Bromophenol mavi, Ksilen cyanol FF, gliserol, EDTA (pH 8) 1 mM 60 ml 50 g 0, 25 g deiyonize veya distile su 0, 25 g dağıtılması ve 100 mL steril su ile bir ses getirmek. 4 ° c (bir kaç aydır) veya (yıl için)-20 ° C'de depolayın
4. % 2 özel jel 200 mL hazırlayın. Taze veya alternatif olarak, saklamak kullanım RT için birkaç hafta kadar katılaşmış.
   1. Özel bir 600 mL ölçek 1 x TBE arabellek 200 ml 4 g geçiyoruz. Özel tamamen askıya kadar yaklaşık 5 dakika için bir manyetik karıştırıcı kullanarak karıştırın.
   2. Kaynar su veya sıcak bir tabak (yaklaşık 10 özel tamamen eriyene kadar min için) % 2 özel çözüm ısı. Not Özel jel ile kabı alüminyum folyo ile kaplı olmalıdır. Alternatif olarak, ele geçen kabı bir mikrodalga yaklaşık 3-5 min için yüksek bir ısıda ısı.
   3. Manyetik karıştırıcı, özel tamamen çözülmüş kontrol kullanarak % 2 özel çözüm girdap.
      Not: Özel parçacıkların yarı saydam tahıl tam çözülme önce görünür. Birkaç dakika (yaklaşık 5-10 dk) reheat parçacıklar için gerekli olabilir.
   4. Eğer saklı bir kısmını özel jel kullanılır, kabı ısı, alüminyum folyo ile kaplı, özel kadar (yaklaşık 60 ° C'de) sıcak su banyosunda feshedilmiştir. Pasteur pipet ile "dökme önce herhangi bir iz" katılaşmış özel yüzey kaldırın.

2. DNA arıtma

1. Arıtma başlamadan önce aşağıdakileri gerçekleştirin:
   1. İnsan taze tam kan örnekleri, kullanmak veya tam hafif bir ajitasyon uygulama örnekleri (için hızlı bir şekilde yaklaşık 2-3 dk) bir su banyosu (37 ° C'de) dondurulmuş kan çözülme ve RT için kullanılmadan önce equilibrate.
   2. Taze veya çözdürülen kan örnekleri tüpler birkaç kez ters çevirme karıştırın.
2. Arıtma yordamı elüsyon biriminin 100 µL için tedarikçinin protokolleri takip ederek başlayın.
3. Ölçmek ve 320 260 ve 280 Absorbans ölçme DNA saflığı hesaplamak nm.
   1. Steril su örnekleri sulandırmak ve Spektrofotometre ayarlamak için kullanın.
   2. DNA örneği toplama hesaplamak için aşağıdaki formül uygulamak 50 µg/mL (bir₂₆₀ − A₃₂₀) x x seyreltme faktörü ve DNA'ın saflık = (bir₂₆₀ − A₃₂₀) = / (bir₂₈₀ − A₃₂₀), kabul edilebilir bir oran ile 1.7 ve 1,9 arasında.

3. PCR güçlendirme DNA örnekleri

1. Tablo 1' de gösterildiği gibi bir 0.2 mL mikro-amplifikasyon tüp tepki karışımı 25 µL hazırlayın.
2. Tablo 2' de gösterilen güçlendirme programı aşağıdaki otomatik bir termal cycler kullanarak saf DNA örnekleri amplifikasyon PCR yerine getirir.
3. DNA örnekleri 4 ° C'de terk ederek PCR reaksiyonları PCR güçlendirme sonunda durdur

4. PCR ürünlerinin RFLP

1. Master-mix çözüm 22.5 µL PCR ürünleri, Tablo 3' te gösterilen seçili restriksiyon enzimi digests her örnek için hazırlıkları.
2. 2.5 µL PCR ürününün bir pipet ve filtre ipuçları kullanarak her örnek için yeni bir PCR tüp aktarın.
3. Sindirim master-mix çözüm 22.5 µL PCR ürünü bir pipet ve filtre ipuçları kullanarak her örneğinin içeren tüpler ekleyin.
4. 4 h için 37 ° C'de tepki karışımı (master-mix çözüm ve PCR ürünü) kuluçkaya.

5. Jel Elektroforez analiz PCR-RFLP örnekleri

1. Leke için 10 dk. EtBr jel için 0,5 µg/mL arasında etidyum bromür (EtBr) ekleyerek özel jel ultraviyole (UV) ışık altında görüntülenir DNA bağlar.
   Dikkat: çünkü bir alkil potansiyel carcinogenicity ile bu eldiven ve diğer koruyucu cihazlar işleme, depolama ve EtBr, atılması sırasında kullanılması önemlidir.
2. Hazırlanan özel jel yerde iyi tarak ile jel tepsisine dökün ve katılaşmış kadar bekleyin.
3. Katılaşmış özel jel jel kutusu (Elektroforez birleştirme) yerleştirin.
4. Dolgu jel kutusu 1 ile jel kaplı kadar x TBE.
5. Bir pipet ve filtre ipuçları ile güçlendirilmiş Özet DNA (özellikle, yük 5 µL her örneğinin ve jel boya yükleme 1 µL) 6 µL özel jel kuyu yükleyin. Bir DNA boyutu marker ayrı bir iyi ve örnekleri ile paralel olarak ekleyin.
6. 20-30 dk için jel 100 V çalıştırın.
7. Bir UV transilluminator ile cleaved DNA parçalarının veya parçaları DNA boyutu marker ile karşılaştırarak sindirilmemiş PCR ürünleri görselleştirin ve sonuçları üreticinin yönergeleri izleyerek fotoğraf tarafından kayıt.
   Dikkat: UV ışık kaynakları koruyucu aygıtlar (koruyucu gözlük ya da yüz maskesi) kullanın.

Sonuçlar

Bu yöntem Thromboxane A2 reseptör genotip C924T polimorfizmi ile ilgili olarak değerlendirmek için hedeftir. İnsan TBXA2R gen 19p13.3 üzerinde yer alan, 15 kbp yayılan ve üç ekzonlar iki intron tarafından ayrılmış oluşur. TBXA2R gen C924T polimorfizmleri (539, bp) belirli bir DNA bölge ama değil bir orthologous veya paralogous spesifik olmayan bölge yükseltmek için iyi tasarlanmış şekil 1' de gösterilen PCR primerler kullanılarak güçlendirilmiş. Buna ek olarak, bir RsaI restriksiyon enzimi (şekil 1) PCR ürünleri kullanarak RFLP analizi gerçekleştirilmiş ve sonuçları üzerinde bir özel jel, belirli okudu SNP karakterize için görüntülenir.

Farklı parça uzunlukları varlığı sonra DNA'ın sindirim dayanarak, bir hastanın genotip C924T polimorfizmi için ayırt etmek mümkündür. Restriksiyon enzimi tam olarak TBXA2R gen bölümü C924T çok biçimlilik sitesinde keser. çünkü aslında, Şekil 2' de gösterildiği gibi büyük alleli (CC) homozygosity iki grup (bp) 395 ve 144, görüntüler. Küçük alleli (TT) homozygosity tek bir bant tarafından gösterilmiştir (539 bp), restriksiyon enzimi kesme oluşmaz çünkü. Heterozigoz (CT) alleli üç şerit gösterir (539, 395 ve 144 bp). Şekil 2' de gösterildiði gibi RsaI sindirim PCR ürünü, tarafından tanımlanan C924T çok biçimlilik dizi analizi tarafından doğrulanmıştır.

Bileşen	Birim (µL)	Son konsantrasyonu
PCR arabellek ara-20 (15 M MgCl2) x 10	0,25	1.5 MgCl2 mmol/L
dNTP mix (10 mM)	1	200 ΜM
Astar (İleri) (10 pmol/µM)	1	0.4 ΜM/ΜL
Astar (ters) (10 pmol/µM)	1	0.4 ΜM/ΜL
Taq polimeraz (5 U/µL)	0,2	1 U/ΜL
Örnek DNA (42 ng/µL)	1	42 ng/µL
Dnaz ücretsiz su	20.55
Toplam	25

Tablo 1: PCR güçlendirme Kur. Tek bir DNA örneği yükseltmek için 0.2 mL PCR tüpte kurmak 25 µL master-mix tepki karışımı.

Standart PCR
İlk aktive adım	5 dk		95 ° C
3-adım Bisiklete binme
Denatürasyon	30 s		94 ° C
Tavlama	60 s		55 ° C
Uzantısı	60 s		72 ° C
Döngü sayısı		30 döngüleri
Son uzantısı	8 dk.		72 ° C

Tablo 2: PCR güçlendirme programı. PCR gerçekleştirmek ve şablon DNA yükseltmek için otomatik bir termal cycler kadar ayarla. PCR reaksiyonları 4 ° C'de soğutma tarafından durdurulur

Bileşen	Birim (µL) (n = 1)	Birim (µL) (n = 10) *
enzim arabellek x 10	2.5	27,5
Restriksiyon enzimi (5 U/µL)	0,5	5.5
Dnaz ücretsiz su	19,5	214.5
Toplam	22,5	247.5

Tablo 3: PCR ürünlerinin restriksiyon enzimi sindirim. Böylece seçili restriksiyon enzimi PCR ürünleri digests master-mix çözüm hazırlanır. *: 10 örnekleri için bir master-mix çözüm ayarlamak için sonunda 11 örnekleri yapma % 10 daha fazla, ekleyebilirsiniz.

Şekil 1: PCR astar ve RsaI restriksiyon enzimi. 539 TBXA2R gen bölümünü yükseltecek için tasarlanmış ileriye ve geriye doğru astar bp C924T polimorfizmi içeren. RsaI GTAC siteleri tanımak için Seçili kısıtlama enzimdir. ˅: Kesme Makinası RsaI enzim. C(/T): C924T çok biçimlilik. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: elektroforetik kalıp ve DNA dizi analizi. (A) genotip RFLP tarafından tanınan C924T desen sindirim belirli RsaI enzim ile sonra. (B) DNA dizi analizi: sindirim RsaI restriksiyon enzimi ile sonra RFLP tarafından elde edilen sonuçları C924T polimorfizmi gösterilen dizi analizi kullanarak teyit edildi. Bu şekil De Iuliis ve ark., Prostaglandinler ve diğer Lipid arabulucu⁶değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Bu da çalışmanın, hasta Genotipleme C924T çok biçimlilik (rs4523) 3' bölgesinin TBXA2R gene yer alan çoğu rolünü araştırmak için izin verir bir metodoloji anlatmıştık. İlk olarak, bu yöntem tam kan çıkarma DNA kullanır. Özellikle, bu ilk işlem Toplam insan DNA'sı, genomik ve mitokondriyal, tam kan örneklerinden taze veya dondurulmuş, arıtma, EDTA (sitrat veya heparin) ile tedavi oluşur. Kısa süreli depolama için tam kan örnekleri, 2-8 ° C'de 10 güne kadar saklayın. Depolama için 10 gün içinde örnekleri-70 ° C'de depolayın. 4 adımda otomatik arıtma süreci kapsar: koşullar, bağlamak, yıkama ve elute. İkinci olarak, yöntem C924T mutasyon içeren TBXA2R gen bölümü PCR amplifikasyon dayanır. Son olarak, kimlik vahşi türü ve/veya mutant genotip restriksiyon enzimi analizi (RFLP) üzerinde özel jel ile gerçekleştirilir.

Protokolünde önemli adımlar şunlardır: (i) bir kısmını özel jel depolandığı durumda RT kullanılır, katılaşmış özel kaynar su banyosu (60 ° C'de yaklaşık 15-20 dk) üzerinde yeniden çözünmüş olabilir veya mikrodalga fırında dökme önce (3-5 dk). Not: özel bir şişe yeniden erime zaman kapağı gevşetin. (II), Ayrıca, özel, yeniden Isıtma buharlaşma onun konsantrasyon artış neden olur. Bu nedenle, bu küçük hacimli su ekleyerek telafi etmek yararlı olabilir. (iii) DNA parçalarının daha az 1000 bp özel jel tarafından ayrıştırılan ve TBE tampon en iyi olası ayrılık elde etmek için tavsiye edilir. (iv) Biz ikinci hazırlanması daha zordur ve bu tuzağa düşürmek için daha uzun sürer, çünkü bir polyacrylamide jel yerine bir özel jel kullanmayı tercih eder. (v) Jel Elektroforez çalışan zamanı seçimi amplifikasyon ürünleri beklenen boyutuna dayanır. Bu protokolüne dayanan, bir 20-30 dk 100 V % 2 özel Jel Elektroforez gerçekleştirmek için yeterli olup, 10-50 elde etmek için zorunlu çünkü PCR boyutunu 100-500 bp. (VI) arasında değişmektedir parçaları ng kaliteli şablonunun insan örnekleri çıkarılan DNA . Bu nedenle, yarı otomatik veya el ile bir yerine bir otomatik DNA arıtma kullanmayı tercih eder. (VII) master-mix reaksiyon PCR güçlendirme için ve PCR ürünleri sindirim, (pipetting sırasında sıvı kaybı için hesap için) % 10 daha fazla birime eklemek için ana-mix çözüm için gerekli ses örnekleri sayısı ile çarpılır hesaplanan hazırla bir DNA örneği için.

Yöntemin en sık tuzak bir yanlış termal cycler programı, bir yanlış amplifikasyon master-mix hazırlık ya da DNA şablon kontaminasyon nedeniyle ilave amplifikasyon ürünleri varlığıdır. Ayrıca, PCR ürünleri yokluğu Inaktif Taq polimeraz veya yanlış bir termal cycler çalıştırmak olabilir. Buna ek olarak, beklenmeyen parçaları varlığı PCR ürün kontaminasyon nedeniyle veya eksik bir sindirim için Inaktif bir enzim, restriksiyon enzimi birim çok küçük miktarda veya çok kısa kuluçka süresi olabilir.

PCR tekniği kullanarak SNP analiz için son yıl içinde aşağıdaki yöntemleri kullanılmaktadır: kısa alleli özgü oligonucleotides¹¹, alleli özgü PCR¹², DNA microarrays^{13 astar uzantısına hibridizasyon} , Oligonükleotid ligasyonu¹⁴tahlil, pozisyon özgü tek nükleotid polimorfizmleri¹⁵, Taqman yöntemi¹⁶, ayıklama Matrix-Assisted lazer desorpsiyon/iyonlaşma belirlenmesi için DNA sıralama doğrudan Saat uçuş (MALDI-TOF) kütle spektrometresi¹⁷ve GeneChips¹⁸. Onlar kullanmak ve/veya pahalı ekipman gerektiren basit değil, çünkü bu yöntemler ideal değildir. Tersine, bu çalışmada olan PCR-RFLP yöntemi ucuz, kullanımı kolay, uygun, yüksek verim ve C924T çok biçimlilik hızlı kimliği sağlar. Mevcut yöntemi için bir sınırlama bu sadece SNPs az sayıda ve bir çalışma oturumu birkaç örnekleri için kullanılabilir olduğunu.

Gelecekteki uygulamalarda, TBXA2R C924T çok biçimlilik için hasta genotip analiz ederek plak oluşumu ve ateroskleroz ilerleme ile ilgili tahmini çalışmaları için bu yöntem kullanılabilir. Ayrıca, bu yöntem konular Aterotrombotik süreçlerine daha fazla duyarlı teşhis edebilir, özellikle yüksek riskli hastalarda aspirin ile tedavi. Son olarak, bu yöntem uygun ilaç dozaj ve farmakolojik bireysel anlamak için belirli ilaçlar (örneğin, antikoagülanlar ve antikonvülzanlar) için kişiselleştirilmiş tıp katılan diğer polimorfizmleri çalışmaya uygulanan olabilir ve Klinik yanıt tedavisi başlamadan önce ve yan etkileri önlemek için her hasta için.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
QIAsymphony SP	QIAGEN	937055
Spectrophotometer	EPPENDORF	6131-02222
UV-transilluminator	UVP	732-110
PCR tubes	EPPENDORF	H0030121589
PCR thermal cycler	EPPENDORF	5331-03721
Pipettors and filter tips	EPPENDORF	H4910000018/42/69 AND 0030067037/10/02
Horizontal minigel electrophoresis apparatus	DIATECH PHORESIS 10	RI002-10
Dry block heater	TWIN INCUBATOR	DG210
QIAsymphony DNA Midi Kit	QIAGEN	931255
10x PCR buffer (usually supplied by the manufacturer with the Taq polymerase)	DIATECH AND TAKARA	T0100 AND R0001DM
Taq polymerase	TAKARA	R0001DM
dNTP mixture	DIATECH  pharmacogenetics	NM001	dNTP MIX 10x 100 microliters, 10 mM
PCR primers	DIATECH  pharmacogenetics	\\
Restriction enzyme RsaI	New England biolabs	R0167L
Restriction enzyme 10x buffer	New England biolabs	R0167L
Agarose	Sigma	A9539	DNA fragments are best separated in TBE buffer
Tris base	Sigma	T6066
Boric acid	Sigma	B7901
0.5 M EDTA, pH 8.0	Sigma	E7889
10% (wt/vol) ammonium persulfate	Sigma	E3678	prepared fresh each time
EtBr (0.5 μg/μL)	Sigma	E8751
Bromophenol blue	Sigma	B0126
Xylene cyanol FF	Sigma	X4126
Glycerol	Sigma	G5516
DNA size marker	DIATECH  pharmacogenetics	R1002-10	Plasmide pBluescript II SK (+) restrict MSPI
Sterile water (autoclaved)	DIATECH  pharmacogenetics	\\