변조 및 줄기 세포를 제공 하는 전기 전도성 비 계

요약

이 프로토콜 설명 줄기 세포 생체 외에서 전기 자극 및 줄기 세포 시드 비 계를 사용 하 여 후속 vivo에서 이식에 대 한 비 전도성 고분자 계에서의 시드 수 있도록 셀 문화 시스템의 제조를 최소 침 습 기법입니다.

초록

줄기 세포 치료 치료, 흥미 진 진한 선으로 등장은 하지만 최적의 전달 방법 불분명 남아. 뇌졸중 모델에서 줄기 세포를 전달 하기 위해 수십 년 동안 microinjection의 기술을 사용 하는 동안이 기술은 주입 전에 줄기 세포를 조작 하는 능력의 부족에 의해 제한 됩니다. 이 문서는 전기 전도성 폴리머 비를 사용 하 여 줄기 세포 배달에 대 한 하는 방법을 자세히 설명 합니다. 전도성 고분자 비 계를 사용 하 여 줄기 세포의 전기 자극 세포 생존, 염증 반응, 및 시 냅 스 리 모델링에 관련 된 줄기 세포의 유전자를 변경 합니다. 전기 거치기 후 발판에 줄기 세포는 원심 중간 대뇌 동맥 폐색 쥐 모델에서 intracranially 이식 수 있습니다. 이 프로토콜 전도성 고분자 비 계를 통해 줄기 세포를 조작 하는 강력한 기법을 설명 하 고 추가 줄기 세포 기반 치료를 개발 하는 새로운 도구를 만듭니다.

서문

스트로크는 세계에서 사망의 두 번째 주요 원인이 이며 미국에서 죽음의 다섯 번째 주요 원인. 이러한 높은 사망률에도 불구 하 고 뇌졸중 복구에 대 한 치료는 현재 가능한 의료 옵션 현재 사용할 수 있는¹와 도전 남아 있습니다. 현재 다루고 있는 유일한 40 줄기 세포를 활용 하는 허 혈 성 뇌졸중의 임상 시험 300 개에 대 한 있다. 이전 연구 결과 줄기 세포 치료 선 수리^2,3에 유익한 영향을 미칠 것으로 나타났습니다. 두뇌 파생 된 neurotrophic 요인 (BDNF) 등 thrombospondin-1 (THBS-1) 이식된 인간의 신경 조상 세포 (hNPCs)에서 발표 Paracrine 요인의 증가와 관련 된 메커니즘을 통해 향상 된 기능 복구를 나타났습니다. 시 냅 스 형성, angiogenesis, 수지상 분기 및 새로운 axonal 계획 뿐 아니라 면역 시스템^4,,56변조. 그러나, 줄기 세포의 최적의 전송 방법 애매 남아 있습니다.

뇌에 성공적인 줄기 세포 배달 도전 남아 있습니다. 현재, 주사 가능한 히드로 및 고분자 스 캐 폴딩 시스템 줄기 세포 제공 도입 되었습니다. 이러한 전달 방법 이식 시 줄기 세포를 보호 뿐만 아니라 호스트의 염증 반응과 hypoxic 조건^7,,89 를 포함 하 여 가혹한 포스트 치기 환경에서 보호를 제공 ^{, 그러나 10}., 가장 일반적으로 사용 되는 재료는 불활성,¹¹셀 연속 변조 (즉, 전기 자극)의 사용을 제한 하. 전기 자극 차별화, 이온 채널 밀도, 그리고 줄기 세포¹²neurite 결과 영향을 미치는 큐입니다. 불활성 고분자에 비해 전도성 고분자는 전기 자극 및 줄기 세포²의 조작에 대 한 현재 수 있도록 수행할 수 있습니다. 그러나,는 전기 자극 neurotrophic 요인 릴리스 (즉, BDNF와 THBS-1)를 변조 하는 정확한 메커니즘은 아직 완전히 탐험.

이 프로토콜에서 우리는 전도성 고분자 비 계, polypyrrole (PPy), 체 외에 전기 자극에 대 한 수 있도록 구성 된 셀 문화 시스템을 구성 하는 단계를 설명 합니다. 셀 문화 체계를 조작 하는 방식으로 인해 줄기 세포 시드 비 계 요정 경색 피 질에의 후속 주입이 가능 하다. 이 시스템에 대 한 우리 전기 전제 발판에 줄기 세포 이식 전에 짧은 시간 동안. 전기 자극에 따라 셀을 들고 전도성 고분자 발판 성공적으로 intracranially 최소 침 습 방법을 사용 하 여 이식 합니다.

프로토콜

모든 줄기 세포 및 동물 절차 및 실험실 동물 관리 (SCRO 616 및 APLAC 31909)에 스탠포드 대학의 행정 패널에 의해 스탠포드의 줄기 세포 연구 감독 위원회에 의해 승인 되었다.

1입니다. 이토 유리 에칭

1. 인듐 주석 산화물 (ITO) 준비-유리의 전도성 저쪽 마스킹 에이전트를 배치 하 여 커버 유리 슬라이드.
   참고: 대부분의 상용 투명 테이프는 마스킹 요원으로 사용할 수 있습니다.
   1. 블레이드를 사용 하 여 초과 마스크를 제거, 최종 이토 디자인만 원하는 모양 떠나는 유리에.
2. 질소 산의 5% (v/v) 및 에칭 솔루션을 준비 하는 증기 두건 안쪽 유리 비 커에 HCl의 45% (v/v) 결합 한다.
   1. 핫 플레이트와 온도계를 사용 하 여 솔루션을 에칭의 온도 70 ° c.에 유지 되도록
3. 에칭 솔루션에는 70 ° C에 도달 하면, 2 분 초과 이토 레이어를 제거를 위한 솔루션으로 마스크-이토 유리 슬라이드를 놓습니다.
   참고: 테이프 마스킹 산 성 솔루션에 노출에서 이토 레이어를 보호합니다.
4. 솔루션에서 슬라이드를 제거 하 고 이온된 (DI) H₂o.로 그것을 씻어합니다
5. 조심 스럽게 제거 나머지 이토 그대로 되도록 멀티 미터를 사용 하 여 마스크와 측정 저항. 원하는 에칭된 면의 해독 약 0 Ω 이어야 한다.

2입니다. Pyrrole 솔루션의 준비

1. 1000 mL 유리병에 디 H₂o.의 600 mL에 70 g 나트륨 dodecylbenzenesulfonate (NaDBS)의 해산
2. 일단는 NaDBS 해산 솔루션에 0.2 M pyrrole의와 디 H₂O의 386 mL 14 mL를 추가 합니다.
3. 커버 알루미늄 호 일로 솔루션 및 4 ° c.에 저장

3. 전기 Polypyrrole 이토 유리에의

1. 따뜻한 실내 온도에 pyrrole 솔루션 NaDBS redissolved 완전히 때까지.
   참고:이 약 15 ~ 20 분 정도 걸립니다.
2. Pyrrole 솔루션의 25 mL 비 커에 붓으십시오.
3. 멀티 미터를 에칭된 이토 유리를 연결 하 고 슬라이드 pyrrole 솔루션에 잠수함.
   1. 0 Ω 저항 측면 플래티넘 메쉬 참조 전극으로 직면 하 고 있는지 확인 합니다.
4. PPy의 멀티 미터 (전류 3 mA/cm² 에서 4 시간에 대 한)를 사용 하 여 ITO 표면에 전기 도금을 시작 하는 전류를 적용 합니다.
5. 멀티 미터 및 세척 전기-PPy 디 H₂O 잔여 계면 활성 제를 제거 하에서 ITO 유리를 제거 합니다.
6. 부드럽게 면도날을 사용 하 여 이토 유리에서 전기 PPy 플레이트를 분리 합니다.
   1. 실 온에서 PPy 접시를 저장.

4입니다.입니다 (PDMS)의 준비

1. 주걱과 무게 접시 사용 하, 경화제의 2 세대와 기본 에이전트의 18 g을 혼합 하 고 두 10 cm x 8 cm 유리 금형에 혼합물을 부 어.
2. 15-20 분 동안 진공 챔버를 사용 하 여 금형에서 거품을 제거 합니다.
3. 3 h 70 ° C 오븐에 금형을 놓습니다.
4. 일단 냉각, 금형에서는 PDMS를 제거 하려면 평평한 주걱을 사용 합니다.

5. 시험관에 전기 자극 챔버의 제조

1. 압력솥 (WxL, 2.5 c m x 12.5 c m) 금속 접시와 흐름 1 시간 동안 120 ° C에서 밸브.
2. 템플릿으로 챔버 슬라이드를 사용 하 여, PDMS의 두 조각을 잘라.
   참고: PDMS의 한 조각 셀 챔버 내에서 두 개의 인접 한 사각형의 배 기판 가진 셀 챔버의 경계 역할을 합니다. 다른 PDMS 조각 챔버의 경계에 대 한 개요입니다.
   1. 잘라 안쪽에 밖으로 셀을 정사각형 모양 실과 셀 챔버의 모양을 일치. PDMS의 두 조각의 전반적인 모양은 직사각형 이며 챔버 슬라이드의 일치를 확인 합니다.
3. 맨 아래에서 다음과 같은 자료를 레이어: (1) 금속 격판덮개, (2) (단편), 없이 PDMS (3) PPy 플레이트 (PDMS에 수직), (단편)와 (4) PDMS 및 (5) 셀 챔버.
4. 일단 완벽 하 게 정렬 기구를 함께 클램프.
5. 금속 와이어의 두 60 cm 조각 잘라내어 실버 붙여넣기를 사용 하 여 챔버의 외부에서 돌출 PPy 플레이트의 각 끝에 1 개의 철사를 연결. 전선은 충분히 인큐베이터의 외부에 장치에서 확장을 확인 합니다.
6. 일단은 풀 치료 강화와 에폭시와 와이어 연결 인감.
   1. 적용된 분야는 각 챔버에 동일 다는 것을 확인 하는 멀티 미터를 사용 하 여 저항을 기록 합니다.
   2. 이식, 제거 와이어; unclamp 셀 챔버 및 PDMS 그리고 그들 전도성 발판에서 별도. 이식 장비의 차원은 약 1 m m x 3 m m x 0.25 m m입니다.

6. 인간의 신경 조상 세포 (hNPCs) PPy에 도금

1. 2 시간 동안 UV 빛에서 조립된 챔버를 소독.
   1. 1 시간 후 조립 회전 90 °를 실.
2. 살 균 후 코트 코팅 기판의 800 µ L와 아래쪽 챔버의 PPy의 표면 하 고 1 시간에 5% CO₂ 에서 37 ° C에서 인큐베이터의 PPy 접시에 공고히 기판 허용.
3. 1 시간 후 챔버에서 상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 잘 당 DPBS Ca + Mg의 1 mL로 씻어.
   참고:로이 코팅 기판의 분리로 인해 강제로 PPy의 표면 세척 하지 마십시오.
4. 신선한 셀 미디어를 사용 하 여 기계적으로 부드러운 pipetting으로 조직 배양 접시에서 챔버와 함께 사용 하기 위해 배양된 세포 분열.
   참고: 셀 분리 시 90-100% 합칠 이어야 한다.
5. HNPC 펠 릿 8000 x g에서 5 분간 원심 분리를 사용 하 여 수집.
6. hemocytometer를 사용 하 고 100, 000 셀/c m²의 볼륨에서 셀 resuspend.
7. 각 챔버 잘 (100000 셀/cm² 미디어의 1 ml에서)으로 100000 세포를 플레이트.
8. 5%에서 37 ° C에서 인큐베이터 챔버 돌아가기 CO_2.

7. 전기 자극의 hNPCs

1. 챔버에 세포를 뿌리기 후에 1 일 파형 발생기를 사용 하 여 셀에 전기 자극을 적용.
2. 자극, 전에 잘 각 약 실에서 오래 된 미디어를 제거 하 고 신선한 미디어의 800 µ L를 보충 합니다.
3. 미디어를 변경한 후 약 실 인큐베이터에 다시, 인큐베이터에서 철사 연장 놓고 파형 발생기에 첨부
4. 1 시간에 100 Hz와 ±400 mV에서 구형 파 신호를 세포에 자극을 적용 합니다.
5. 자극 후 철사를 제거 하 고 또 하루 5% CO₂와 37 ° C에서 설정 하는 인큐베이터에서 챔버를 품 어.
6. 세포 생존 능력 및 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR) 다음 제조 업체의 프로토콜을 포함 하 여 이후 생물 학적 분석을 수행 합니다.

8. PPy 이식 Vivo에서

1. T 세포 결핍에 원심 중간 대뇌 동맥 (dMCA) 폐색 선 모델 수행 성인 남성 누드 쥐 (NIH RNU 230 ± 30 g)로²위에서 설명한. 이식 1 주일 게시물 dMCA 폐색을 수행 합니다.
2. 수술 전에 1 일 그들의 감 금 소 물에 쥐에 암 피 실린 (1 mg/mL)을 제공 합니다.
3. Anesthetize 사용 하 여 유도 챔버 쥐 isoflurane 흡입을 통해 관리의 0.5-3 %mg / kg.
4. 발가락 핀치 반사 응답의 부족에 의해 쥐의 anesthetization를 확인 합니다.
   1. 동물 마 취 동안 막, 호흡 패턴, 색상과 직장 온도 15 분 마다 모니터링을 계속 합니다.
5. 일단 anesthetization 확인, 건조를 방지 하기 위해 쥐의 눈에 인공 눈물을 적용 합니다.
6. 무 균 기술 멸 균 장갑, 그리고 메 마른 외과 용 드 레이프¹³를 사용 하 여이 절차 동안 유지 됩니다 확인 하십시오. 살 균 분야 내 메 마른 외과 기구를 유지.
7. 마 취는 쥐를 실행 하는 동안 왼쪽된 피 위에 craniectomy 드릴. 경질을 엽니다.
   1. 수술 마이크로-얇은 바늘을 사용 하 여 뇌에서 dura mater를 제거 합니다.
8. 쥐 피에 체 외에 시스템에서 전도성 건설 기계를 이식.
   참고: 우리의 실험에 대 한 우리 생체 외에서 3 일 hNPC 도금 후에서 건설 기계에 이식합니다.
   1. 중간 선 병 변 주로 반영 피 질에 플을 놓습니다.
9. 발판은 배치 후, 이식 피부 폐쇄 움직임을 방지 하기 위해 surgicel을 놓습니다.
10. 봉합 사 상처 고 쥐 buprenorphine SR stereotaxic 수술 및 dMCA 폐색과 관련 된 통증을 관리 하기 위해 1 mg/kg의 복용량에 피하 주입
11. 의식 회복 쥐 복구에 놓습니다.
    1. 결코 방치 동물 그것은 의식 하는 동안.
    2. 그것은 완전히 의식을 얻을 때까지 다른 동물을 배치 하지 마십시오.
12. 매일 몸 무게 감소, 감소 음식/물 섭취, 감소 손질/빗질 외 투, 자발적인 활동 감소/증가, 비정상적인 자세, 탈수/피부 tenting, 오목 눈, 숨기기, 자기 절제, 등 통증의 흔적에 대 한 동물을 모니터링 빠른 호흡, 오픈 짖 어 대 호흡, 경련, 떨림, 떨림과 발성 합니다.
    1. 그들이 먹고, 마시고, 손질, 고 무게;를 얻고 나타날 때까지 동물을 매일 모니터링 그리고 체중 증가 후 다음 주간입니다.
13. CO₂ 흡입 및 euthanization (으로 동물 정상적인 산소 공급 게시물 CO₂ 흡입으로 인해 부활 하지 것 이다)의 보조 확인을 통해 초기 euthanization 술 안 먹고 나타나는 어떤 동물에 발생 하 고 초기 수술; 후 무게를 얻고 고통을;에 나타납니다. 때문에 모터 피 질 적자를 예상 보다 더 큰 행동 테스트를 완료할 수 없습니다 나타납니다.

결과

그림 1 에 표시 된 회로도 hNPCs 및 잠재적인 다운스트림 응용 프로그램의 전기 자극의 전체 워크플로 나타냅니다. 줄기 세포 치료에서 현재 한계 줄기 세포 염증, 허 혈 성 조건 등 거친 후 이식 환경에 노출 되는 것 이다.입니다. 이러한 어려운 조건을 가능성이 그들의 치료 효능^14,15제한합니다. 이 환경에서...

토론

증거를 성장 소설 뇌졸중 치료로 줄기 세포의 약속을 입증 했다. 이 약속은 적어도 40 진행 중이거나 완료 된 임상 시험을 머리 맡에 줄기 세포 치료제를 사전 중요 한 노력에 결과 있다. 선 병 급성 모욕 후 과정이 없다 신경 복구를 방지 하기 때문에 줄기 세포 치료 라는 독특한 신경 장애를 제공 합니다. 줄기 세포 강화 된 뇌졸중 복구의 정확한 기계 장치는 불분명 남아 있습니다. 신생, synaptogenesi...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
FGF-Basic	Invitrogen	CTP0261	20 ng/mL for working media
Matrigel	Corning	cb40234a	1:200 dilution
LIF Protein, Recom. Hum. (10 µg/mL)	EMD Millipore	LIF1010	10 ng/mL for working media
Sylgard 184 silicone 3.9 kg	Fisherbrand	NC0162601
Hydrochloric acid	Fisherbrand	SA56-4
Nitric Acid Concentrate (Certified) ACS, Fisher Chemical	Fisherbrand	SA95
ITO Glass	Delta Technologies	CG-40IN-0115
Sodium dodecylbenzenesulfonate	Sigma	289957-1KG
Pyrrole	Sigma	131709-500ML	Protect pyrrole solution from light and room temperature
8 well glass slide chambers	Thermo Sci Nuc	125658	Detach the cell chamber and keep it under sterilized conditions
Flat-Surface Bracket, 3"x1"	McMaster-Carr	1030A4
TWO PART SILVER PAINT 14G	Electron Microscopy Sciences	1264214	Mix two parts (1:1) in plastic plate
DPBS, 1x, with Ca and Mg, No Phenol Red	Genesse	25-508C
AB2 ArunA Neural Cell Culture Media Kit	Aruna Biomedical	ABNS7013.2
hNP1 Human Neural Progenitor Expansion Kit	Aruna Biomedical	hNP7013.1
Noncontact Flow-Adjustment Valve, Nickel-Plated Brass, for 3/32" to 5/8" Tube OD	McMaster-Carr	5330K22
Multimeter	Keysight	E3641A
Wavefoam generator	Keysight	33210A-10MHz
Pt meshes	Sigma-Aldrich	298107-425MG	Reference electrode with dimensions, 1x1 cm
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells	Thermo Fisher Scientific	L3224
BDNF	Thermo Fisher Scientific	Hs02718934_s1
THBS1	Thermo Fisher Scientific	Hs00962908_m1
GAPDH	Thermo Fisher Scientific	Hs02758991_g1
RNeasy Mini Kit (250)	Qiagen	74106
QIAshredder (250)	Qiagen	79656
RNase-Free DNase Set (50)	QIAGEN	79254
iScript cDNA Synthesis Kit, 100 x 20 µL rxns	BIORAD	1708891
TaqMan Gene Expression Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4369510
7-8 Week Old, male, RNU Rats	NCI-Frederick
4-0 Ethicon Silk Suture	eSutures.com	683G
Isoflurane	Henry Schein	29405
V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System	VetEquip	901806
Surgicel Original Absorbable Hemostat	Ethicon	1952
Lab Standard Stereotaxic Instrument, Rat	Stoelting	51600
Kimberly-Clark Professional Safeskin Purple Nitrile Sterile Exam Gloves	Fisherbrand	19-063-130
Sterile Drape	Medline	DYNJSD1092
Thermo Scientific Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle, Holds No. 20-25 Blades	Fisherbrand	53-34
Walter Stern Scalpel Blade Series 300	Fisherbrand	17-654-456
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4484642
Frazier Micro Dissecting Hook	Harvard Apparatus	52-2706