Thromboxane A2 수용 체 유전자의 C924T 다형성을 공부 하는 방법

요약

현재에 연구, 우리 C924T 유전자 형을 분석 하는 방법을 설명 합니다. 프로토콜 구성 3 단계: DNA 추출, 연쇄 반응 (PCR), 및 agarose 젤에 제한 조각의 길이 다형성 (RFLP)의 분석에 의해 증폭.

초록

Thromboxane A2 수용 체 (TBXA2R) 유전자 7 막 횡단 영역 G-단백질 결합 superfamily의 구성원입니다. 그것은 atherogenesis 진행, 허 혈, 심근 경색에 관여. 여기 우리는 TBXA2 수용 체 유전자의 3' 지역에 위치한 C924T 다형성 (rs4523)의 post-transcriptional 역할을 조사 하기 위해 환자의 유전형의 방법론을 제시. 이 메서드는 전체 혈액에서 C924T 돌연변이 돌연변이 genotypes 제한 다이제스트 분석을 사용 하 여 야생 타입의 식별을 포함 하는 TBXA2 유전자 부분 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭 DNA 추출에 의존 구체적으로 제한 조각의 길이 다형성 (RFLP) agarose에 젤. 또한, 결과 TBXA2R 유전자 시퀀싱에 의해 확인 되었다. 이 메서드는 높은 효율과 PCR, 제한 효소 분석에 의해 C924T 다형성의 급속 한 식별 같은 몇 가지 잠재적인 이점을 갖추고 있습니다. 이 방법은 TBXA2R C924T 다형성에 대 한 환자 genotypes을 분석 하 여 플 라크 형성과 동맥 경화 진행에 대 한 예측 연구 수 있습니다. 이 방법의 응용 프로그램 atherothrombotic 프로세스, 위험, 아스피린 치료 그룹에서 특정 과목에서에 더 취약 과목을 식별 하는.

서문

TBXA2R 7 막 횡단 영역 널리 표현 되 고 세포 막 또는 세포내 구조^1,2에 지역화는 G-단백질 결합 superfamily의 구성원입니다. TBXA2R 신호 통로 고급 동맥 경 화성 프로세스³에 포함 된다. TBXA2 수용 체의 증가 식 atherogenesis 진행 동안 시연 및 임상 이었고 실험 연구 허 혈 및 심근 경색⁴의 관련 역할을 보여주었다. C924T, TBXA2R 유전자의 단일 염기 다형성 (SNP) 건강 한 지원자에서 기능성 다형성으로 인식 되었다 고 임상 장애⁵에 연결 되었습니다. 또한 우리의 이전 연구⁶ 시연 TBXA2R 유전자의 C924T 다형성은 사본 안정성;에 관여 특히, 야생 타입 (CC)에 관하여 돌연변이 (TT) 유형 증명서의 증가 불안정성이입니다. 또한, 아데노신 diphosphate (ADP), 피 네 프 린, 다양 한 농도에서 콜라겐 등 여러 자극 유발 돌연변이 유형 (TT)에 대 한 효과적인 더 적은 혈소판. 이것은 감소 된 혈전 형성과 hemostasis 일치 합니다. 따라서, TBXA2R 대 본의 불안정과 관련 된 혈소판 감소 수도 있습니다 연결 될 atherothrombosis와 그것의 합병증 위험이 높은 아스피린 치료 환자^{6 TBXA2R TT 유전자 형에 대 한 보호 역할} .

여기, 우리는 환자의 유전형 TBXA2 수용 체 유전자의 3' 지역에 위치한 C924T 다형성 (rs4523)의 post-transcriptional 역할을 조사 하는 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 다음 단계에 의존: 전 혈에서 (1) DNA 추출, C924T 돌연변이, 그리고 (3) 야생 타입의 돌연변이 genotypes 제한 조각 길이 사용 하 여 id를 포함 하는 TBXA2R 유전자 부분 (2) PCR 증폭 다형성 (RFLP) agarose 젤에. RFLP 동종 DNA 시퀀스⁷변화를 이용 하는 기술입니다. 이 응용 프로그램이 검출 DNA 동 질 다 상, 특히 Snp를 찾아서 유전자 변이⁸생물학 관련성 연결 사용 되었다. 처음으로 인간의 RFLP PCR를 사용 하 여 분석 다형성 ABO 혈액⁹이었다. RFLP PCR 메서드는 매우 구체적인 금지 endonucleases¹⁰를 사용 하 여 DNA 소화 후 다른 길이의 파편의 존재를 평가 하 여 동종 DNA 시퀀스에서 유전자 변이의 분석을 수 있습니다.

지난 몇 년 동안, 다음 방법론 이용 되었습니다 SNP 분석 PCR 기술을 사용 하 여: 짧은 대립 유전자 특정 oligonucleotides¹¹, 대립 유전자 특정 PCR¹², DNA microarrays¹³, 뇌관 연장의 교 잡 oligonucleotide 결 찰¹⁴, Matrix-Assisted 레이저 탈 착/이온화 시간의-비행 (식별 위치 특정 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상¹⁵, Taqman 방법¹⁶, 추출에 대 한 시퀀싱 직접 DNA 분석 결과 MALDI-TOF) 질량 분석¹⁷및 GeneChips¹⁸. 이러한 기술을 사용 하 여 간단 하지 않습니다 그리고 비싼 장비를 요구할 수 있습니다. 반대로, PCR RFLP 방법 저렴 한, 사용이 간단, 편리, 높은 효율, 있으며 C924T 다형성의 급속 한 식별 수 있습니다. 또한, 우리¹⁵생어 메서드 사용 하 여 TBXA2R 유전자 시퀀싱 하 여 결과를 확인 했다.

이 방법은 TBXA2R C924T 다형성에 대 한 환자 genotypes을 분석 하 여 플 라크 형성과 동맥 경화 진행에의 한 예측 연구 수 있습니다. 이 방법을 식별할 수 있는 atherothrombotic 프로세스에 더 취약 과목 특히 높은 위험, 아스피린 치료 환자 가운데 그.

프로토콜

프로토콜 티 대학교의 의학 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.

1. 시 약 설치

1. 트리 스-EDTA (테) 버퍼 (pH 8.0)를 준비 합니다. 200 µ L의 0.5 M EDTA, 트리 스-Cl 1 M의 1 mL 비 커에 추가 하 고 메 마른 물 100 mL를가지고. TE 버퍼 최종 농도: 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA. 실내 온도 (RT)에 저장 합니다.
2. 재고 솔루션 전기 이동 법 버퍼 (TBE) x 10의 1 리터를 준비 합니다. 분해 트리 스 기지의 108 g, 붕 소 산의 55 g, EDTA의 40 mL 비 커에 0.5 M (pH 8) 살 균 물 1 L의 볼륨을. 실시간에 저장소
3. 염료를 로드 하는 젤을 준비 합니다. Bromophenol 블루, 크 실 렌 cyanol FF, 글리세롤, 60 mL에 EDTA (pH 8)의 1mm의 50 g의 0.25 g 이온 또는 증류수, 0.25 g을 녹이 고 멸 균 물 100 mL의 볼륨을. 4 ° C에서 (몇 개월) 또는-20 ° C에서 (년)
4. 2 %agarose 젤 200ml를 준비 합니다. 사용 신선한 또는, 양자 택일로, 그것은 저장에 대 한 실시간에 몇 주까지 경화.
   1. 600 mL 비 커에 1 x TBE 버퍼의 200 ml에서 agarose의 4 g 용 해. agarose는 완전히 중단 될 때까지 약 5 분 동안 자기 믹서를 사용 하 여 저 어.
   2. (약 10 분 동안,는 agarose는 완전히 용 해 될 때까지) 핫 플레이트 또는 끓는 물에 2 %agarose 솔루션을 열. 참고 agarose 젤 비 커 알루미늄 호 일로 덮여 있어야 합니다. 또는, 약 3-5 분에 대 한 높은 온도에서 전자 레인지에 발견된 비 커를 열.
   3. 마그네틱 믹서는 agarose는 완전히 용 해 검사를 사용 하 여 2 %agarose 솔루션을 소용돌이 친다.
      참고: 입자 agarose의 완전 한 해체 이전 반투명 곡물으로 나타납니다. 그것은 몇 분 (약 5-10 분) 동안 데워 입자에 필요할 수 있습니다.
   4. 경우의 저장된 부분 agarose 젤 사용, 열 비 커, 알루미늄 호 일로 덮여는 agarose까지 (약 60 ° C)에서 뜨거운 물을 욕조에 녹아. "흔적" 응고 agarose의 표면에서 따르기 이전 파스퇴르 피 펫을 제거 합니다.

2. DNA 정화

1. 정화를 시작 하기 전에 다음을 수행:
   1. 인간의 신선한 전 혈 샘플을 사용 하 여 또는 전체 혈액 샘플 신속 하 게 (약 2-3 분) (37 ° C)에서 물 욕조에 온화한 동요 적용 냉동을 해 동 하 고 equilibrate RT를 사용 하기 전에.
   2. 혼합 신선한 또는 해 동 혈액 샘플 튜브를 여러 번 반전.
2. 차입 볼륨의 100 µ L에 대 한 공급 업체의 프로토콜에 따라 정화 절차를 시작 합니다.
3. 계량 및 260, 280, 320에서 흡 광도 측정 하는 DNA의 순도 계산 nm.
   1. 샘플을 희석 하기 위해 살 균 물을 사용 하는 분 광 광도 계를 보정 합니다.
   2. DNA 샘플의 농도 계산 하려면 다음 수식을 적용 = 50 µ g/mL (는₂₆₀ − A₃₂₀) x 희석 비율과 DNA의 순수성을 x = (는₂₆₀ − A₃₂₀) / (는₂₈₀ − A₃₂₀), 허용 비율 1.7 1.9 사이.

3. PCR 증폭 DNA 샘플의

1. 표 1에서 보는 바와 같이 0.2 mL 마이크로 증폭 튜브에 반응 혼합물의 25 µ L를 준비 합니다.
2. 자동화 된 열 cycler, 표 2에 표시 된 확대 프로그램을 사용 하 여 순화 된 DNA 샘플의 PCR 증폭을 실시 합니다.
3. PCR 확대의 끝에, 4 ° c.에 DNA 샘플을 떠나는 하 여 PCR 반응 중지

4입니다. PCR 제품의 RFLP

1. 그렇게 선택한 금지 효소 다이제스트 PCR 제품, 표 3에서 같이 각 샘플에 대 한 마스터-믹스 솔루션의 22.5 µ L를 준비 합니다.
2. 피 펫 필터 팁을 사용 하 여 각 샘플에 대 한 새로운 PCR 튜브에 PCR 제품의 2.5 µ L를 전송.
3. 포함 하는 피 펫 필터 팁을 사용 하 여 각 샘플의 PCR 제품 튜브를 소화 마스터-믹스 솔루션의 22.5 µ L를 추가 합니다.
4. 4 h 37 ° C에서 반응 혼합물 (마스터 믹스 솔루션 및 PCR 제품)를 품 어.

5. 젤 전기 이동 법 분석의 PCR RFLP 샘플

1. 얼룩은 0.5 µ g/mL에서 10 분 EtBr에 젤 ethidium 평범한 사람 (EtBr)를 추가 하 여 agarose 젤 자외선 (UV) 빛 아래 구상 될 수 있다 DNA에 바인딩합니다.
   주의: 그건 처리, 저장 및 처리, EtBr의 중 장갑 및 기타 보호 장치를 사용 하는 것이 중요 때문에 잠재적인 발암으로 등재.
2. 부 어 장소에 잘 빗 젤 트레이에 준비 agarose 젤 하 고 응고가 될 때까지 기다립니다.
3. 응고 agarose 젤을 젤 상자 (전기 장치)에 놓습니다.
4. 1 젤 상자 채우기 x TBE 젤 커버까지.
5. 피 펫 및 필터 팁, agarose 젤의 우물으로 증폭 된 다이제스트 DNA (특히, 각 샘플의 부하 5 µ L 및 염료를 로드 하는 젤의 1 µ L)의 6 µ L을 로드 합니다. 잘와 예제와 함께 동시에 별도 DNA 크기 마커를 추가 합니다.
6. 100 V에서 20-30 분 젤을 실행 합니다.
7. UV transilluminator 쪼개진된 DNA 파편 또는 파편 DNA 크기 마커에 비교 소화 되지 않은 PCR 제품 시각화와 제조업체의 지침에 따라 사진에 의해 결과 등록.
   주의: UV 광원 주위 보호 장치 (안전 안경 또는 얼굴 마스크)를 사용 합니다.

결과

이 방법의 목표 C924T 다형성에 관해서는 Thromboxane A2 수용 체 유전자 형을 평가 하는 것입니다. 인간 TBXA2R 유전자는 19p13.3에, 15 kbp에 걸쳐 있으며 두 introns를 구분 하는 3 개의 exons의 구성 됩니다. TBXA2R 유전자의 C924T 동 질 다 상 (539의 bp) 그림 1에 표시 된 잘 설계 된 특정 DNA 영역 하지만 아니라 orthologous 또는 paralogous 일반적인 지역 증폭 된 PCR 뇌관을 사용 하 여 증폭 되었다. 또한, RFLP 분석 PCR 제품에는 RsaI 제한 효소 (그림 1)를 사용 하 여 수행 하 고 결과 특정 공부 SNP 성격을 나타내기 위하여는 agarose 젤에 시각화 했다.

DNA의 소화 후 다른 조각 길이의 존재에 따라, C924T 다형성에 대 한 환자의 유전자 형 판별 가능 하다. 사실, 그림 2에 표시 된 주요 대립 유전자 (CC)의 homozygosity 제한 효소는 정확 하 게 C924T 다형성 사이트에서 TBXA2R 유전자 부분을 잘라냅니다 때문에 두 개의 밴드 (395 및 144 혈압) 표시 됩니다. 사소한 대립 유전자 (TT)의 homozygosity 단일 밴드에 의해 설명 된다 (539 bp), 제한 효소 절단 발생 하지 않습니다 때문에. Heterozygous (CT) 대립 유전자 표시 3 밴드 (539, 395, 및 144 bp). 그림 2에서처럼 RsaI 소화 PCR 제품에 의해 정의 된 C924T 다형성 시퀀스 분석에 의해 확인 됐다.

구성 요소	볼륨 (µ L)	최종 농도
PCR 버퍼 트윈-20 (15 M MgCl2) x 10	0.25	1.5 MgCl2 mmol/L
dNTP 믹스 (10mm)	1	200 Μ M
뇌관 (앞으로) (10 pmol / µ M)	1	0.4 Μ M/Μ L
뇌관 (역) (10 pmol / µ M)	1	0.4 Μ M/Μ L
Taq 중 합 효소 (5 U / µ L)	0.2	1 U/Μ L
DNA 샘플 (42 ng / µ L)	1	42 기 / µ l
DNase 무료 물	20.55
총	25

표 1: PCR 증폭 설치. 25 µ L 마스터 혼합 반응 혼합물 증폭 한 DNA 샘플을 0.2 mL PCR 튜브에 설정.

표준 PCR
초기 활성화 단계	5 분		95 ° C
3 단계 자전거
변성	30 s		94 ° C
어 닐 링	60 s		55 ° C
확장	60 s		72 ° C
사이클 수		30 사이클
마지막 확장	8 분		72 ° C

표 2: PCR 증폭 프로그램. PCR을 수행 하 고 템플릿 DNA 증폭 자동된 열 cycler를 설정 합니다. PCR 반응 4 ° c.에서 놀 아 요 여 중지

구성 요소	볼륨 (µ L) (n = 1)	볼륨 (µ L) (n = 10) *
효소 버퍼 x 10	2.5	27.5
제한 효소 (5 U / µ L)	0.5	5.5
DNase 무료 물	19.5	214.5
총	22.5	247.5

표 3: PCR 제품의 금지 효소 소화. 믹스 마스터 솔루션을 선택한 금지 효소 다이제스트 PCR 제품 준비가 되어 있습니다. *: 10 샘플에 대 한 마스터-믹스 솔루션을 설정 하려면, 추가 10% 이상, 마침내 11 샘플을 만들고.

그림 1: PCR 뇌관 및 RsaI 금지 효소. 정방향 및 역방향 뇌관 539의 TBXA2R 유전자 부분을 증폭을 위한 bp C924T 다형성을 포함. RsaI는 제한 효소 인식 GTAC 사이트를 선정. ˅: RsaI 효소의 절단 사이트. C(/T): C924T 동 질 다 상 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 전기 이동 패턴 및 DNA 순서 분석. 특정 RsaI 효소 소화 후 (A) 유전자는 RFLP에 의해 인식 된다 C924T 패턴입니다. (B) DNA 순서 분석: 결과 RFLP RsaI 제한 효소로 소화 후 C924T 다형성을 보여주는 시퀀스 분석을 사용 하 여 확인 되었다. 이 그림은 De Iuliis 그 외 여러분, Prostaglandins 및 다른 지질 중재자⁶에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

현재 연구에서 우리는 TBXA2R 유전자의 3' 지역에 위치한 C924T 다형성 (rs4523)의 post-transcriptional 역할을 조사 하기 위해서는 환자의 유전형을 허용 하는 방법을 설명 했습니다. 첫째,이 메서드는 전체 혈액 으로부터 DNA 추출에 의존합니다. 특히,이 첫 번째 과정 이루어져 총 인간 DNA, 게놈 및 미토 콘 드리 아, 신선 또는 냉동, 전체 혈액 샘플에서의 정화 EDTA (구 연산 염 또는 헤 파 린)으로 치료. 전체 혈액 샘플의 단기 저장, 최대 10 일 동안 2-8 ° C에 저장 합니다. 스토리지에 대 한 일 이상,-70 ° c.에 샘플 저장 자동된 정화 과정 4 단계 구성: lyse, 바인딩, 세척, 그리고 elute. 둘째, 방법은 C924T 돌연변이 포함 하는 TBXA2R 유전자 부분의 PCR 증폭에 의존 합니다. 마지막으로, 야생 타입 agarose 젤에 제한 효소 분석 (RFLP)을 사용 하 여 돌연변이 유전자의 식별 수행 됩니다.

중요 한 단계는 프로토콜에는 다음: (i) agarose 젤의 일부에 저장 하는 경우에 RT 사용, 응고 agarose (약 15-20 분 동안 60 ° C)에 끓는 물을 욕조에 다시 녹아 수 또는 렌지 (3-5 분) 따르기 이전에. 참고: 때 다시 agarose 병에 뚜껑을 풉니다. (ii), 또한 때 다시 agarose, 난방 증발 하면 그 농도의 증가. 이러한 이유로, 물 한 작은 볼륨을 추가 하 여 보상에 유용할 수 있었다. (iii) DNA 파편의 미만 1000 bp는 agarose 젤에 의해 분화 되었다와 TBE 버퍼 최상의 가능한 분리를 얻을 것이 좋습니다. (4) 우리 때문에 후자의 준비 더 어렵습니다, 그리고 그것은 설정 하는 데 시간이 더 오래 걸립니다 polyacrylamide 젤 보다는 agarose 젤을 사용 하 여 선호 합니다. (젤 전기 이동 법의 실행 시간 v)는 선택 증폭 제품의 예상된 크기에 의존합니다. 이 프로토콜에 따라, 그것은 20-30 분 2 %agarose 젤에 100 V에서 전기 이동 법을 수행 하기에 충분 한, PCR의 크기 조각 범위 100-500 bp. (vi)에서 10 ~ 50를 필수이 좋은 품질 템플릿 인간의 샘플에서 추출 된 DNA의 ng . 이러한 이유로, 우리는 반자동 또는 수동 한 실행 하는 것이 아니라 자동된 DNA 정화를 사용 하 여 선호 합니다. (vii) PCR 증폭에 대 한 마스터-혼합 반응 및 PCR 제품 소화, 볼륨 (pipetting 동안 액체의 손실에 대 한 계정)에 10% 더 추가 대 한 마스터-믹스 솔루션 필요 볼륨에 대 한 샘플의 수를 곱한 계산 준비 하나의 DNA 샘플에 대 한.

방법의 가장 빈번한 문제는 잘못 된 열 cycler 프로그램, 잘못 된 증폭 마스터-믹스 준비, 또는 DNA 템플릿 오염 추가 증폭 제품의 존재 이다. 게다가, PCR 제품의 부재 비활성된 Taq 중 합 효소 또는 잘못 된 열 cycler 실행 될 수 있습니다. 또한, 예기치 않은 파편의 존재에서 불활성된 효소, 너무 적은 양의 제한 효소 볼륨, 또는 너무 짧은 보육 시간 PCR 제품 오염 또는 불완전 한 소화에 있을 수 있습니다.

지난 몇 년 동안, 다음 방법론 PCR 기법을 사용 하 여 SNP 분석에 대 한 이용 되었습니다: 짧은 대립 유전자 특정 oligonucleotides¹¹, 대립 유전자 특정 PCR¹², DNA microarrays^{13에 뇌관 연장의 교 잡} , oligonucleotide 결 찰¹⁴시험, 직접 위치 특정 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상¹⁵, Taqman 방법¹⁶, 추출 Matrix-Assisted 레이저 탈 착/이온화 식별을 위한 DNA 시퀀싱 시간의 비행 (TOF MALDI) 질량 분석¹⁷, 그리고 GeneChips¹⁸. 간단한 사용 및/또는 비싼 장비를 요구 하지 않기 때문에 이러한 방법은 적합 되지 않습니다. 반대로,이 연구에서 설명 하는 PCR RFLP 방법을 저렴 한, 사용이 간단, 편리, 높은 효율, 있으며 C924T 다형성의 급속 한 식별 수 있습니다. 현재 메서드는 제한은 것만 사용할 수 소수 Snp 및 작업 세션에 몇 가지 샘플입니다.

미래의 응용 프로그램에 대 한 TBXA2R C924T 다형성에 대 한 환자 genotypes을 분석 하 여 플 라크 형성과 동맥 경화 진행에 관한 예측 연구를 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다. 또한,이 메서드는 atherothrombotic 프로세스에 더 취약 과목을 식별할 수 있는, 특히 위험이 높은 환자 아스피린으로 치료. 마지막으로,이 방법은 적절 한 약물 복용량과 개별 약리를 이해 하기 위해 다른 동 질 다 상 특정 약물 (예, 응고 및 경련)에 대 한 맞춤된 의학에 관련 된 연구에 적용할 수 및 치료를 시작 하기 전에 하 고 부작용을 피하기 위해 각 환자에 대 한 임상 응답.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
QIAsymphony SP	QIAGEN	937055
Spectrophotometer	EPPENDORF	6131-02222
UV-transilluminator	UVP	732-110
PCR tubes	EPPENDORF	H0030121589
PCR thermal cycler	EPPENDORF	5331-03721
Pipettors and filter tips	EPPENDORF	H4910000018/42/69 AND 0030067037/10/02
Horizontal minigel electrophoresis apparatus	DIATECH PHORESIS 10	RI002-10
Dry block heater	TWIN INCUBATOR	DG210
QIAsymphony DNA Midi Kit	QIAGEN	931255
10x PCR buffer (usually supplied by the manufacturer with the Taq polymerase)	DIATECH AND TAKARA	T0100 AND R0001DM
Taq polymerase	TAKARA	R0001DM
dNTP mixture	DIATECH  pharmacogenetics	NM001	dNTP MIX 10x 100 microliters, 10 mM
PCR primers	DIATECH  pharmacogenetics	\\
Restriction enzyme RsaI	New England biolabs	R0167L
Restriction enzyme 10x buffer	New England biolabs	R0167L
Agarose	Sigma	A9539	DNA fragments are best separated in TBE buffer
Tris base	Sigma	T6066
Boric acid	Sigma	B7901
0.5 M EDTA, pH 8.0	Sigma	E7889
10% (wt/vol) ammonium persulfate	Sigma	E3678	prepared fresh each time
EtBr (0.5 μg/μL)	Sigma	E8751
Bromophenol blue	Sigma	B0126
Xylene cyanol FF	Sigma	X4126
Glycerol	Sigma	G5516
DNA size marker	DIATECH  pharmacogenetics	R1002-10	Plasmide pBluescript II SK (+) restrict MSPI
Sterile water (autoclaved)	DIATECH  pharmacogenetics	\\