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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo articolo viene descritto un metodo di microarray della proteina semplice per profilatura risposte immunitarie umorali a un panel 7-plex di altamente purificata antigeni di Clostridium difficile in sieri umani. Il protocollo può essere esteso per la determinazione della risposta di anticorpo specifico nelle preparazioni a base di immunoglobuline policlonali.

Abstract

Forniamo una panoramica dettagliata di un'analisi di microarray di romanzo della proteina ad alta produttività per la determinazione di anti -Clostridium difficile livelli di anticorpi nel siero umano e in preparazioni separate di policlonale dell'immunoglobulina endovenosa (IVIg). Il protocollo descrive i passaggi metodologici coinvolti nella preparazione del campione, stampa delle matrici, procedura di dosaggio e analisi dei dati. Inoltre, questo protocollo potrebbe essere ulteriormente sviluppato per incorporare diversi campioni clinici tra cui plasma e surnatanti di cella. Vi mostriamo come microarray della proteina può essere utilizzato per determinare una combinazione di isotipo (IgG, IgA, IgM), sottoclasse (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2) e ceppo-specifici anticorpi altamente purificato tutta c. difficile tossine A e B (toxinotype 0, ceppo VPI 10463, ribotipo 087), la tossina B da un c. difficile tossina B-sola espressione ceppo (CCUG 20309), una forma di precursore di un frammento di B della tossina binaria, pCDTb, proteine di tutta la superficie strato ribotipo-specifico (SLPs; 001, 002, 027) e proteine (tetano di controllo tossoide tetanico e Candida albicans). Durante l'esperimento, microarrays sono sondati con i sieri da individui con l'infezione di c. difficile (CDI), gli individui con fibrosi cistica (CF) senza diarrea, controlli sani (HC) e da individui pre- e post-IVIg terapia per la trattamento di CDI, immunodeficienza combinata disordine e Poliradicolite demielinizzante infiammatoria cronica. Incontriamo differenze significative nei livelli di anticorpo specifico multi-isotipo di efficacies di neutralizzazione della tossina e tra gruppi di pazienti, preparazioni commerciali di IVIg e la sera prima e dopo somministrazione di IVIg. Inoltre, c'è una correlazione significativa tra microarray e analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) per i livelli di IgG antitossina in campioni di siero. Questi risultati indicano che microarray potrebbe diventare uno strumento promettente per profilatura risposte anticorpali agli antigeni di C.difficile in esseri umani infettati o vaccinati. Con ulteriore affinamento dei pannelli di antigene e una riduzione dei costi di produzione, possiamo anticipare che la tecnologia microarray può aiutare ottimizzare e selezionare i più clinicamente utile immunoterapie per infezione da c. difficile in modo specifico per ogni paziente.

Introduzione

Questo protocollo descrive lo sviluppo e la convalida di un'analisi di microarray della proteina di romanzo e su misura per il rilevamento e semi-quantificazione del ceppo batterico e le risposte specifiche dell'isotipo dell'anticorpo agli antigeni di c. difficile . Utilizziamo con successo la nostra difficile del c.-analisi di microarray specifici come un promettente nuovo strumento per la bioanalysis compositiva del contenuto di anticorpi specifici nei sieri dei pazienti1,2, preparazioni di IVIg3, e identificazione delle specificità dell'anticorpo che correlano con i risultati difficili in CDI4. Dimostriamo come campioni di siero biobanked e preparazioni commerciali di IVIg possono essere analizzate su diapositive di microarray, che permette alta qualità riproducibile profilatura delle risposte di agente patogeno specifico anticorpo di c. difficile in questo test.

Molti bambini sani e adulti hanno anticorpi IgG e IgA siero rilevabile c. difficile tossine A e B5,6. Questi sono pensati per risultare a seguito di esposizione transitoria durante l'infanzia e dopo esposizione a c. difficile in età adulta. Per questo motivo, policlonali IVIg è stato utilizzato off-label per il trattamento sia ricorrente e fulminante CDI7,8,9. Tuttavia, il suo ruolo definitivo e modalità di azione rimane poco chiaro. Parecchi studi hanno indicato che la risposta immunitaria umorale alle tossine di c. difficile svolge un ruolo nella presentazione della malattia e nel risultato. In particolare, i pazienti asintomatici mostrano una concentrazione aumentata del siero anti-tossina A IgG rispetto ai pazienti che sviluppano la malattia sintomatica10. Un'associazione dimostrabile è stata segnalata per i titoli di IgG A di mediano anti-tossina e mortalità per qualsiasi causa 30 giorni11. Parecchi rapporti hanno rivelato anche un'associazione con una protezione contro le risposte di ricorrenza e l'anticorpo per la tossina A, B e diversi antigeni non-tossina (Cwp66, Cwp84, FliC, FliD e proteine di strato di superficie (SLP))12,13 , 14 , 15. queste osservazioni hanno stimolato lo sviluppo del primo immunoterapia passiva drug targeting c. difficile tossina B (bezlotuxumab), che è stato recentemente approvato dalla US Food and Drug Administration e l'Agenzia europea dei Agenzia per la prevenzione di ricorrenti CDI16. Strategie vaccinali utilizzando le tossine inattivate o frammenti di tossina ricombinante sono inoltre attualmente in sviluppo17,18,19. Questi nuovi approcci terapeutici senza dubbio stimolerà il requisito per valutare le risposte immunitarie umorali agli antigeni multipli in campioni di grandi dimensioni.

Oggi, c'è una notevole mancanza di saggi ad alta velocità disponibile in commercio in grado di valutare contemporaneamente il ceppo batterico e le risposte specifiche dell'isotipo dell'anticorpo agli antigeni di c. difficile . C'è un bisogno insoddisfatto per sviluppare tali dosaggi per facilitare gli sforzi di ricerca futura e applicazioni cliniche. Microarrays della proteina sono un metodo per immobilizzare un numero elevato di proteine purificate individualmente come matrice spazialmente organizzata dei punti su una superficie basata su vetrino al microscopio utilizzando un sistema robotico, che può essere un contatto20 o un non-contatto stampa strumento21. Le macchie possono rappresentare miscele complesse come lisati cellulari, anticorpi, omogenati, proteine endogene o ricombinante o peptidi, fluidi corporei o farmaci22,23.

Tecnologia di microarray della proteina offre chiari vantaggi rispetto a standard in-House ELISA tecniche, che sono stati tradizionalmente usati per valutare le risposte di anticorpi di anti -c. difficile . Questi includono una maggiore capacità per la rilevazione di una gamma di multi-specifici anticorpi contro un pannello più ampio di bersagli proteici, requisiti di volume ridotto per gli antigeni, campioni e reagenti e una maggiore capacità di incorporare una più grande numero di repliche tecniche, oltre a controllo di qualità interno multiple (QC) misura1. I microarrays sono quindi più sensibile, accurato e riproducibile e hanno una maggiore gamma dinamica. Questi fattori rendono i microarrays un'alternativa più conveniente e potenzialmente favorevole a Elisa per la rilevazione su larga scala di proteine note. Tuttavia, gli svantaggi della tecnologia microarray dovuti principalmente i grandi costi iniziali associati che istituisce un pannello di antigeni altamente purificati e la creazione della piattaforma tecnologica.

Microarrays della proteina sono stati ampiamente utilizzati negli ultimi due decenni come strumento di ricerca diagnostica di base in applicazioni cliniche. Applicazioni specifiche includono l'espressione della proteina di profilatura, lo studio delle relazioni di enzima-substrato, lo screening biomarcatore, analisi delle interazioni ospite-microbo e profilatura anticorpo specificità23,24, 25,26,27,28. Molti nuovo agente patogeno/antigene della proteina microarrays sono stati stabiliti, tra cui la malaria (Plasmodium)29, HIV-130, riossidazione31, sindrome respiratoria acuta grave (SARS)32, febbre emorragica virale33 , herpesvirus34e35di tubercolosi.

Il presente protocollo si riferisce all'istituzione di un facile funzionamento C. difficile reattiva dosaggio dell'antigene microarray, che consente la quantificazione precisa e specifica di multi-isotipo e le risposte dell'anticorpo specifico ceppo di C. difficile antigeni nel siero e policlonale IVIg. Nel presente documento, includiamo risultati rappresentativi relativi ad una prestazione di analisi di microarray di accettabile rispetto a ELISA così come dosaggio precisione e riproducibilità profili. Questo test potrebbe essere ulteriormente sviluppato per profilare altri campioni clinici e stabilisce un nuovo standard per la ricerca della base molecolare della CDI.

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Protocollo

1. preparazione di un piatto di Microarray

  1. Diluire gli antigeni di c. difficile con un buffer di stampa [PBS-Tween-trealosio (50mm)] alla concentrazione ottima (che è stata predefinita prima di eseguire i sieri dei pazienti): tossina A (200 µ g/mL) e tossina B (100 µ g/mL), pCDTb (200 µ g/mL) e nativo purificato SLPs tutta derivata da ribotypes 001, 002 e 027 (200 µ g/mL).
    Nota: La tossina B è stata ottenuta da una tossina B-esprimendo ceppo CCUG 20309 (90 µ g/mL).
    1. Diluire i controlli positivi, lisati di albicans del c.e tossoide tetanico con il buffer di stampa a 100 µ g/mL. Infine, diluire l'immunoglobulina umana purificata matching l'isotipo dell'anticorpo testati in serie, a partire da 50 µ g/mL in tutto 10 diluizioni nel buffer di stampa per creare una curva di calibrazione.
  2. Trasferire 10 µ l delle diluizioni nel buffer di stampa in una piastra 384 pozzetti.
  3. Coprire la piastra con un sigillo di piastra e centrifugare a 300 x g per 5 min.

2. stampa matrici con un Robot contatto

  1. Calore il perno di silicio con il bruciatore a gas portatile 3 x 2 s ogni e sciacquare in acqua pulita 3x3 s ciascuno.
  2. Posizionare la piastra di microarray nella cartuccia caricamento della arrayer.
  3. Porre i vetrini inibitori sulla barra di scorrimento.
    Nota: Il vassoio di diapositiva può contenere 27 diapositive: tre righe di nove diapositive. Le diapositive sono disposte in verticale a partire dal lato sinistro della riga inferiore e il resto degli spazi sono coperti con diapositive vuote per garantire che tutti i fori sul vassoio scorrevole sono coperti.
    1. Premere OK e verificare che un vuoto è stato acceso e tutte le diapositive sono sicure. Lasciare le diapositive in ambiente umido per almeno 1 h prima di iniziare la stampa.
      Nota: Le diapositive di inibitori sono disponibili in una confezione sigillata con essiccante. Una volta aperto, tutte le diapositive non utilizzate devono essere restituite immediatamente nell'essiccatore per deposito fino alla data di scadenza.
  4. Impostare il programma di stampa adatto per stampare gli antigeni di Clostridium difficile . Lanciare la Suite di applicazioni di TAS e aprire il file di parametri di esecuzione stampa richiesti dalla directory 'My Gridding corre'. Selezionare file di Clostridium difficile per la stampa di tutti gli antigeni di Clostridium difficile in quadruplice copia.
  5. Al momento facendo doppio clic sull'icona di MicroArray nella finestra principale verrà visualizzata una finestra di tre-a schede chiamato 'MicroArraying parametri'.  Le tre schede sono "Fonte", "Target" e "Opzioni". La scheda "Origine" Mostra dettagli il numero di campioni utilizzati nella piastra di microarray. La scheda di "Target" Mostra i dettagli di come le diapositive devono essere caricati, dove la matrice deve essere stampato sulla diapositiva e modificare il layout della diapositiva (16 sottomatrice formati). La scheda "Opzioni" Mostra dettagli del protocollo di lavaggio e strumento per essere usato per esempio. lavare dopo ogni campione completato. Pulire il perno di silicio tra campioni per evitare qualsiasi contaminazione incrociata tra diversi campioni.
  6. Le opzioni di programmazione si trovano in Opzioni > Preferenze eseguire sulla barra TAS Application Suite. Ci sono 9 schede di lavorare attraverso in questa sezione e come si completa una scheda spostarsi al successivo facendo clic su di esso. Cliccando il pulsante "OK" vi porterà fuori "Esegui preferenze". Nella scheda "Generale" delle preferenze"Run", ci sono un numero di caselle di controllo disponibili in questa sezione relativa a come lo strumento si comporterà quando un programma viene avviato. Selezionare la casella di "Bagno primo prima di inizio di esecuzione", tutte le stazioni di lavaggio tre subirà una sequenza breve innesco prima dell'inizio di esecuzione. Seleziona la casella "Lavare a inizio di esecuzione", lo strumento perno sarà lavato prima di visitare la prima fonte. Spunta la casella "Wash al termine della corsa", lo strumento perno sarà lavato dopo l'origine Ultima visita. L'utente può impostare il numero di cicli di lavaggio. Nella scheda "Clima" delle preferenze"Run", avviare l'umidificazione. L'impostazione che usiamo sono come segue: avviare tasso 55%, eseguire tasso 55%, umidità minima 55%, destinazione umidità 60%. Non avviare l'esecuzione fino a quando viene raggiunta l'umidità di destinazione, altrimenti le macchie saranno la taglia sbagliata e la libreria evaporano rapidamente.
  7. Nella barra menu di TAS, fare clic sul pulsante verde vanno.  Avviare l'esecuzione e osservare periodicamente arrayer durante la tiratura per essere certi che tutto è OK.
    Nota: In questo modo l'analisi di 15 campioni in parallelo su ogni diapositiva come una sottomatrice viene utilizzato come controllo negativo. Il design delle sottomatrici è determinato dal numero delle proteine stampate (antigeni) e il numero del biologico stampato replica.
    Nota: Dopo la stampa di ogni campione, la testa si muove verso le vasche di lavaggio per consentire più immersione del perno in due vasche di lavaggio contenente acqua distillata e 0,002% Tween 20 per 1.5 s in ogni bagno, seguita da risciacquo il perno con acqua ultra-pura e asciugatura il pin in la stazione di lavaggio principale per 4 s.

3. stoccaggio delle matrici

  1. Mantenere le diapositive stampate immagazzinate durante la notte a temperatura ambiente in un essiccatore.
    Nota: Le diapositive stampate possono essere memorizzate fino a una settimana.

4. matrice di sondaggio

  1. Posizionare delicatamente diapositive stampate in un supporto per diapositive di formato di 16 camere multi-pozzetto.
    Nota: Le camere, con una profondità di circa 7,5 mm, forniscono una generosa superficie in rapporto al volume per facilitare la miscelazione e fasi di lavaggio.
  2. Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente prima dell'uso. Se non specificato diversamente, eseguire le seguenti operazioni a temperatura ambiente.
  3. Aggiungere 100 µ l di filtrato interpolazione di 5% di albumina di siero bovino (BSAT; uso una siringa filtro 0,2 µm) per ogni blocco, coprire le diapositive e li incubare con agitazione per 1 h.
  4. Lavare i vetrini 5 x 1 min ciascuno in 120 µ l di tampone fosfato salino con Tween 20 (PBST; 0,1% Tween) per pozzetto con agitazione. Le diapositive non lasciare asciugare.
  5. Scongelare i campioni di siero in ghiaccio per 20 minuti e diluire ogni campione con un anticorpo commercialmente disponibile diluente con sfondo riducendo la componente (Vedi Tabella materiali).
    1. Ottimizzare la diluizione dei campioni secondo la testata dell'immunoglobulina del siero come mostrato nella tabella 2.
  6. Trasferire 100 µ l dei campioni siero diluito a tutti i blocchi tranne uno, che sarà utilizzato come controllo negativo; a questo blocco, aggiungere 100 µ l di anticorpo diluente solo. Incubare i vetrini con delicata agitazione per 1 h.
  7. Lavare i vetrini 5 x 3 min ciascuno in 120 µ l di PBST (0.1% Tween) per pozzetto con agitazione.
  8. Aggiungere 100 µ l di un anticorpo anti-umano di biotinylated capra diluito con diluente dell'anticorpo.
    1. Ottimizzare la diluizione dell'anticorpo secondario secondo l'immunoglobulina testato come descritto nella tabella 2. Coprire i vetrini e li incubare con agitazione delicata per 1 h.
  9. Lavare i vetrini 5 x 3 min ogni 120 µ l di PBST con agitazione.
  10. Aggiungere 100 µ l di streptavidina Cy5 a ogni blocco diluito a 1: 2000 in 5% BSA. Coprire i vetrini con un foglio per proteggerli dalla luce mentre agitando per 15 minuti con agitazione delicata.
  11. Lavare i vetrini 5 x 1 min ciascuno in 120 µ l di PBST per pozzetto con agitazione, seguita da 2 lavaggi di 1min ogni in PBS solo con agitazione.
  12. Girare le diapositive per 5 min a 300 x g per asciugarle.
  13. Tenere i vetrini in una scatola scuro per trasporto e stoccaggio a temperatura ambiente.
  14. Procedere alla scansione delle matrici immediatamente per garantire la coerenza del segnale dopo il sondaggio.
    Nota: Tuttavia, sondati diapositive possono essere conservati al buio e analizzati entro una settimana dal sondaggio.

5. scansione delle matrici

  1. Accendere il laser scanner (Vedi Tabella materiali) 30 min prima della scansione per scaldare il laser. Caricare il software dello scanner e collegare il computer allo scanner.
  2. Inserire una diapositiva con il lato stampato verso l'alto nello scanner fino a quando la riproduzione della luce diventa verde fisso.
  3. Premere il pulsante Impostazioni e modificare le seguenti impostazioni durante la scansione le diapositive come segue: modalità di scansione, mediana; Acquisizione, 635 solo; Modalità di acquisizione, manuale; Guadagno, 20; Potenza, basso; Tipo di diapositiva, diapositiva senza etichetta; Messa a fuoco, messa a fuoco automatica. Disattivare lo scorrimento automatico e impostare Barcode Reading Pixel dimensioni 10 e 35 Scan.
  4. Salvare le immagini risultanti come 16-bit scala di grigi più il formato immagine TIFF. Premere il pulsante di Importazione griglia e selezionare l'elenco di matrice appropriata.
    Nota: L'elenco di matrice descrive le dimensioni e la posizione delle sottomatrici e i nomi delle sostanze stampate associate a ciascun indicatore di funzione.
    1. Allineare la griglia per le macchie sulla diapositiva.
  5. Analizzare le immagini premendo il pulsante di processo di quantificazione per misurare l'intensità del segnale di fluorescenza di ogni spot e salvare i risultati in un formato di testo chiamato GenePix risultati (GPR).
    Nota: Il file GPR contiene le variabili di localizzazione e identificazione degli obiettivi dell'antigene sulla matrice e anche l'intensità della fluorescenza mediano e lo sfondo locale che rappresenta l'associazione di anticorpo segnalare valori di ogni spot.

6. analisi dei dati

  1. Calcolare la mediana per le repliche di ogni antigene dopo la sottrazione di sfondo utilizzando un software di analisi di microarray gratuito chiamato analizzatore di fase inversa proteina matrice (RPPA), un modulo all'interno del linguaggio statistico R su CRAN36.
  2. Tracciare la curva standard e interpolare i segnali di ogni antigene rispetto alla curva standard di immunoglobulina utilizzo commerciale grafica scientifica e software di statistiche (Vedi Tabella materiali) per calcolare i livelli dell'anticorpo.

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Risultati

La figura 1 illustra un diagramma di flusso che descrive i passaggi principali del protocollo descritto. La figura 2 Mostra il test di correlazione di Spearman dimostrando significativo accordo tra microarray ed ELISA per IgG e IgA anti-tossina A e B livelli in sieri paziente. La figura 3 Mostra differenziale IgG e IgA anticorpi-classe risposte anticorpali specifici per la tossina A, B, binario tossi...

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Discussione

In questo protocollo, abbiamo dimostrato che microarray è una piattaforma adatta per definire le risposte immunitarie umorali agli antigeni della proteina c. difficile in sieri dei pazienti (figure 3 e 6) e preparazioni commerciali di IVIg (Figura 5). Abbiamo anche dimostrato che la tecnica di microarray esegue anche quando rispetto ai convenzionale ELISA (Figura 2) e Mostra eccellente riproducibilità, con variabilit?...

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Divulgazioni

Nessuno.

Riconoscimenti

Questa ricerca è stata sostenuta da una borsa di Hermes da Ola Negm e Tanya Monaghan e attraverso finanziamento separato dal centro di malattie Digestive di Nottingham e il NIHR Nottingham digestivi malattie Biomedical Research Centre.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
BioRobotics MicroGrid II arrayerDigilab, Malborough, MA, USAN/AContact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides.
Scanner InnoScan 710.InnopsysN/AA fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction.
MAPIX software version 7.2.0InnopsysN/AMeasure signal intensities of the spots.
Silicon contact pinParallel Synthesis TechnologiesSMT-P75Print the samples onto the slides.
Thermo Scientific Nalgene DesiccatorThermo Scientific41102426To store the new and printed slides.
384-well plateGenetixX7022UNTo prepare the antigens.
Plate coverSigma Aldrich, UKCLS6570-100EATo reduce evaporation of the samples.
Aminosilane slidesSchott,  Germany1064875The slide of choice for printing the antigens.
Slide holdersGraceBio Labs, USA204862Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells . 
Candida albicans lysateNIBSCPR-BA117-SPositive control
Tetanus Toxoid Athens Research and Technology04/150Positive control
Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma Athens research and  technology  16-16-090707Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma. 
Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma Athens research and  technology  16-16-090707-1Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma. 
Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma Athens research and  technology  16-16-090707-2Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma. 
Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma Athens research and  technology  16-16-090707-3Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma. 
Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma Athens research and  technology  16-16-090707-4Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma. 
Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma Athens research and  technology  16-16-090701Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma.
Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma Athens research and  technology  16-16-090701-1MPurified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma.
Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma Athens research and  technology  16-16-090701-2MPurified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma.
Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma Athens research and  technology  16-16-090713Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma.
Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specificVector LabsBA-3080Goat anti- human IgG (γ-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOTSouthern Biotec9052-08 Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOTSouthern Biotec9060-08  Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOTSouthern Biotec9210-08   Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG4 pFc'-BIOTSouthern Biotec9190-08  Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat - BiotinylatedVector LabsBA-3030Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA1-BIOTSouthern Biotec9130-08Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA2-BIOTSouthern Biotec9140-08  Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgM-BIOTSouthern Biotec9020-08 Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
0.2 mm syringe filterThermo scientific723-2520Filter the 5% BSA.
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma Aldrich, UKA7284Use 5% BSA for blocking the slides.
Antibody diluentDako, UKS3022To dilute the serum and the secondary antibody.
Streptavidin Cy5eBioscienceSA1011Detection of the immune reaction.
Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087)Toxins Group, Public Health EnglandNA
Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain)Toxins Group, Public Health EnglandNA
Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTbUniversity of Bath NAProduced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70)
Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteinsDublin City University NA
Vigam (IVIg preparation 1)Nottingham University Hospitals NHS TrustN/A
Privigen (IVIg preparation 2)Nottingham University Hospitals NHS TrustN/A
Intratect (IVIg preparation 3)Nottingham University Hospitals NHS TrustN/A

Riferimenti

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