Eletricamente condutivo Andaime modular e entregar as células-tronco

Resumo

Este protocolo descreve a fabricação de um sistema de cultura de células para permitir a propagação de células-tronco em um andaime de polímero condutor para estimulação elétrica em vitro e subsequentes na vivo implantação da célula-tronco-semeado andaime usando um técnica minimamente invasiva.

Resumo

Terapia de células-tronco tem emergido como um excitante curso terapêutica, mas o método de entrega ideal permanece obscuro. Enquanto a técnica de microinjeção tem sido usada há décadas para fornecer células-tronco em modelos stroke, esta técnica é limitada pela falta de habilidade para manipular as células-tronco antes da injeção. Este documento detalha um método do uso de um andaime de polímero eletricamente condutivo para a entrega de células-tronco. Estimulação elétrica de células-tronco usando um andaime de polímero condutor altera os genes da célula tronco envolvidos na sobrevivência celular, resposta inflamatória e remodelamento sináptico. Após pré-condicionamento elétrico, as células-tronco no andaime são transplantadas intracraniano em um modelo de rato de oclusão de artéria cerebral média distal. Este protocolo descreve uma técnica poderosa para manipular as células-tronco através de um andaime de polímero condutor e cria uma nova ferramenta para desenvolver a terapia baseada em células-tronco.

Introdução

Derrame é a segunda principal causa de morte no mundo e a quinta causa principal de morte nos Estados Unidos. Apesar destas altas taxas de morte, tratamentos para recuperação de acidente vascular cerebral atualmente permanecem um desafio com sem opções viáveis de médicos actualmente disponíveis¹. Existem atualmente cerca de 300 ensaios clínicos lidando com traços isquêmicos, dos quais somente 40 utilizam células-tronco. Estudos anteriores demonstraram que as terapias de células-tronco têm um efeito benéfico sobre o curso reparo^2,3. Parácrina fatores como fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e thrombospondin-1 (THBS-1) lançado a partir de células progenitoras neurais humanas transplantadas (hNPCs) têm mostrado recuperação funcional melhorada através de mecanismos associados com um aumento na sinapse formação, angiogênese, ramificações dendríticas e novas projeções axonal, bem como modulando o sistema imunológico^4,5,6. No entanto, os métodos de entrega ideal das células-tronco permanecem indescritíveis.

Entrega de células-tronco bem sucedida para o cérebro continua a ser um desafio. Atualmente, hidrogel injetável e sistemas poliméricos andaimes foram introduzidos para fornecer células-tronco. Esses métodos de entrega protegem transplante de células-tronco, bem como oferecem proteção contra o ambiente áspero de acidente vascular cerebral incluindo resposta inflamatória do hospedeiro e as condições de hipóxia^{7,8,9 , 10}. no entanto, os materiais mais comumente usados são inertes, que limita o uso de modulação contínua (ou seja, estimulação elétrica) das células¹¹. Estimulação elétrica é uma sugestão que influencia a diferenciação e densidade de canais de íon axônio consequência de células-tronco¹². Em comparação com os polímeros inertes, polímeros condutores podem transportar um atual permitindo a estimulação elétrica e manipulação de células-tronco². No entanto, o mecanismo preciso pelo qual estimulação elétrica modula a liberação de fator neurotrophic (i.e., BDNF e THBS-1) é ainda não totalmente explorado.

Este protocolo, descreveremos os passos para construir um sistema de cultura de células consistindo de um andaime de polímero condutor, polipirrol (PPA), que permite a estimulação elétrica em vitro . Por causa da maneira em que o sistema de cultura de células é fabricado, a posterior implantação de células-tronco-semeado cadafalso para o córtex peri-infarto é possível. Para este sistema, temos condição eletricamente as células-tronco no cadafalso por um curto período de tempo antes da implantação. Após a estimulação elétrica, o andaime de polímero condutor carregando as células é implantado com sucesso intracraniano, usando um método minimamente invasivo.

Protocolo

Todas as células-tronco e procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê de supervisão de pesquisa de células-tronco de Stanford e pelo painel administrativo da Universidade de Stanford em cuidado de Animal de laboratório (SCRO-616 e APLAC-31909).

1. gravura de vidro de ITO

1. Preparar o óxido da lata do indium (ITO)-lâmina de vidro coberta pela colocação de um agente de mascaramento no lado do condutor do vidro.
   Nota: Mais comerciais fitas transparentes podem ser usadas como um agente de mascaramento.
   1. Remover a máscara em excesso, usando uma lâmina, deixar apenas a forma desejada do design final ITO coberto no vidro.
2. Combine 5% (v/v) de ácido nítrico e 45% (v/v) de HCl num copo de vidro dentro de uma coifa para preparar a solução de gravura.
   1. Usar um prato quente e um termômetro para garantir que a temperatura da solução de condicionamento é mantida a 70 ° C.
3. Uma vez que a solução de gravura chega a 70 ° C, coloque a lâmina de vidro de mascarados-ITO na solução por 2 minutos remover a camada de ITO em excesso.
   Nota: Mascaramento de fita protege a camada de ITO de exposição a solução ácida.
4. Retire o slide da solução e enxágue com deionizada (DI) H₂O.
5. Remova cuidadosamente a máscara e medida de resistência usando um multímetro para garantir que os restante ITO está intacto. Leituras da área desejada gravada devem ser de aproximadamente 0 Ω.

2. preparação da solução de pirrol

1. Uma garrafa de vidro de 1000 mL, dissolver 70 g de dodecylbenzenesulfonate de sódio (NaDBS) em 600 mL de DI H₂O.
2. Uma vez que o NaDBS é dissolvido, adicione 14 mL de pirrol 0,2 M e 386 mL de DI H₂O para a solução.
3. Cobrir a solução com papel alumínio e armazene a 4 ° C.

3. galvanização de polipirrol em vidro de ITO

1. Aquecer a solução de pirrol à temperatura até NaDBS é totalmente evapora.
   Nota: Isto leva cerca de 15 a 20 minutos.
2. Despeje uma proveta 25 mL da solução de pirrol.
3. Conectar o vidro de ITO gravado a um multímetro e mergulhe o slide a solução de pirrol.
   1. Certifique-se de que o lado com a resistência de Ω 0 é virada para o eléctrodo de referência de malha de platina.
4. Aplica uma corrente elétrica para iniciar a galvanização do PPA na superfície de ITO, usando um multímetro (corrente controlada em 3 mA/cm² para 4 horas).
5. Remova o multímetro e lave galvanizada-PPA em DI H₂O surfactante residual de remover o vidro de ITO.
6. Suavemente retire a chapa galvanizada-PPA do vidro de ITO, usando uma lâmina de barbear.
   1. Armazene a placa PPA à temperatura ambiente.

4. preparação do Polydimethylsiloxane (PDMS)

1. Usando uma espátula e um prato de pesagem, misturar 18 g de agente de base com 2 g de agente de cura e despeje a mistura em moldes de vidro dois 10 x 8 cm.
2. Remova as bolhas de moldes utilizando uma câmara de vácuo para 15-20 minutos.
3. Coloque os moldes em um forno de 70 ° C por 3 h.
4. Uma vez arrefecido, use uma espátula plana para remover o PDMS de moldes.

5. fabricação da câmara de estimulação elétrica em Vitro

1. Autoclave a placas de metal (WxL, 2,5 cm x 12,5 cm) e fluxo de válvulas a 120 ° C por 1 hora.
2. Usando um slide da câmara como um modelo, corte dois pedaços de PDMS.
   Nota: Um pedaço de PDMS serve como o perímetro da câmara de célula com recortes de dois quadrados contíguos de dentro da câmara de célula. O outro pedaço PDMS é o contorno do perímetro da câmara.
   1. Cortar o interior câmara de célula para que ele seja quadrado em forma de e coincide com a forma da câmara de célula. Certifique-se que a forma geral de ambas as partes de PDMS é retangular e correspondências do slide a câmara.
3. Os materiais da camada seguinte de baixo para cima: (1) placa, de Metal (2) PDMS (sem recortes), prato (3) PPA (perpendicular ao PDMS), (4) PDMS (com recortes) e câmara de celular (5).
4. Fixe o aparelho juntos uma vez que ele é totalmente alinhado.
5. Corte dois pedaços de 60 cm de um fio de metal e use o colar de prata para anexar um fio para cada extremidade da placa PPA que se projeta do lado de fora da câmara. Certifique-se de que os fios são tempo suficiente para estender do aparelho para o exterior de uma incubadora.
6. Uma vez que o colar de prata está curado, reforçar e selar a conexão do fio com epóxi.
   1. A resistência usando um multímetro para certificar-se de que o campo aplicado é o mesmo em cada câmara de registro.
   2. Para implantação, retire os fios; desapertar as câmaras de célula e PDMS e, em seguida, eles separam o andaime condutora. A dimensão dos andaimes implantado é de aproximadamente 1 x 3 x 0,25 mm.

6. chapeamento humano neurais progenitoras (hNPCs) no PPA

1. Esterilize as câmaras montadas sob luz UV durante 2 horas.
   1. Depois de 1 hora, gire o montado câmaras de 90°.
2. Após a esterilização, reveste a superfície do PPA na parte inferior da câmara com 800 µ l de um substrato de revestimento e permitir que o substrato solidificar na placa PPA na incubadora a 37 ° C em 5% de CO₂ por 1h.
3. Depois de 1 hora, retire o sobrenadante das câmaras e lave delicadamente com 1 mL de DPBS + Ca + Mg por bem.
   Nota: Evite lavar a superfície do PPA com força, porque isso poderá provocar o desprendimento do substrato do revestimento.
4. Usando a mídia de células frescas, mecanicamente dissocia pilhas cultivadas para uso com as câmaras de uma placa de cultura de tecido com suave pipetagem.
   Nota: As células devem ser confluente de 90-100% em cima de dissociação.
5. Coletar hNPC pelotas usando centrifugação a 8000 x g, durante 5 minutos.
6. Usando um hemocytometer, contar e ressuspender as células em um volume de 100.000 células/cm².
7. Placa de 100.000 células em cada câmara bem (100.000 células/cm² em 1 mL de mídia).
8. Câmaras de retornar a incubadora a 37 ° C em 5% CO_2.

7. eletroestimulação de hNPCs

1. Um dia após a semeadura as células sobre as câmaras, use um gerador de forma de onda para aplicar estimulação elétrica para as células.
2. Antes da estimulação, remover a velha mídia de cada câmara bem e reabasteça com 800 µ l de mídia fresca.
3. Depois que a mídia é alterada, colocar câmaras de volta para a incubadora, estender os cabos fora da incubadora e anexá-los a um gerador de forma de onda
4. Aplica o estímulo para as células com um sinal de onda quadrada em mV ±400 com 100 Hz por 1h.
5. Após a estimulação, retire os fios e incubar as câmaras para outro dia em uma incubadora que defina a 37 ° C com 5% de CO₂.
6. Realizar análise biológica subsequente, incluindo a viabilidade celular e reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa (qRT-PCR) seguindo o protocolo do fabricante.

8. na Vivo PPy implantação

1. Executar modelos de stroke de oclusão de artéria cerebral média distal (dMCA) na deficiência de células T ratos nus macho adulto (NIH-RNU 230 ± 30 g) como descrito anteriormente². Realize a oclusão de post-dMCA de uma semana de implantação.
2. Um dia antes da cirurgia, dê ampicilina (1 mg/mL) para os ratos em sua água de gaiola.
3. Anestesiar o rato em uma câmara de indução usando 0,5 - 3% mg/kg de isoflurano administrado por inalação.
4. Confirme anesthetization do rato pela falta de reflexo resposta pitada de dedo do pé.
   1. Enquanto o animal está sob anestesia, continue a monitorar sua membrana cor, padrão de respiração e temperatura retal a cada 15 minutos.
5. Uma vez confirmada anesthetization, aplica lágrimas artificiais aos olhos do rato para evitar ressecamento.
6. Garantir a manutenção técnica asséptica durante este procedimento, usando luvas estéreis e um pano cirúrgico estéril¹³. Manter estéril instrumentos cirúrgicos dentro de um campo estéril.
7. Enquanto o rato está sob anestesia, perfure uma craniectomia acima o córtex esquerdo. Abra a dura-máter.
   1. Remova a dura-máter do cérebro usando uma agulha fina micro cirúrgica.
8. Implante os andaimes condutoras do sistema in vitro para o córtex de rato.
   Nota: Para nossos experimentos, implantamos andaimes em vitro dia 3 após hNPC chapeamento.
   1. Coloque o implante principalmente no córtex penumbral medial à lesão de acidente vascular cerebral.
9. Após o andaime é colocado, coloque surgicel sobre o implante para impedir a movimentação com o fechamento da pele.
10. Sutura ferida fechada e injectar por via subcutânea os ratos com buprenorfina SR a uma dosagem de 1 mg/kg para controlar a dor associada com cirurgia estereotáxica e oclusão de dMCA.
11. Coloque o rato em uma gaiola de recuperação como ele recobra a consciência.
    1. Nunca abandone o animal enquanto está inconsciente.
    2. Não coloque o animal com os outros até totalmente ganhou consciência.
12. Monitorar os animais diariamente para sinais de dor, incluindo perda de peso corporal, ingestão de comida/água diminuiu, casaco de aliciamento/despenteado reduzido, aumento/diminuição da atividade espontânea, postura anormal, desidratação/pele acampar, olhos encovados, escondido, auto-mutilação, respiração rápida, respiração de boca aberta, tremendo, tremendo, tremor e vocalização.
    1. Monitorar os animais diariamente, até parece que eles estão comendo, bebendo, aliciamento e ganhando peso; e então semanal após o ganho de peso.
13. Eutanásia precoce através da inalação de CO₂ e uma confirmação secundária de eutanásia (assegurar o animal não reviverá devido por inalação de oxigênio normal abastecimento post CO₂ ) ocorrerá a qualquer animal que aparenta não estar comendo, bebendo e ganho de peso após o procedimento cirúrgico inicial; aparece na dor; ou parece incapaz de concluir os testes comportamentais devido a um maior que o esperado déficit do córtex motor.

Resultados

O diagrama mostrado na Figura 1 representa o fluxo de trabalho geral da estimulação elétrica de hNPCs e potenciais aplicações a jusante. Uma limitação atual na terapia de células-tronco é que as células-tronco são expostas a um ambiente áspero do pós-transplante incluindo inflamação e condições isquêmicas. Estas condições difíceis prováveis limitam sua eficácia terapêutica^14,15...

Discussão

Crescentes evidências tem demonstrado a promessa de células-tronco como uma terapia de romance, acidente vascular cerebral. Esta promessa resultou em um grande esforço para avançar terapêutica de células-tronco para o lado da cama, pelo menos 40 ensaios clínicos em curso ou já concluídos. Patologia de curso oferece um único distúrbio neurológico que se presta a terapia de células-tronco, porque após o insulto agudo, não há nenhum processo neurodegenerativas, impedindo a recuperação. O mecanismo exato de...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
FGF-Basic	Invitrogen	CTP0261	20 ng/mL for working media
Matrigel	Corning	cb40234a	1:200 dilution
LIF Protein, Recom. Hum. (10 µg/mL)	EMD Millipore	LIF1010	10 ng/mL for working media
Sylgard 184 silicone 3.9 kg	Fisherbrand	NC0162601
Hydrochloric acid	Fisherbrand	SA56-4
Nitric Acid Concentrate (Certified) ACS, Fisher Chemical	Fisherbrand	SA95
ITO Glass	Delta Technologies	CG-40IN-0115
Sodium dodecylbenzenesulfonate	Sigma	289957-1KG
Pyrrole	Sigma	131709-500ML	Protect pyrrole solution from light and room temperature
8 well glass slide chambers	Thermo Sci Nuc	125658	Detach the cell chamber and keep it under sterilized conditions
Flat-Surface Bracket, 3"x1"	McMaster-Carr	1030A4
TWO PART SILVER PAINT 14G	Electron Microscopy Sciences	1264214	Mix two parts (1:1) in plastic plate
DPBS, 1x, with Ca and Mg, No Phenol Red	Genesse	25-508C
AB2 ArunA Neural Cell Culture Media Kit	Aruna Biomedical	ABNS7013.2
hNP1 Human Neural Progenitor Expansion Kit	Aruna Biomedical	hNP7013.1
Noncontact Flow-Adjustment Valve, Nickel-Plated Brass, for 3/32" to 5/8" Tube OD	McMaster-Carr	5330K22
Multimeter	Keysight	E3641A
Wavefoam generator	Keysight	33210A-10MHz
Pt meshes	Sigma-Aldrich	298107-425MG	Reference electrode with dimensions, 1x1 cm
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells	Thermo Fisher Scientific	L3224
BDNF	Thermo Fisher Scientific	Hs02718934_s1
THBS1	Thermo Fisher Scientific	Hs00962908_m1
GAPDH	Thermo Fisher Scientific	Hs02758991_g1
RNeasy Mini Kit (250)	Qiagen	74106
QIAshredder (250)	Qiagen	79656
RNase-Free DNase Set (50)	QIAGEN	79254
iScript cDNA Synthesis Kit, 100 x 20 µL rxns	BIORAD	1708891
TaqMan Gene Expression Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4369510
7-8 Week Old, male, RNU Rats	NCI-Frederick
4-0 Ethicon Silk Suture	eSutures.com	683G
Isoflurane	Henry Schein	29405
V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System	VetEquip	901806
Surgicel Original Absorbable Hemostat	Ethicon	1952
Lab Standard Stereotaxic Instrument, Rat	Stoelting	51600
Kimberly-Clark Professional Safeskin Purple Nitrile Sterile Exam Gloves	Fisherbrand	19-063-130
Sterile Drape	Medline	DYNJSD1092
Thermo Scientific Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle, Holds No. 20-25 Blades	Fisherbrand	53-34
Walter Stern Scalpel Blade Series 300	Fisherbrand	17-654-456
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4484642
Frazier Micro Dissecting Hook	Harvard Apparatus	52-2706