JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה מתאר שיטה microarray חלבון עבור פרופיל החיסונית ההורמונאלית, התגובות פאנל 7-ה-plex של מאוד מטוהרים Clostridium difficile אנטיגנים של sera אנושי. ניתן להאריך את הפרוטוקול מצפני תגובות נוגדנים ספציפיים בהכנות של ורידי polyclonal.

Abstract

אנו מספקים סקירה מפורטת הרומן תפוקה גבוהה microarray שיטת קביעת אנטי - רמות נוגדןClostridium difficile סרה אנושי, ההכנות נפרדים של polyclonal עירוי אימונוגלובולינים (IVIg). הפרוטוקול מתאר את השלבים מתודולוגי המעורבים הכנת הדוגמא, הדפסה של מערכים, וזמינותו הליך ניתוח נתונים. בנוסף, פרוטוקול זה יכול להיות פיתוח נוסף לשלב דגימות קליניים מגוונים, לרבות פלזמה, תא supernatants תרבות. אנחנו מראים איך microarray חלבון יכול לשמש כדי לקבוע שילוב של isotype (IgG, איגה, IgM), מחלקת משנה (IgG1 IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), וטיהרו נוגדנים ספציפיים זן מאוד כל difficile ג רעלים A ו- B (toxinotype 0, זן VPI 10463, ribotype 087), הרעלן B מ ג difficile הרעלן B-בלבד לביטוי זן (CCUG 20309), צורת קודמן קטע B של הרעלן בינארי, pCDTb, ribotype ספציפיים כל משטח שכבת חלבונים (SLPs; 001, 002, 027), ולשלוט חלבונים (טטנוס טוקסואידי, קנדידה אלביקנס). במהלך הניסוי, מיקרו-מערכים הם שנבדק עם סרה מאנשים עם זיהום difficile ג CDI, אנשים עם סיסטיק פיברוזיס (CF) ללא שלשולים, בריא פקדים (HC), וממנו ויחידים טרום טיפול פוסט-IVIg טיפול של CDI, כשל חיסוני משולב הפרעה כרונית דלקתית כרונית polyradiculopathy. אנו נתקלים הבדלים משמעותיים efficacies ניטרול רעלים, רמות נוגדן ספציפי מולטי-isotype בין קבוצות המטופל, תכשירים מסחריים של IVIg, ואת שרה לפני הבאים IVIg המינהל. בנוסף, יש מתאם משמעותי בין microarray מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה) עבור רמות IgG אנטיטוקסין הדוגמאות סרום. תוצאות אלו מציעים ש-microarray הזה יכול להיות כלי מבטיח עבור פרופיל תגובות נוגדנים אנטיגנים C.difficile בבני אדם שחוסנו או נגועים. עם עוד יותר עידון של אנטיגן פאנלים, צמצום עלויות הייצור, אנו צופים כי הטכנולוגיה microarray עשוי לעזור לייעל ובחר את immunotherapies שימושי ביותר קלינית לדלקת difficile ג באופן ספציפי למטופל.

Introduction

פרוטוקול זה מתאר את התפתחות של אימות של הרומן ומותאמות microarray שיטת איתור של כימות למחצה של זן חיידקי, נוגדן ספציפי isotype התגובות difficile ג אנטיגנים. אנו משתמשים בהצלחה שלנו difficile ג-microarray ספציפי assay ככלי חדש מבטיח bioanalysis ההלחנה תכני נוגדן ספציפי סרה החולה1,2, ההכנות של IVIg3, ו- זיהוי נוגדנים specificities עם עני תוצאות ב- CDI4. נדגים כיצד הדוגמאות סרום biobanked וההכנות מסחרי של IVIg ניתן לנתח microarray שקופיות, ומאפשר פרופיל לשחזור באיכות גבוהה של התגובות נוגדן ספציפי פתוגן difficile ג assay הזה.

ילדים בריאים ומבוגרים רבים יש סרום לזיהוי נוגדנים IgG ואיגה difficile ג רעלים A ו- B5,6. אלה נחשבים להתעורר בעקבות חשיפת חולף במהלך הינקות, בעקבות חשיפה difficile ג בבגרות. מסיבה זו, polyclonal IVIg היה בשימוש מותווים לטיפול חוזרים ונשנים והן לפתח CDI7,8,9. עם זאת, שלו תפקיד מכריע, מצב הפעולה עדיין לא ברור. מספר מחקרים הראו כי התגובה החיסונית ההורמונאלית difficile ג רעלים ממלאת תפקיד המחלה מצגת והתוצאה. באופן ספציפי, בחולים ללא תסמינים הצג של סרום מוגברת אנטי רעלן A אג ריכוז לעומת חולים שמפתחים מחלה סימפטומטי10. אגודה הניתנת דווח על חציון אנטי רעלן A אג titers ו- 30 יום כל סיבה תמותה11. מספר דיווחים גם חשפו אסוציאציה עם הגנה מפני הישנות של נוגדן התגובות טוקסין A, B ומספר אנטיגנים ללא רעלן (Cwp66, Cwp84, FliC, FliD, וחלבונים שכבת פני השטח (SLPs))12,13 , 14 , 15. תצפיות אלה דרבנה התפתחות הראשון חיסוני פסיבי סמים מיקוד difficile ג הרעלן B (bezlotuxumab), אשר לאחרונה אושרה על-ידי לנו האוכל ואת הניהול סמים התרופות האירופית סוכנות למניעת CDI חוזרים ונשנים16. אסטרטגיות חיסון באמצעות רעלים מומת או שברי רקומביננטי הרעלן נמצאים גם בשלבי פיתוח17,18,19. גישות טיפוליות חדשות אלה ללא ספק יגרה את הדרישה להערכת החיסון ההורמונאלית, התגובות אנטיגנים מרובים במדגמים גדולים.

היום, יש מחסור הבולטים של מבחני תפוקה גבוהה זמינים מסחרית מסוגל בו זמנית הערכת זן חיידקי, נוגדן ספציפי isotype התגובות difficile ג אנטיגנים. יש צורך לפתח מבחני כזה כדי להקל על מאמצי המחקר העתידי ויישומים קליניים. מיקרו-מערכים חלבון הם שיטה לשתק מספרים גדולים של חלבונים מטוהרים בנפרד כמערך במרחב מאורגנת של כתמים על גבי משטח מיקרוסקופי מבוסס שקופיות באמצעות מערכת רובוטית, אשר ניתן ללא מגע או קשר20 הדפסה כלי21. המקומות עשוי לייצג תערובות מורכבים כגון תא lysates, נוגדנים, רקמת homogenates, חלבונים אנדוגני או רקומביננטי או פפטידים, נוזלי גוף או סמים22,23.

טכנולוגיית microarray חלבון מציעה יתרונות ברורים על פני אליסה שבאתר סטנדרטי טכניקות, אשר באופן מסורתי שימש להערכת אנטי -ג difficile תגובות נוגדנים. אלה כוללים קיבולת מוגברת לגילוי מגוון של מולטי-isotype-ספציפי נוגדנים נגד פאנל נרחב יותר של חלבון מטרות, דרישות נפח מופחת אנטיגנים, דגימות של ריאגנטים, ויכולת משופרת כדי לשלב גדול יותר מספר משכפל טכני, בנוסף מספר פנימי בקרת איכות (QC) מודד1. מיקרו-מערכים ולכן הם יותר רגישים, מדויק, לשחזור, יש טווח דינמי גדול יותר. גורמים אלה הופכים מיקרו-מערכים חלופה זולה יותר מאהדה פוטנציאל ELISAs איתור בקנה מידה גדול של חלבונים הידועים. עם זאת, החסרונות של הטכנולוגיה microarray לנבוע בעיקר ההוצאות מראש גדולות הקשורות הקמת פאנל של אנטיגנים נקיים במיוחד והגדרת את הפלטפורמה הטכנולוגית.

מיקרו-מערכים חלבון היו בשימוש נרחב מעל שני עשורים ככלי אבחון ומחקר בסיסי יישומים קליניים. יישומים מסוימים כוללים ביטוי חלבון פרופיל, המחקר של קשרי סובסטרט, סמן ההקרנה, ניתוח של אינטראקציות מארח-חיידק, והגדרת פרופיל נוגדן ירידה לפרטים23,24, 25,26,27,28. הוקמו רבים חדשים הפתוגן חלבון/אנטיגן מיקרו-מערכים, כולל מלריה (הפלזמודיום)29, HIV-130, שפעת31, סארס (הסארס)32, לקדחת דימומית33 , herpesviruses34, ו שחפת35.

בפרוטוקול הנוכחי מתייחס להקמת קל ההפעלה ג difficile תגובתי microarray הנוגדנים, המאפשר כימות מדויק, מדויק, וספציפי של מולטי-isotype, זן ספציפי נוגדן התגובות ג difficile אנטיגנים סרה, polyclonal IVIg. במסמך זה, אנו כוללים נציג תוצאות הנוגעים ביצוע וזמינותו microarray מקובל כאשר לעומת אליסה וכן דיוק וזמינותו של הפארמצבטית פרופילים. זה וזמינותו ניתן לפתח עוד לעשות פרופיל הדגימות קליניים אחרים, קובע סטנדרט חדש למחקר לתוך הבסיס המולקולרי של CDI.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנת צלחת Microarray

  1. לדלל difficile ג אנטיגנים עם מאגר הדפסה [PBS-Tween-טרהלוז (50 מ מ)]-ריכוז אופטימלי (אשר היה מראש לפני הפעלת את החולה sera): טוקסין (200 µg/mL), הרעלן B (100 µg/mL), pCDTb (200 µg/mL), והאינדיאנים מטוהרים כל SLPs נגזר ribotypes 001, 002 ו- 027 (200 µg/mL).
    הערה: הרעלן B היה המתקבלים רעלן זן B-לבטא CCUG 20309 (90 µg/mL).
    1. לדלל את הפקדים חיובי, lysates אלביקנס ג, טטנוס טוקסואידי עם מאגר ההדפסה ב- 100 µg/mL. לבסוף, לדלל בנוגדנים האנושי מטוהרים תואמים את isotype שנבדקו נוגדנים באופן סדרתי, החל מ- µg 50/mL על פני 10 דילולים במאגר ההדפסה כדי ליצור עקומת כיול.
  2. העברת 10 µL של דילולים במאגר ההדפסה לתוך צלחת 384-. טוב.
  3. מכסים את הצלחת עם צלחת חותם, צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות.

2. הדפסת מערכים עם רובוט קשר

  1. חום הסיכה סיליקון באמצעות ה s מבער גז ידניים 3 x 2 כל ולשטוף ב מים נקיים 3 x 3 s.
  2. מניחים את הצלחת microarray לתוך המחסנית וטעינה של arrayer.
  3. מקם את השקופיות aminosilane על מגש שקופיות.
    הערה: המגש השקופית יכול להחזיק שקופיות 27: שלוש שורות של תשע שקופיות. השקופיות מסודרים בהתמצאות החל בצד שמאל של השורה התחתונה, שאר החללים מכוסים עם מגלשות ריק כדי להבטיח כי כל החורים על המגש שקופית מכוסים.
    1. לחץ על אישור , ודא ואקום הופעל על כל השקופיות מאובטחים. השאירו את השקופיות הסביבה ולח במשך לפחות שעה לפני תחילת ההדפסה.
      הערה: השקופיות aminosilane ניתנים נרתיק אטום עם סופג לחות. ברגע שנפתח, אחת מהשקופיות שאינם בשימוש יש להחזיר מיד desiccator לאחסון עד לתאריך התפוגה.
  4. להגדיר התכנית הדפסה מתאים להדפסה Clostridium difficile אנטיגנים. השקת חבילת היישומים TAS ופתח את הקובץ פרמטרים דרושים בניהול הדפסה מהספריה 'פועל Gridding שלי'. בחר קובץ Clostridium difficile להדפסת כל אנטיגנים Clostridium difficile ב ארבע פעמים.
  5. בעת לחיצה כפולה על הסמל MicroArray בחלון הראשי יופיע חלון שלוש כרטיסיות הנקרא 'MicroArraying 'פרמטרים'.  הכרטיסיות שלושה יהיו "המקור," "יעד", "אפשרויות". הכרטיסיה "מקור" מציג פרטים במספר הדגימות המשמשים את הצלחת microarray. הכרטיסיה "יעד" מציג את הפרטים של איך השקופיות הם ייטענו, שם המערך להיות מודפס על השקופית ו לערוך את פריסת שקופית (תבניות subarray 16). הכרטיסיה 'אפשרויות' מציג פרטים של פרוטוקול לשטוף ואת כלי להיות בשימוש למשל. לשטוף אחרי כל הדוגמה שהושלמו. לנקות את הסיכה סיליקון בין דוגמאות כדי למנוע כל זיהום צולב בין מדגמים שונים.
  6. אפשרויות תכנות ממוקמות תחת אפשרויות > העדפות הפעל בסרגל הכלים TAS דבש היישום. ישנם 9 כרטיסיות לעבוד דרך בסעיף זה, כפי שאתה כרטיסיה אחת מלאה מעבר לשני על ידי לחיצה על זה. לחיצה על "אישור" הלחצן ייקח אותך. "לרוץ"העדפות". בכרטיסיה "כללי" של "העדפות הפעלה", יש מספר תיבות סימון זמינים לפי סעיף זה הנוגעים איך תתנהג המכשיר בעת הפעלת תוכנית. סמן את התיבה "מרחץ ראש הממשלה לפני תחילת הפעלה", כל שטיפת שלוש תחנות יעבור רצף לקרקע קצרה שלפני תחילת הריצה. הסימון בתיבת "לכבס-תחילת הפעלה", הכלי pin יהיה שטף לפני המקור הראשון לבקר. "". רחיצת בסוף ריצה-תיבת הסימון יהיה שטף את הכלי pin אחרי המקור האחרון לבקר. המשתמש יכול להגדיר את מספר מחזורי השטיפה. בכרטיסיה "אקלים" של "העדפות הפעלה", להתחיל את לחות. ההגדרה אנו משתמשים הינם כדלקמן: להתחיל בשיעור 55%, לרוץ בשיעור 55%, לחות מינימלית 55%, היעד לחות 60%. לא להתחיל לרוץ עד הלחות המטרה הושגה, אחרת הנקודות יהיה בגודל שגוי, הספרייה יתפוגג במהירות.
  7. תפריט בר של המשימה, לחץ על הכפתור הירוק ללכת.  התחל ההפעלה ולצפות מעת לעת arrayer במהלך ההדפסה כדי להיות בטוח הכל. זה בסדר.
    הערה: פעולה זו מאפשרת הניתוח של 15 דוגמאות במקביל בכל שקופית כפי subarray אחד משמש פקד שלילי. העיצוב של subarrays נקבעת על ידי מספר החלבונים מודפס (אנטיגנים) ומשוכפלת מספר הביולוגי המודפס.
    הערה: לאחר הדפסת כל דגימה, הראש היא נעה המרחצאות כביסה כדי לאפשר טובלים מרובים של ה-pin לתוך שתי אמבטיות שטיפה המכיל מים מזוקקים ו 0.002% 20 Tween עבור 1.5 s בבית כל אמבט, ולאחריה שטיפה את ה-pin עם מים אולטרא טהורים וייבוש הפין תחנת רחיצת הראשי עבור 4 s.

3. אחסון של המערכים

  1. לשמור בשקופיות המודפסות המאוחסנים ללילה בטמפרטורת החדר desiccator.
    הערה: בשקופיות המודפסות ניתן לאחסן עד לשבוע אחד.

4. מערך הבדיקה

  1. בזהירות המקום בשקופיות המודפסות בעל שקופית פורמט 16 צ'יימברס רב טוב.
    הערה: צ'מברס, נתקל לעומק של 7.5 מ מ, לספק משטח נדיב נפח יחס כדי להקל על ערבוב ושטיפת צעדים.
  2. לאפשר ריאגנטים כל לחמם לטמפרטורת החדר לפני השימוש. אלא אם צוין אחרת, בצע את כל השלבים הבאים בטמפרטורת החדר.
  3. להוסיף 100 µL של tween אלבומין שור 5% מסוננת (BSAT; שימוש במסנן מזרק 0.2 µm) כל בלוק, לכסות את השקופיות של דגירה אותם ברעידות לשעה.
  4. לשטוף את השקופיות 5 x 1 דקות כל ב 120 µL של פוספט buffered מלוחים עם Tween 20 (PBST; 0.1% Tween) לכל טוב ברעידות. אל תתנו את השקופיות להתייבש.
  5. להפשיר את הדוגמאות סרום על קרח למשך 20 דקות ו לדלל כל דגימה עם נוגדנים זמינים מסחרית diluent עם רקע צמצום רכיב (ראה טבלה של חומרים).
    1. למטב את הדילול של הדוגמאות סרום לפי בנוגדנים שנבדקו כפי שמוצג בטבלה מס ' 2.
  6. להעביר µL 100 של הדוגמאות סרום מדולל כל הבלוקים חוץ מאחד, אשר ישמש בתור פקד שלילי; עד לגוש הבניינים הזה, להוסיף 100 µL של נוגדן diluent בלבד. דגירה של השקופיות עם עצבנות עדין לשעה.
  7. לשטוף את השקופיות 5 x 3 דקות כל אחד ב- 120 µL של PBST (0.1% Tween) לכל טוב ברעידות.
  8. להוסיף 100 µL של עז biotinylated נוגדנים נגד מדולל עם נוגדנים diluent.
    1. למטב את הדילול של הנוגדן משני לפי בנוגדנים שנבדקו כפי שמתואר בטבלה 2. מכסה את השקופיות, דגירה אותם עם טלטול עדין לשעה.
  9. לשטוף את השקופיות 5 x 3 דקות כל אחד ב- 120 µL של PBST לכל טוב ברעידות.
  10. להוסיף 100 µL של streptavidin Cy5 כל בלוק מדולל ב 1:2000 ב 5% BSA. מכסים את השקופיות בנייר כסף כדי להגן עליהם מפני אור בזמן טלטול למשך 15 דקות עם עצבנות עדין.
  11. לשטוף את השקופיות 5 x 1 דקות כל 120 µL של PBST לכל באר עם טלטולים, ואחריו שוטף 2 של 1 דקה לכל ב- PBS רק ברעידות.
  12. לסובב את השקופיות למשך 5 דקות ב g x 300 כדי לייבש אותם.
  13. לשמור את השקופיות בתיבה כהה עבור הובלה ואחסון בטמפרטורת החדר.
  14. המשך לסרוק את מערכי מיד כדי להבטיח עקביות אות לאחר הבדיקה.
    הערה: אולם, שקופיות הנייר יכולים להיות מאוחסנים בחושך, שנסרקו בתוך שבוע אחד מן הבדיקה.

5. סריקה של מערכים

  1. הפעל את הסורק לייזר (ראה טבלה של חומרים) 30 דקות לפני סריקה כדי לחמם את הלייזר. להעלות את תוכנת הסורק וחבר את המחשב הסורק.
  2. במקום שקופית עם הפנים כשהצד המודפס למעלה לתוך הסורק עד האור המחזה הופך ירוק קבוע.
  3. לחץ על לחצן הגדרות ולהתאים את ההגדרות הבאות בעת סריקת השקופיות כדלקמן: מצב סריקה, חציון; הרכישה, 635 בלבד; רכישת מצב, ידני; רווח, 20; כוח, נמוך; סוג שקופיות, השקופיות ללא תווית; פוקוס, פוקוס אוטומטי. כבה הגלילה האוטומטית והגדר קריאת ברקוד 10 גודל פיקסל ו- 35 לסרוק.
  4. שמור התמונות תוצאות 16-bit סולם גוני אפור מרובים תמונה בפורמט TIFF. לחץ על לחצן ייבוא הרשת ובחר את רשימת המערך המתאים.
    הערה: הרשימה מערך מתארת את גודל ואת המיקום של subarrays ואת השמות של חומרים מודפסים המשויכים כל תכונה-מחוון.
    1. ליישר את הרשת לנקודות בשקופית.
  5. לנתח את התמונות על ידי לחיצה על לחצן כימות תהליך למדידת עוצמות קרינה פלואורסצנטית אות בכל מקום ולשמור את התוצאות בתבנית טקסט שנקרא GenePix תוצאות (הרדאר חודר הקרקע).
    הערה: הקובץ הרדאר חודר הקרקע מכיל את המשתנים לוקליזציה וזיהוי של המטרות אנטיגן על המערך, גם עוצמת קרינה פלואורסצנטית החציוני ואת הרקע המקומי המייצג את האיגוד נוגדן לסמן ערכים של כל מקום.

6. ניתוח נתונים

  1. חישוב החציון של משכפל של כל אנטיגן לאחר חיסור רקע באמצעות ניתוח microarray חינם תוכנה בשם שלב הפוכה חלבון מערך (RPPA) מנתח, מודול בתוך השפה סטטיסטי R על חמוציות36.
  2. התווה את עקומת סטנדרטי, אינטרפולציה את האותות של כל אנטיגן ביחס העקומה אימונוגלובולין סטנדרטי באמצעות יצירת גרפים מדעי מסחרי ותוכנות סטטיסטיקה (ראה טבלה של חומרים) כדי לחשב את רמות נוגדנים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

איור 1 מדגימה תרשים זרימה המתאר את השלבים העיקריים הפרוטוקול המתואר. איור 2 מציג את בדיקות מתאם ספירמן הוכחת משמעותי הסכם בין microarray אליסה IgG ו איגה אנטי רעלן A ו- B רמות בסרה מבחן החולה. איור 3 מראה דיפרנציאלית IgG ואיגה נוגדן-clas...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ב פרוטוקול זה, אנחנו הראו ש-microarray הזה הוא פלטפורמה מתאימה להגדרת ההורמונאלית תגובות מערכת החיסון כדי difficile ג חלבונים אנטיגניים החולה סרה (דמויות 3 ו- 6), תכשירים מסחריים של IVIg (איור 5). גם הראו כי הטכניקה microarray מבצע טוב בהשוואה לאליסה קונבנציונאלי (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

. לא-

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מלגת הרמס אל אולה Negm, טניה מונאהן, דרך נפרד במימון המרכז למחלות עיכול נוטינגהאם ומרכז NIHR נוטינגהאם עיכול מחלות ביו מחקר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BioRobotics MicroGrid II arrayerDigilab, Malborough, MA, USAN/AContact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides.
Scanner InnoScan 710.InnopsysN/AA fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction.
MAPIX software version 7.2.0InnopsysN/AMeasure signal intensities of the spots.
Silicon contact pinParallel Synthesis TechnologiesSMT-P75Print the samples onto the slides.
Thermo Scientific Nalgene DesiccatorThermo Scientific41102426To store the new and printed slides.
384-well plateGenetixX7022UNTo prepare the antigens.
Plate coverSigma Aldrich, UKCLS6570-100EATo reduce evaporation of the samples.
Aminosilane slidesSchott,  Germany1064875The slide of choice for printing the antigens.
Slide holdersGraceBio Labs, USA204862Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells . 
Candida albicans lysateNIBSCPR-BA117-SPositive control
Tetanus Toxoid Athens Research and Technology04/150Positive control
Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma Athens research and  technology  16-16-090707Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma. 
Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma Athens research and  technology  16-16-090707-1Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma. 
Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma Athens research and  technology  16-16-090707-2Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma. 
Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma Athens research and  technology  16-16-090707-3Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma. 
Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma Athens research and  technology  16-16-090707-4Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma. 
Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma Athens research and  technology  16-16-090701Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma.
Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma Athens research and  technology  16-16-090701-1MPurified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma.
Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma Athens research and  technology  16-16-090701-2MPurified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma.
Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma Athens research and  technology  16-16-090713Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma.
Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specificVector LabsBA-3080Goat anti- human IgG (γ-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOTSouthern Biotec9052-08 Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOTSouthern Biotec9060-08  Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOTSouthern Biotec9210-08   Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG4 pFc'-BIOTSouthern Biotec9190-08  Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat - BiotinylatedVector LabsBA-3030Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA1-BIOTSouthern Biotec9130-08Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA2-BIOTSouthern Biotec9140-08  Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgM-BIOTSouthern Biotec9020-08 Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
0.2 mm syringe filterThermo scientific723-2520Filter the 5% BSA.
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma Aldrich, UKA7284Use 5% BSA for blocking the slides.
Antibody diluentDako, UKS3022To dilute the serum and the secondary antibody.
Streptavidin Cy5eBioscienceSA1011Detection of the immune reaction.
Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087)Toxins Group, Public Health EnglandNA
Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain)Toxins Group, Public Health EnglandNA
Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTbUniversity of Bath NAProduced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70)
Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteinsDublin City University NA
Vigam (IVIg preparation 1)Nottingham University Hospitals NHS TrustN/A
Privigen (IVIg preparation 2)Nottingham University Hospitals NHS TrustN/A
Intratect (IVIg preparation 3)Nottingham University Hospitals NHS TrustN/A

References

  1. Negm, O. H., et al. Profiling humoral immune responses to Clostridium difficile.-specific antigens by protein microarray analysis. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (9), 1033-1039 (2015).
  2. Monaghan, T. M., et al. High prevalence of subclass-specific binding and neutralizing antibodies against Clostridium difficile. toxins in adult cystic fibrosis sera: possible mode of immunoprotection against symptomatic C. difficile infection. Clinical and Experimental Gastroenterology. 10, 169-175 (2017).
  3. Negm, O. H., et al. Protective antibodies against Clostridium difficile. are present in intravenous immunoglobulin and are retained in humans following its administration. Clinical & Experimental Immunology. 188 (3), 437-443 (2017).
  4. Monaghan, T., et al. OC-058 A protein microarray assay for predicting severe outcomes in Clostridium difficile infection. Gut. 66, Suppl. 2 31(2017).
  5. Bacon, A. E. Immunoglobulin G directed against toxins A and B of Clostridium difficile in the general population and patients with antibiotic-associated diarrhea. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 18 (4), 205-209 (1994).
  6. Viscidi, R., et al. Serum antibody response to toxins A and B of Clostridium difficile. The Journal of Infectious Diseases. 148 (1), 93-100 (1983).
  7. Salcedo, J., et al. Intravenous immunoglobulin therapy for severe Clostridium difficile colitis. Gut. 41 (3), 366-370 (1997).
  8. Abougergi, M. S., Kwon, J. H. Intravenous immunoglobulin for the treatment of Clostridium difficile infection: a review. Digestive Diseases and Sciences. 56 (1), 19-26 (2011).
  9. Shah, N., Shaaban, H., Spira, R., Slim, J., Boghossian, J. Intravenous immunoglobulin in the treatment of severe Clostridium difficile colitis. Journal of Global Infectious Diseases. 6 (2), 82-85 (2014).
  10. Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. Asymptomatic carriage of Clostridium difficile and serum levels of IgG antibody against toxin A. The New England Journal of Medicine. 342 (6), 390-397 (2000).
  11. Solomon, K., et al. Mortality in patients with Clostridium difficile infection correlates with host pro-inflammatory and humoral immune responses. Journal of Medical Microbiology. 62, Pt 9 1453-1460 (2013).
  12. Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. Association between antibody response to toxin A and protection against recurrent Clostridium difficile diarrhoea. Lancet. 357 (9251), 189-193 (2001).
  13. Leav, B. A., et al. Serum anti-toxin B antibody correlates with protection from recurrent Clostridium difficile infection (CDI). Vaccine. 28 (4), 965-969 (2010).
  14. Drudy, D., et al. Human antibody response to surface layer proteins in Clostridium difficile infection. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 41 (3), 237-242 (2004).
  15. Bauer, M. P., Nibbering, P. H., Poxton, I. R., Kuijper, E. J., van Dissel, J. T. Humoral immune response as predictor of recurrence in Clostridium difficile infection. Clinical Microbiology and Infection. 20 (12), 1323-1328 (2014).
  16. Wilcox, M. H., et al. Bezlotoxumab for prevention of recurrent Clostridium difficile infection. The New England Journal of Medicine. 376 (4), 305-317 (2017).
  17. Leuzzi, R., Adamo, R., Scarselli, M. Vaccines against Clostridium difficile. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 10 (6), 1466-1477 (2014).
  18. Ghose, C., Kelly, C. P. The prospect for vaccines to prevent Clostridium difficile infection. Infectious Disease Clinics of North America. 29 (1), 145-162 (2015).
  19. Henderson, M., Bragg, A., Fahim, G., Shah, M., Hermes-DeSantis, E. R. A review of the safety and efficacy of vaccines as prophylaxis for Clostridium difficile infections. Vaccines. 5 (3), Basel. (2017).
  20. Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).
  21. Delehanty, J. B., Ligler, F. S. Method for printing functional protein microarrays. BioTechniques. 34 (2), 380-385 (2003).
  22. Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 27 (Unit 27) 21(2013).
  23. Huang, Y., Zhu, H. Protein array-based approaches for biomarker discovery in cancer. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 15 (2), 73-81 (2017).
  24. Vigil, A., Davies, D. H., Felgner, P. L. Defining the humoral immune response to infectious agents using high-density protein microarrays. Future Microbiology. 5 (2), 241-251 (2010).
  25. Bacarese-Hamilton, T., Mezzasoma, L., Ardizzoni, A., Bistoni, F., Crisanti, A. Serodiagnosis of infectious diseases with antigen microarrays. Journal of Applied Microbiology. 96 (1), 10-17 (2004).
  26. Davies, D. H., et al. Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (3), 547-552 (2005).
  27. Wadia, P. P., Sahaf, B., Miklos, D. B. Recombinant antigen microarrays for serum/plasma antibody detection. Methods in Molecular Biology. 723, 81-104 (2011).
  28. Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. Applications in high-content functional protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 30, 21-27 (2016).
  29. Crompton, P. D., et al. A prospective analysis of the Ab response to Plasmodium falciparum before and after a malaria season by protein microarray. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6958-6963 (2010).
  30. Khodakov, D. A., et al. An oligonucleotide microarray for multiplex real-time PCR identification of HIV-1, HBV, and HCV. BioTechniques. 44 (2), 241-246 (2008).
  31. Ryabinin, V. A., et al. Universal oligonucleotide microarray for sub-typing of Influenza A virus. PLoS One. 6 (4), 17529(2011).
  32. Zhu, H., et al. Severe acute respiratory syndrome diagnostics using a coronavirus protein microarray. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4011-4016 (2006).
  33. Cleton, N. B., et al. Spot the difference: development of a syndrome based protein microarray for specific serological detection of multiple flavivirus infections in travelers. PloS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003580(2015).
  34. Liu, Y., Yu, F., Huang, H., Han, J. Development of recombinant antigen array for simultaneous detection of viral antibodies. PLoS One. 8 (9), 73842(2013).
  35. Zhou, F., et al. Protein array identification of protein markers for serodiagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection. Scientific Reports. 5, 15349(2015).
  36. Mannsperger, H. A., Gade, S., Henjes, F., Beissbarth, T., Korf, U. RPPanalyzer: analysis of reverse-phase protein array data. Bioinformatics. 26 (17), 2202-2203 (2010).
  37. Monaghan, T. M., et al. Circulating antibody and memory B-cell responses to C. difficile-associated diarrhoea, inflammatory bowel disease and cystic fibrosis. PLoS One. 8 (9), 74452(2013).
  38. Grainger, D. W., Greef, C. H., Gong, P., Lochhead, M. J. Current microarray surface chemistries. Methods in Molecular Biology. 381, 37-75 (2007).
  39. Wellhausen, R., Seitz, H. Facing current quantification challenges in protein microarrays. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, article ID 831347 (2012).
  40. Guo, A., Zhu, X. -Y. The critical role of surface chemistry in protein microarrays. Functional Protein Microarrays in Drug Discovery. , CRC Press. Boca Raton. (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

136microarrayClostridium difficile

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved