מוליכות חשמלית לגרדום לווסת ולהעביר תאי גזע

Summary

פרוטוקול זה מתאר פבריקציה נוספת של מערכת התרבות התא כדי לאפשר זריעה של תאי גזע על גרדום פולימר מוליך ועבור במבחנה גירוי חשמלי העוקבים ויוו השרשה של לגרדום נזרע תאי הגזע באמצעות מרדית

Abstract

טיפול בתאי גזע התפתחה משיכת מרגש טיפולית, אך שיטת אספקה אופטימלים נשאר לא ברור. בעוד בטכניקה של microinjection שימש במשך עשרות שנים כדי לספק תאי גזע במודלים שבץ, טכניקה זו מוגבל על ידי חוסר היכולת לתפעל את תאי הגזע לפני ההזרקה. מאמר זה מפרט שיטה של שימוש בפיגומים פולימר מוליך חשמלי של תאי גזע למסירה. גירוי חשמלי של תאי גזע באמצעות לפיגום פולימר מוליך הפיצולים של התא גזע גנים המעורבים ב הישרדות cell, תגובה דלקתית ו שיפוץ סינפטית. לאחר preconditioning חשמליים, תאי גזע על הגרדום מושתלים intracranially במודל חולדה סגר דיסטלי עורק המוח התיכון. פרוטוקול זה מתאר טכניקה חזקה לתמרן תאי גזע דרך לפיגום פולימר מוליך ויוצר כלי חדש כדי להמשיך ולפתחו טיפול המבוסס על תאי גזע.

Introduction

שבץ מוחי הוא הסיבה המובילה השניה של מוות בעולם, הגורם המוביל החמישי המוות בארצות הברית. למרות אלה שיעורי התמותה גבוהים, טיפולים להחלמה שבץ נותרו כיום אתגר עם אפשרויות רפואי קיימא זמין כעת¹. כרגע יש כ 300 ניסויים קליניים העוסקים שבץ איסכמי, מהם 40 רק לנצל את תאי גזע. מחקרים קודמים הראו כי תאי הגזע טיפולים יש השפעה מיטיבה על קו-תיקון-^2,-³. גורמים Paracrine כמו neurotrophic המוח-derived factor (BDNF) ו- thrombospondin-1 (THBS-1) שוחררו המושתלים האנושי עצבית ובתאים (hNPCs) הראו התאוששות פונקציונליות משופרת באמצעות מנגנונים הקשורים עם עלייה סינפסה היווצרות, אנגיוגנזה, מסעף דנדריטים, תחזיות עצב חדשים, כמו גם הכוח ויסות מערכת החיסון^4,5,6. עם זאת, השיטות אספקה אופטימלים של תאי גזע נשארים חמקמקים.

משלוח מוצלח בתאי גזע המוח נשאר אתגר. כיום, הידרוג להזרקה ומערכות פיגומים פולימריים הוכנסו להעביר תאי גזע. שיטות משלוח אלה להגן על תאי גזע במהלך ההשתלה, כמו גם להציע הגנה מפני הקשים שלאחר שבץ כולל תגובה דלקתית של המחשב המארח, תנאים ובשפתיים-^7,-^8,-^{9 , 10}. עם זאת, החומרים הנפוצים הם ללא ניע, אשר מגביל את השימוש אפנון רציפה (קרי, גירוי חשמלי) של תאים¹¹. גירוי חשמלי הוא רמז המשפיע בידול, יון ערוץ צפיפות ו- neurite המוצלח תאי גזע¹². לעומת פולימרים אינרטי, פולימרים מוליכים יכול לשאת הנוכחי המאפשר גירוי חשמלי ומניפולציה של תאי גזע². עם זאת, המנגנון המדויק שבו גירוי חשמלי ממיקרו neurotrophic גורם לשחרור (קרי, BDNF ו- THBS-1) הוא חקר עדיין לא לגמרי.

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את השלבים כדי לבנות מערכת התרבות התא המורכב לפיגום פולימר מוליך, polypyrrole (PPy), המאפשר במבחנה גירוי חשמלי. בשל האופן שבו מערכת התרבות התא הוא מפוברק, אפשרי בהמשך השרשת לגרדום נזרע תאי גזע על גבי קליפת פרי-לאוטם. למערכת זו, אנחנו חשמלית כתנאי תאי גזע על הגרדום פרק זמן קצר לפני ההשתלה. בעקבות גירוי חשמלי, לגרדום פולימר מוליך נושא את התאים בהצלחה קטנטנים intracranially באמצעות שיטת פולשנית.

Protocol

כל תאי גזע והתהליכים בעלי חיים, אושרו על ידי ועדת הפיקוח מחקר תאי הגזע של סטנפורד על ידי פאנל ניהול באוניברסיטת סטנפורד על מעבדה חיה על עצמך (SCRO-616 ו APLAC-31909).

1. תחריט של זכוכית ITO

1. להכין את תחמוצת בדיל אינדיום (ITO)-שקופיות זכוכית מכוסה על ידי הנחת סוכן מיסוך בצד ואטימה של הזכוכית.
   הערה: מרבית הקלטות שקוף יכול לשמש כמסכה.
   1. להסיר את המסכה עודף באמצעות להב, להשאיר רק את הצורה הרצויה של העיצוב הסופי של איטו מכוסה על הזכוכית.
2. לשלב 5% (v/v) של חומצה חנקתית 45% (v/v) של HCl ב גביע זכוכית בתוך ברדס fume להכין את הפתרון תחריט.
   1. השתמש צלחת חמה, מד חום כדי להבטיח כי הטמפרטורה של תחריט הפתרון נשמר ב- 70 מעלות צלזיוס.
3. מרגע שהתמיסה איכול 70 מעלות צלזיוס, למקם את השקופית רעולי פנים-ITO זכוכית בתוך תמיסת למשך 2 דקות להסיר את שכבת איטו עודף.
   הערה: הקלטת מיסוך מגן השכבה איטו החשיפה תמיסה חומצית.
4. הסר את השקופית של הפתרון, לשטוף אותו עם יונים (DI) H₂O.
5. הסר בזהירות את ההתנגדות מסכת ולמדוד באמצעות multimeter על מנת להבטיח כי קריטון שנותרו ללא פגע. המפרט של חרוט באזור הרצוי צריך להיות כ 0 Ω.

2. הכנת פירול פתרון

1. בבקבוק זכוכית 1000 מ ל, להמיס 70 גר' נתרן dodecylbenzenesulfonate (NaDBS) ב- 600 מ"ל של DI H₂O.
2. ברגע NaDBS מחוסלת, להוסיף 14 מ"ל של פירול 0.2 מ' ו- mL 386 DI H₂O הפתרון.
3. לכסות את הפתרון עם רדיד אלומיניום ולאחסן ב 4 º C.

3. electroplating של Polypyrrole על זכוכית ITO

1. לחמם את הפתרון פירול לטמפרטורת החדר עד NaDBS הוא redissolved באופן מלא.
   הערה: זה לוקח בערך 15-20 דקות.
2. שופכים 25 מ של הפתרון פירול לתוך גביע.
3. להתחבר הזכוכית איטו חרוט multimeter ויציפו את השקופית לתוך הפתרון פירול.
   1. ודא כי הצד בהתנגדות Ω 0 פונה לכיוון האלקטרודה הפניה רשת פלטינה.
4. החל זרם חשמלי ליזום electroplating של PPy על פני השטח איטו באמצעות של multimeter (שוטף נשלטת על אמא/ס מ 3² למשך 4 שעות).
5. הסר את הזכוכית איטו multimeter ואת כביסה electroplated-PPy DI H₂O כדי להסיר שאריות חומרים פעילי שטח.
6. ניתוק בעדינות את הצלחת electroplated PPy מהזכוכית איטו באמצעות סכין גילוח.
   1. אחסן את הצלחת PPy בטמפרטורת החדר.

4. הכנת Polydimethylsiloxane (PDMS)

1. בעזרת מרית וקערית שוקלים, לערבב 18 גרם של סוכן הבסיס עם דור 2 של ריפוי סוכן, שופכים את התערובת לתוך תבניות זכוכית שני 10 ס"מ 8 ס"מ.
2. הסר את הבועות התבניות באמצעות תא ואקום במשך 15-20 דקות.
3. מניחים את התבניות בתנור 70 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
4. לאחר מקורר, להשתמש במרית שטוחה כדי להסיר את PDMS מן התבניות.

5. ייצור לשכת גירוי חשמלי במבחנה

1. אוטוקלב לוחות מתכת (WxL, 2.5 ס"מ x 12.5 ס"מ) ואת זרימת שסתומים ב 120 מעלות צלזיוס במשך שעה.
2. באמצעות שקופית קאמרית כתבנית, לחתוך שתי חתיכות של PDMS.
   הערה: חתיכה אחת של PDMS משמש להיקף של התא לתא עם מגזרות של שני ריבועים צמודים מ בתוך תא התא. החלק השני PDMS היא חלוקה של השטח של התא.
   1. לחתוך החוצה הבתוך תא קאמרית כך שהוא מרובע בצורת ומתאימה את הצורה של התא לתא. ודא כי הצורה הכללית של שני החלקים של PDMS הוא מלבני המתאים של השקופית קאמרית.
3. שכבה של החומרים כמו הבאות מלמטה למעלה: (1), לוחית מתכת (2) PDMS (ללא עמלות), (3) PPy צלחת (בניצב PDMS), (4) PDMS (עם מגזרות), ו- (5) תא קאמרית.
4. תהדק את המנגנון ביחד ברגע שיהיה מיושר לגמרי.
5. לחתוך שתי פיסות 60 ס מ של חוט מתכת ולהשתמש הדבק כסף לחבר חוט אחד בכל קצה של צלחת PPy המגיחה מתוך החלק החיצוני של החדר. ודא החוטים מספיק זמן כדי להאריך מן המנגנון אל מחוץ אינקובטור.
6. לאחר ההדבקה כסף הוא נרפא, לחזק, לאטום את החיבור חוט עם אפוקסי.
   1. להקליט את ההתנגדות משתמש multimeter כדי לוודא כי השדה יישומית הוא זהה בכל אחד.
   2. להשתלה, להסיר את החוטים; unclamp התאים תא, PDMS, ולאחר מכן אותם להפריד לגרדום מוליך. המימד של פיגומים מושתל הוא בערך 1 מ מ x 3 מ"מ x 0.25 מ"מ.

6. ציפוי האנושי עצבית ובתאים (hNPCs) ב- PPy

1. לעקר את התאים מורכבים תחת אור UV למשך שעתיים.
   1. לאחר שעה אחת, לסובב את שהורכב צ'יימברס 90°.
2. לאחר עיקור, מעיל השטח של PPy בחלק התחתון של החדר עם 800 µL של מצע ציפוי ולאפשר את המצע שבמהלכו בצלחת PPy בתוך אינקובטור ב 37 ° C-5% CO₂ לשעה.
3. לאחר שעה אחת, הסר את תגובת שיקוע של צ'יימברס, לשטוף בעדינות עם 1 מ"ל של DPBS + Ca + Mg לכל טוב.
   הערה: להימנע לשטוף את פני השטח של PPy בכוח כמו זה יגרום להתנתקות המצע ציפוי.
4. באמצעות מדיה תא טריים, מכנית מביצועם בתרבית תאים לשימוש עם התאים מצלחת תרביות רקמה עם pipetting עדין.
   הערה: תאים צריך להיות 90-100% confluent על דיסוציאציה.
5. לאסוף את כדורי hNPC באמצעות צנטריפוגה ב 8000 x g במשך 5 דקות.
6. שימוש של hemocytometer, לספור, resuspend את התאים בווליום של תאים/ס מ 100,000².
7. צלחת 100,000 התאים לתא בכל טוב (100,000 תאים/cm² ב 1 מ"ל של מדיה).
8. לחזור צ'יימברס חממה-37 מעלות צלזיוס ב-5% CO_2-

7. גירוי חשמלי של hNPCs

1. יום אחד לאחר זריעה התאים על התאים, השתמש מחולל גל כדי להחיל גירוי חשמלי לתאים.
2. לפני גירוי, להסיר מדיה זקן אחד טוב, לחדש עם 800 µL של התקשורת טריים.
3. לאחר שינוי בתקשורת, במקום התאים בחזרה לתוך החממה, להרחיב את החוטים מתוך החממה, לצרף אותם גנרטור גל
4. להחיל את הגירוי התאים עם אות גל מרובע ב mV ±400 עם 100 הרץ לשעה.
5. לאחר הגירוי, להסיר את החוטים, תקופת דגירה של התא להוצאה של עוד יום בתוך אינקובטור להגדיר ב 37 ° C עם 5% CO₂.
6. לבצע לאחר מכן ניתוח הביולוגי כולל הכדאיות התא, כמותיים בזמן אמת תגובת שרשרת פולימראזית (PCR לרביעיית) ע פ הפרוטוקול של היצרן.

8. in Vivo PPy השרשה

1. מבצע דיסטלי עורק המוח התיכון (dMCA) סגר קו הדגמים תא T לקויה למבוגרים זכר עירום חולדות (NIH-RNU 230 ± 30 g) כפי שתוארה קודם לכן². ביצוע ההשתלה שבוע אחד פוסט-dMCA סגר.
2. יום אחד לפני הניתוח, לתת אמפיצילין (1 מ"ג/מ"ל) לעכברושים במים הכלוב שלהם.
3. עזים ומתנגד העכברוש באמצעות לשכת אינדוקציה 0.5 - 3% מ"ג/ק"ג של איזופלוריין מנוהל באמצעות אינהלציה.
4. לאשר ההרדמה של העכברוש על ידי חוסר תגובת רפלקס של קמצוץ הבוהן.
   1. בעוד החיה תחת הרדמה, להמשיך לפקח שלה ממברנה צבע דפוס הנשימה, טמפרטורה רקטלית כל 15 דקות.
5. לאחר ההרדמה הוא אישר, החל דמעות מלאכותיות על עיני עכברוש למניעת יובש.
6. ודא כי הטכניקה aseptic תישמר במהלך הליך זה על-ידי שימוש בכפפות סטריליות, מאסו כירורגי סטרילי¹³. לשמור על כלי כירורגי סטרילי בתוך שדה סטרילי.
7. בעוד העכברוש הוא בהרדמה, תרגיל של craniectomy מעל קליפת המוח השמאלי. פתח את השכבה הקשה של המוח.
   1. הסר את הדורה המוח באמצעות מחט דק מיקרו כירורגי.
8. שתל פיגומים מוליך ממערכת במבחנה על גבי קליפת חולדה.
   הערה: לניסויים שלנו, אנחנו מושתלים פיגומים מיום במבחנה 3 לאחר ציפוי hNPC.
   1. למקם את השתל בעיקר על קליפת penumbral המדיאלי כדי הנגע שבץ.
9. לאחר לגרדום מושם, הצב surgicel מעל השתל כדי למנוע תנועה עם העור סגירה.
10. לתפור הפצע סגור, subcutaneously להחדיר את החולדות. הבופרנורפין SR במינון של 1 מ ג/ק ג כדי לנהל את הכאב קשור dMCA סגר ובבית stereotaxic.
11. מקום העכברוש בכלוב שחזור זה להכרתו.
    1. לעולם לא תעזוב את החיה ללא התערבות כשהוא מחוסר הכרה.
    2. אין למקם את החיה עם אחרים עד מלא זכה להכרה.
12. יפקח חיות מדי יום עבור סימנים של כאב כולל ירידה במשקל הגוף, צריכת מזון ירידה/מים, המעיל פרוע/לטפח מופחתת, ירד/מוגברת פעילות ספונטנית, יציבה נורמלית, התייבשות/עור להקים אוהל, עיניים שקועות, מסתור, השחתה עצמית נשימה מהירה נשימה בפה פתוח, מתעוות, רועדת, רעד, הניקוד.
    1. לנטר את החיות מדי יום עד שיופיע כי הם לאכול, לשתות, טיפוח, לעלות במשקל; ואז שבועי לאחר עלייה במשקל.
13. Euthanization מוקדמת דרך שאיפת₂ CO ואישור משני euthanization (על מנת להבטיח את החיה לא ישוב כתוצאה מהשאיפה של₂ CO פוסט של חמצן נורמלית האספקה) יחולו כל חיה שמופיע כדי לא לאכול, לשתות, לעלות במשקל לאחר ההליך הכירורגי הראשוני; מופיע כאב; או מופיעה אפשרות להשלים את הבדיקות התנהגותיות עקב גדול יותר מאשר צפוי גירעון של קורטקס מוטורי.

תוצאות

התרשים המוצג באיור 1 מייצג את זרימת העבודה הכוללת של גירוי חשמלי של hNPCs והיישומים פוטנציאלית במורד הזרם. מגבלה הנוכחי של טיפול בתאי גזע הוא כי תאי גזע נחשפים סביבת שלאחר השתלת קשים כולל דלקת ותנאים איסכמי. אלה התנאים הקשים סביר להגביל את היעילות הטיפולית

Discussion

גדל ראיות הוכיחה את ההבטחה של תאי גזע כטיפול קו הרומן. הבטחה זו הובילה מאמץ גדול כדי להתקדם תאי גזע הרפוי המיטה לפחות 40 הניסויים הקליניים מתמשכים או שהושלמו. קו פתולוגיה מציע הפרעה נוירולוגית ייחודי זה הוא משאיל את עצמו טיפול בתאי גזע כי לאחר העלבון חריפה, שום תהליך ניווניות מניעת שחזור. המ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FGF-Basic	Invitrogen	CTP0261	20 ng/mL for working media
Matrigel	Corning	cb40234a	1:200 dilution
LIF Protein, Recom. Hum. (10 µg/mL)	EMD Millipore	LIF1010	10 ng/mL for working media
Sylgard 184 silicone 3.9 kg	Fisherbrand	NC0162601
Hydrochloric acid	Fisherbrand	SA56-4
Nitric Acid Concentrate (Certified) ACS, Fisher Chemical	Fisherbrand	SA95
ITO Glass	Delta Technologies	CG-40IN-0115
Sodium dodecylbenzenesulfonate	Sigma	289957-1KG
Pyrrole	Sigma	131709-500ML	Protect pyrrole solution from light and room temperature
8 well glass slide chambers	Thermo Sci Nuc	125658	Detach the cell chamber and keep it under sterilized conditions
Flat-Surface Bracket, 3"x1"	McMaster-Carr	1030A4
TWO PART SILVER PAINT 14G	Electron Microscopy Sciences	1264214	Mix two parts (1:1) in plastic plate
DPBS, 1x, with Ca and Mg, No Phenol Red	Genesse	25-508C
AB2 ArunA Neural Cell Culture Media Kit	Aruna Biomedical	ABNS7013.2
hNP1 Human Neural Progenitor Expansion Kit	Aruna Biomedical	hNP7013.1
Noncontact Flow-Adjustment Valve, Nickel-Plated Brass, for 3/32" to 5/8" Tube OD	McMaster-Carr	5330K22
Multimeter	Keysight	E3641A
Wavefoam generator	Keysight	33210A-10MHz
Pt meshes	Sigma-Aldrich	298107-425MG	Reference electrode with dimensions, 1x1 cm
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells	Thermo Fisher Scientific	L3224
BDNF	Thermo Fisher Scientific	Hs02718934_s1
THBS1	Thermo Fisher Scientific	Hs00962908_m1
GAPDH	Thermo Fisher Scientific	Hs02758991_g1
RNeasy Mini Kit (250)	Qiagen	74106
QIAshredder (250)	Qiagen	79656
RNase-Free DNase Set (50)	QIAGEN	79254
iScript cDNA Synthesis Kit, 100 x 20 µL rxns	BIORAD	1708891
TaqMan Gene Expression Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4369510
7-8 Week Old, male, RNU Rats	NCI-Frederick
4-0 Ethicon Silk Suture	eSutures.com	683G
Isoflurane	Henry Schein	29405
V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System	VetEquip	901806
Surgicel Original Absorbable Hemostat	Ethicon	1952
Lab Standard Stereotaxic Instrument, Rat	Stoelting	51600
Kimberly-Clark Professional Safeskin Purple Nitrile Sterile Exam Gloves	Fisherbrand	19-063-130
Sterile Drape	Medline	DYNJSD1092
Thermo Scientific Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle, Holds No. 20-25 Blades	Fisherbrand	53-34
Walter Stern Scalpel Blade Series 300	Fisherbrand	17-654-456
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4484642
Frazier Micro Dissecting Hook	Harvard Apparatus	52-2706