Электропроводящий эшафот чтобы модулировать и доставить стволовых клеток

Резюме

Этот протокол описывает изготовление системы культуры клетки позволяют посева стволовых клеток на леске проводящего полимера в vitro электрической стимуляции и последующих в vivo имплантации с помощью стволовых клеток посеян эшафот Миниинвазивная техника.

Аннотация

Терапия стволовой клетки стала интересной инсульта терапевтического, но метод оптимального доставки остается неясным. Хотя техника микроинъекции был использован на протяжении десятилетий доставить стволовых клеток в ход модели, этот метод ограничен отсутствием способность манипулировать стволовые клетки до инъекции. Этот документ подробно описывает метод с использованием электропроводных полимеров леску для доставки стволовых клеток. Электрической стимуляции стволовых клеток с использованием проводящих полимеров леску изменяет гены стволовых клеток, участвующих в выживание клетки, воспалительной реакции и синаптическую ремоделирования. После электрические предварительной подготовки, стволовые клетки на эшафот интракраниально пересаживают в мышиной модели окклюзии дистального средней мозговой артерии. Этот протокол описывает мощный метод манипулировать стволовые клетки через проводящего полимера леску и создает новое средство для дальнейшего развития на основе стволовых клеток лечение.

Введение

Инсульт является второй ведущей причиной смерти в мире и пятой ведущей причиной смерти в Соединенных Штатах. Несмотря на эти высокие показатели смертности лечение инсульта восстановление в настоящее время остается проблема не жизнеспособным медицинской вариантов имеющихся в настоящее время¹. В настоящее время около 300 клинических испытаний, занимающихся ишемических инсультов, из которых только 40 использовать стволовые клетки. Предыдущие исследования показали, что терапия стволовой клетки имеют положительное влияние на ход ремонта^2,3. Паракринными такие факторы, как мозг нейротрофического фактора (BDNF) и Тромбоспондин-1 (THBS-1) освобожден от пересаженных человека нейронных прародитель клеток (hNPCs) показали улучшение функционального восстановления через механизмы, связанные с увеличением СИНАПС формирования, ангиогенез, дендритных ветвления и новые аксональное прогнозы, а также модуляции иммунной системы^4,5,6. Однако методы оптимального доставки стволовых клеток остаются недостижимой.

Проблемой остается доставки успешно стволовых клеток головного мозга. В настоящее время доставить стволовые клетки были введены инъекционные гидрогеля и полимерные строительные леса. Эти методы доставки защиты во время трансплантации стволовых клеток, а также обеспечивают защиту от суровой окружающей среды после инсульта, включая хозяина воспалительной реакции и гипоксических условий^{7,8,9 , 10}. Однако, наиболее часто используемые материалы инертные, который ограничивает использование непрерывной модуляции (то есть, электрической стимуляции) клетки¹¹. Электрическая стимуляция — это подсказка, которая влияет на дифференциации, плотность каналов иона и neurite нарост стволовых клеток¹². По сравнению с инертные полимеры проводящие полимеры могут нести текущего позволяя для электростимуляции и манипуляции стволовые клетки². Однако точный механизм, по которому электрической стимуляции модулирует нейротрофических факторов выпуска (т.е., BDNF и THBS-1) еще не полностью изучены.

В этом протоколе мы описывают шаги для построения клеток культуры системы, состоящей из проводящего полимера леску, политиофен (PPy), что позволяет в vitro электрической стимуляции. Из-за манере, в которой изготовлен в системе культуры клеток последующие Вживление стволовых клеток посеян леску на пери-при инфаркте мозга возможна. Для этой системы мы электрически предпосылкой стволовых клеток на эшафот за короткий период времени до имплантации. После электростимуляции проводящего полимера эшафот, перевозящих клетки успешно имплантируется интракраниально минимально инвазивным методом.

протокол

Все стволовых клеток и животных процедуры были утверждены Комитетом по надзору исследования стволовых клеток Стэнфордского университета и административной группой Стэнфордского университета на лабораторных животных уход (SCRO-616 и APLAC-31909).

1. травление стекла ITO

1. Подготовьте Индий оксид олова (ИТО)-крытая стеклянное скольжение, поместив маскирующий агент проводящих стороне стекла.
   Примечание: Большинство коммерческих прозрачная лента может использоваться как маскирующий агент.
   1. Удалите излишки маски с помощью лезвия, оставив только желаемую форму окончательного дизайна Ито распространяется на стекле.
2. Комбинат 5% (v/v) азотной кислоты и 45% (v/v) HCl в стеклянный стакан внутри зонта для приготовления раствора травления.
   1. Использование горячей плите и термометр для сохранения температуры травления раствор в 70 ° C.
3. После травления решение достигает 70 ° C, место масках ITO стекла слайд в раствор для 2 минут, чтобы удалить избыток слой Ито.
   Примечание: Ленты маскирующие защищает слой Ито от воздействия кислотного раствора.
4. Удалить слайд из раствора и промыть его с дейонизированной (DI) H₂O.
5. Осторожно удалите маску и мера сопротивления с помощью мультиметр для обеспечения того, чтобы оставшиеся Ито нетронутыми. Индикация желаемого травлению области должно быть приблизительно 0 Ω.

2. Приготовление раствора пиррол

1. В 1000 мл стеклянной бутылке растворяют 70 г натрия dodecylbenzenesulfonate (NaDBS) в 600 мл ди H₂O.
2. Как только NaDBS растворяется, добавьте в решение 14 мл 0,2 М пиррол и 386 мл ди H₂O.
3. Охватывать решение с алюминиевой фольгой и хранить при 4 ° C.

3. гальванические из политиофен на стекла ITO

1. Теплый пиррол решение до комнатной температуры, до тех пор, пока NaDBS полностью перерастворить.
   Примечание: Это занимает около 15-20 минут.
2. Налейте в стакан 25 мл раствора пиррол.
3. Подключите травления стекла ITO к мультиметр и погрузите слайд в пиррол раствор.
   1. Убедитесь, что на сторону с 0 Ω сопротивление обращена электрод сравнения платиновой сетки.
4. Применение электрического тока инициировать гальванического PPy на поверхности Ито, с помощью мультиметра (в настоящее время контролируется на 3 мА/см² на 4 часа).
5. Удаление стекла ITO от мультиметра и мыть гальваническим PPy ди H₂O для удаления остаточного ПАВ.
6. Аккуратно отсоедините гальваническим PPy пластина из стекла ITO, с помощью лезвия бритвы.
   1. Магазин PPy пластины при комнатной температуре.

4. Подготовка полидиметилсилоксан (PDMS)

1. С помощью шпателя и весят блюдо, смешать 18 g базовых агента с 2 g отвердителя и вылейте смесь в формы стекла два 10 х 8 см.
2. Удалите пузырьки из формы, с помощью вакуумной камере для 15-20 минут.
3. Место формы в 70 ° C духовке 3 часа.
4. После охлаждения, используйте плоский шпатель для удаления PDMS из формы.

5. Изготовление палаты в Vitro электростимуляции

1. Автоклав металлических пластин (WxL, 2,5 см x 12.5 см) и поток клапаны на 120 ° C за 1 час.
2. С помощью камеры слайд как шаблон, вырежьте две части PDMS.
   Примечание: Одна часть PDMS служит по периметру ячейки камеры с вырезами две смежные квадраты из внутри клетки камеры. Другая часть PDMS является изложение палаты периметра.
   1. Вырезать внутри клеток камеры так что это квадратные формы и соответствует по форме ячеек камеры. Убедитесь, что общая форма обеих частей PDMS прямоугольные и совпадает с камеры слайд.
3. Слоя материалы как снизу вверх: (1) металлические плита, (2) PDMS (без вырезов), (3) PPy плиты (перпендикулярно PDMS), (4) PDMS (с вырезами) и камера (5) клеток.
4. Зажим аппарат вместе, как только он полностью выравнивается.
5. Вырезать две 60 см кусочки металлической проволоки и использовать серебряные пасты для присоединения один провод к каждому концу PPy пластина, которая выступала от внешней камеры. Убедитесь, что провода достаточно долго, чтобы продлить из аппарата за пределами инкубатора.
6. После того, как вылечить серебряная паста, усиливают и уплотнение проводное соединение с эпоксидной.
   1. Запись сопротивления с помощью мультиметра чтобы убедиться, что поле прикладной является то же самое в каждой камере.
   2. Для имплантации удалите провода; Разожмите ячейки камер и PDMS и затем их отдельно от проводящего эшафот. Измерении имплантированных подмостей — около 1 мм x 3 мм x 0,25 мм.

6. покрытие нейронных прогениторных клеток человека (hNPCs) на PPy

1. Стерилизуйте сборных камер под УФ светом на 2 часа.
   1. После 1 часа, вращать собравшихся палат 90°.
2. После стерилизации покрыть поверхность PPy в нижней части камеры с 800 мкл покрытие субстрата и позволяют субстрат для закрепления на PPy табличке в инкубаторе при 37 ° C на 5% CO₂ на 1 ч.
3. После 1 часа удалить супернатант из камер и осторожно промойте с 1 мл DPBS + Ca и Mg на хорошо.
   Примечание: Избегайте мытье поверхности PPy решительно, как это вызовет отряд покрытие субстрата.
4. Используя свежие клетки СМИ, механически отделить культивируемых клеток для использования с камерами от культуры ткани пластины с нежным закупорить.
   Примечание: Клетки должна быть 90-100% притока при диссоциации.
5. Собрать hNPC гранул с помощью центрифугирования в 8000 x g за 5 минут.
6. С помощью Горяева, рассчитывать и Ресуспензируйте клетки на объем 100000 клеток/см².
7. Пластина 100000 клеток в каждой камере хорошо (100000 клеток/см² в 1 мл СМИ).
8. Возвращение камеры в инкубатор при 37 ° C на уровне 5% CO_2.

7. Электрическая стимуляция hNPCs

1. Один день после посева клетки на камеры, использовать генератор сигнала для применения электрической стимуляции клеток.
2. До стимуляции удалите старые средства массовой информации из каждой камеры хорошо и пополнить с 800 мкл свежих средств массовой информации.
3. После того, как средства массовой информации меняется, установите камеры обратно в инкубатор, расширять провода из инкубатора и прикрепить их к генератор сигнала
4. Стимулирование применить к ячейкам с прямоугольной волны сигнала на ±400 мВ с 100 Гц для 1 h.
5. После стимуляции удалите провода и инкубировать камер на другой день в инкубаторе набор при 37 ° C с 5% CO₂.
6. Выполнение последующих биологического анализа, включая жизнеспособность клеток и количественных реального времени полимеразной цепной реакции (qRT ПЦР) после производителя протокол.

8. в Vivo PPy имплантации

1. Выполнение модели инсульта окклюзии дистального средней мозговой артерии (dMCA) на Т клеток недостаточным взрослых крыс мужской обнаженной (NIH-РНЕ 230 ± 30 g) как описано выше². Выполните имплантации одну неделю пост dMCA окклюзии.
2. Один день до операции, дать крысы в их клетке воды ампициллин (1 мг/мл).
3. Анестезировать крыса в камеру всасывание с помощью 0,5 - 3% мг/кг изофлюрановая через вдыхание.
4. Подтвердите анестезии крысы, отсутствие мыс щепотку рефлекторной реакции.
   1. В то время как животное под наркозом, продолжать следить за ее цвет мембраны, ритм дыхания и ректальной температуры каждые 15 минут.
5. После подтверждения анестезии, примените искусственные слезы на глазах крыса для предотвращения сухости.
6. Обеспечить поддержание асептической техники во время этой процедуры с помощью стерильных перчаток и стерильные хирургические Пелерина¹³. Стерильные хирургические инструменты держите в поле стерильным.
7. В то время как крыса под наркозом, дрель Краниэктомия выше левой коры. Откройте Дура.
   1. Удаление твердой мозговой оболочки из мозга с помощью микро тонкий Хирургические иглы.
8. Имплантат проводящих подмости от в vitro систему крысиный коры.
   Примечание: Для наших экспериментов, мы имплантированном подмости от в пробирке 3 день после hNPC покрытие.
   1. Место имплантат главным образом на полутени коры медиальнее поражения инсульта.
9. После того, как леска помещается, место surgicel над имплантатом для предотвращения движения с закрытием кожи.
10. Шов раны закрыты и подкожно вводить крыс с бупренорфин SR в дозе 1 мг/кг для управления боли, связанные с стереотаксической хирургии и dMCA окклюзии.
11. Поместите крыса в клетке восстановления, как он приходит в сознание.
    1. Никогда не оставляйте животное без присмотра, пока он находится в бессознательном состоянии.
    2. Не размещайте животное с другими, до тех пор, пока она полностью получила сознания.
12. Мониторинг животных ежедневно для признаков боли в том числе потеря массы тела, снижение питания/водозабора, снижение груминг/неопрятный пальто, повышенного/снижение спонтанной активности, ненормальное положение, обезвоживания/кожи палаток, запавшие глаза, скрываться, членовредительство, учащенное дыхание, открытым ртом, дыхание, твичинг, дрожь, тремор и вокализации.
    1. Мониторинг животных ежедневно до тех пор, пока кажется, что они еды, питья, груминг и набирает вес; и затем еженедельно после увеличения веса.
13. Ранние euthanization CO₂ при вдыхании и вторичных подтверждение euthanization (чтобы обеспечить животное не возродится из-за нормального кислорода поставок должность CO₂ ингаляции) будет происходить любое животное, которое представляется не есть, пить и набирать вес после первоначального хирургической процедуры; появляется боль; или появляется не в состоянии завершить поведенческие тесты из-за большего, чем ожидалось дефицит мотор коры.

Результаты

Схема, показанный на рисунке 1 представляет общий процесс электрической стимуляции hNPCs и потенциальных нисходящие приложения. Текущее ограничение в клеточной терапии является, что стволовые клетки подвергаются суровой окружающей среды после транспл?...

Обсуждение

Растущих доказательств показал обещание стволовых клеток как Роман ход терапии. Это обещание привела к значительные усилия для продвижения в постели с по меньшей мере 40 текущих или завершенных клинических испытаний клеточной терапии. Инсульта патологии предлагает уникальный невроло...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
FGF-Basic	Invitrogen	CTP0261	20 ng/mL for working media
Matrigel	Corning	cb40234a	1:200 dilution
LIF Protein, Recom. Hum. (10 µg/mL)	EMD Millipore	LIF1010	10 ng/mL for working media
Sylgard 184 silicone 3.9 kg	Fisherbrand	NC0162601
Hydrochloric acid	Fisherbrand	SA56-4
Nitric Acid Concentrate (Certified) ACS, Fisher Chemical	Fisherbrand	SA95
ITO Glass	Delta Technologies	CG-40IN-0115
Sodium dodecylbenzenesulfonate	Sigma	289957-1KG
Pyrrole	Sigma	131709-500ML	Protect pyrrole solution from light and room temperature
8 well glass slide chambers	Thermo Sci Nuc	125658	Detach the cell chamber and keep it under sterilized conditions
Flat-Surface Bracket, 3"x1"	McMaster-Carr	1030A4
TWO PART SILVER PAINT 14G	Electron Microscopy Sciences	1264214	Mix two parts (1:1) in plastic plate
DPBS, 1x, with Ca and Mg, No Phenol Red	Genesse	25-508C
AB2 ArunA Neural Cell Culture Media Kit	Aruna Biomedical	ABNS7013.2
hNP1 Human Neural Progenitor Expansion Kit	Aruna Biomedical	hNP7013.1
Noncontact Flow-Adjustment Valve, Nickel-Plated Brass, for 3/32" to 5/8" Tube OD	McMaster-Carr	5330K22
Multimeter	Keysight	E3641A
Wavefoam generator	Keysight	33210A-10MHz
Pt meshes	Sigma-Aldrich	298107-425MG	Reference electrode with dimensions, 1x1 cm
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells	Thermo Fisher Scientific	L3224
BDNF	Thermo Fisher Scientific	Hs02718934_s1
THBS1	Thermo Fisher Scientific	Hs00962908_m1
GAPDH	Thermo Fisher Scientific	Hs02758991_g1
RNeasy Mini Kit (250)	Qiagen	74106
QIAshredder (250)	Qiagen	79656
RNase-Free DNase Set (50)	QIAGEN	79254
iScript cDNA Synthesis Kit, 100 x 20 µL rxns	BIORAD	1708891
TaqMan Gene Expression Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4369510
7-8 Week Old, male, RNU Rats	NCI-Frederick
4-0 Ethicon Silk Suture	eSutures.com	683G
Isoflurane	Henry Schein	29405
V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System	VetEquip	901806
Surgicel Original Absorbable Hemostat	Ethicon	1952
Lab Standard Stereotaxic Instrument, Rat	Stoelting	51600
Kimberly-Clark Professional Safeskin Purple Nitrile Sterile Exam Gloves	Fisherbrand	19-063-130
Sterile Drape	Medline	DYNJSD1092
Thermo Scientific Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle, Holds No. 20-25 Blades	Fisherbrand	53-34
Walter Stern Scalpel Blade Series 300	Fisherbrand	17-654-456
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4484642
Frazier Micro Dissecting Hook	Harvard Apparatus	52-2706