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要約

この記事では、ひと血清中におけるクロストリジウム ・ ディフィシル抗原を精製の 7 プレックス パネルに対する体液性免疫応答の高プロファイルの単純なタンパク質マイクロ アレイ法について説明します。特定抗体ポリクローナル免疫グロブリン製剤の定量プロトコルを拡張することができます。

要約

クロストリジウム ・ ディフィシル抗体ポリクローナルの静脈内の免疫グロブリン (IVIg) の別の準備、ひと血清中で反による高スループット蛋白質マイクロ アレイ分析の詳細な概要をいたします。プロトコルでは、サンプル作製、印刷配列、試金プロシージャ、およびデータ分析の方法論的手順について説明します。さらに、このプロトコルは、プラズマを含む多様な臨床サンプルを取り込んで細胞培養上清にさらに開発できます。蛋白質のマイクロ アレイを使用して、アイソタイプ (IgG、IgA、IgM), サブクラス (IgG1、IgG2, IgG3, IgG4、IgA1、iga2 は) の組み合わせを決定する方法を示す、株特異抗体高純度全体c. ディフィシル毒素 A と B (toxinotype 0、ひずみ VPI10463、ribotype 087) 毒素 B、 c. ディフィシル毒素 B だけ表現するひずみ (CCUG 20309) から、バイナリ毒素、pCDTb、ribotype 全体の表層抗原 B フラグメントの前駆体フォーム (Slp; 001、002、027)、制御タンパク質 (破傷風、トキソイドとカンジダ)。血清c. ディフィシル感染症 (CDI)、健常者 (HC)、下痢症嚢胞性線維症 (CF) を持つ個人に個人個人の事前のポスト IVIg 療法からもプローブ、マイクロ アレイ実験中に、CDI、複合型免疫不全疾患、慢性炎症性脱髄性 polyradiculopathy の治療。我々 は、IVIg と前に血清の商業準備の患者グループと次の IVIg 投与間毒素の中和効果とマルチ アイソタイプ特異抗体レベル差が発生します。また、あるマイクロ アレイと酵素免疫測定法 (ELISA) 相関抗毒素 igg の血清中。そのマイクロ アレイがC.difficileワクチン接種や感染したヒトの抗原抗体反応をプロファイリングするための有望なツールになる可能性が示唆されました。さらに洗練された抗原パネルの生産コストの削減、最適化し、患者固有の方法でc. ディフィシル感染症の最も臨床的に有用な免疫療法を選択マイクロ アレイ技術が役立つことを期待しています。

概要

このプロトコルでは、開発、検出のための新規およびカスタマイズされたタンパク質マイクロ アレイ アッセイの検証と菌株のアイソタイプ特異抗体のc. ディフィシル抗原半定量をについて説明します。我々 は正常に私たちのdifficile C.を使用して-患者血清1、2IVIg3の準備で特異抗体コンテンツの組成の生化学分析のための有望な新しいツールとして特定のマイクロ アレイ分析とCDI4の転帰不良と相関する抗体の特異性の id。Difficile C.病原体特異抗体のこのアッセイでの質の高い再現性のあるプロファイリングできるように biobanked 血清と市販の IVIg をマイクロ アレイ スライドに分析する方法を紹介します。

多くの健康な子供および大人検出血清 IgG, IgA 抗体c. ディフィシル毒素 A と B5,6があります。これらは幼児期と成人期のdifficile C.への暴露を次時に一時的な露出の後で発生すると考えられています。このため、ポリクローナル IVIg がずっと再発と劇症 CDI7,8,9を治療するためにオフにラベルを使用します。しかし、その決定的な役割と作用は不明のまま。いくつかの研究は、 C. difficile毒素に体液性免疫反応が病気の発表や結果に役割を果たすことを示しています。具体的には、無症候性の患者は、増加血清抗毒素 A IgG 濃度10症候性疾患を発症した患者と比較して表示します。明白な協会中央抗毒素 A IgG 抗体と 30 日間全ての原因の死亡率11報告されています。いくつかのレポートはまた毒素 A、B、およびいくつかの非毒素抗原 (Cwp66、Cwp84、フリック、ありますと表層タンパク質 (Slp)) 再発・抗体反応に対する保護との関連を明らかにした12,13,14,15. これらの観察が誕生して最初受動免疫療法薬ターゲットc. ディフィシル毒素 B の (bezlotuxumab)、最近、米国食品医薬品局や欧州の医薬品が承認されています。再発の CDI16防災機関。不活化毒素または組換え毒素断片を使用して予防接種戦略もまた中開発17,18,19。これらの新しい治療上のアプローチは間違いなく大きいサンプルの大きさの複数の抗原に対する液性免疫応答を評価するための要件を刺激します。

今日、菌株、アイソタイプ特異抗体のc. ディフィシル抗原を同時に評価することができる市販の高スループット試金の著しい欠乏があります。今後の研究活動や臨床応用を容易にするためにこのようなアッセイを開発するニーズがあります。蛋白質のマイクロ アレイ、接触20または非接触にすることができますロボット システムを用いた顕微鏡スライド ベース表面にスポットの空間的組織化配列として個別に浄化された蛋白質の多数を固定する方法印刷ツール21。スポットのセル lysates、抗体、組織ホモジネート、内因性または組換え蛋白質やペプチド、体液薬22,23など複雑な混合物があります。

蛋白質のマイクロ アレイの技術では、標準的な社内の elisa 法にはなかった利点伝統的反difficile C.の抗体の応答を評価するために使用されている技術を提供しています。マルチ アイソタイプ特異抗体抗原、サンプル、および試薬の量を削減要件標的蛋白質のより広範なパネルの範囲を検出するために増加した能力が含まれますとより大きいを組み込むための強化された機能複数の内部品質管理 (QC) に加えて、技術的な複製の数は、1を測定します。マイクロ アレイは従ってより敏感、正確かつ再現性のある、大きなダイナミック レンジを持っています。これらの要因はマイクロ アレイに知られている蛋白質の大規模検出 Elisa に安く、潜在的に有利な代わりを作る。ただし、マイクロ アレイ技術の不利な点は高度精製抗原のパネルを確立し、技術的なプラットフォームの設定に関連付けられている大規模なアップ フロント コストから主に発生します。

蛋白質のマイクロ アレイは、臨床応用の診断および基本的な研究ツールとして過去 20 年間で広く使用されています。特定のアプリケーションは、タンパク質発現プロファイリング、酵素-基質の関係、バイオ マーカーのスクリーニング、宿主微生物間相互作用の解析に関する研究とプロファイリング抗体特異性23,24, 25,26,,2728。マラリア (原虫)29, HIV 130, インフルエンザ31, 重症急性呼吸器症候群 (SARS)32、ウイルス性出血熱33 を含む多くの新しい病原体の抗原/マイクロ アレイが確立されています。、ヘルペス ウイルスの34、および結核35。

簡単営業C. difficile反応性抗原マイクロ アレイ分析、マルチ アイソタイプとC. 株特異抗体の正確な正確なおよび特定の定量化を可能にするのに係る現在のプロトコルdifficileポリクローナル IVIg および血清中の抗原。ここで、elisa 法と同様、測定精度と再現性プロファイルと比較されたとき許容可能なマイクロ アレイ分析性能に係る代表の結果が含まれています。この試金は他の臨床サンプルをプロファイルにさらに開発できるし、CDI の分子基盤研究のための新しい標準を設定します。

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プロトコル

1. マイクロ プレートの準備

  1. (患者の血清を実行する前に事前に定義された) を最適な濃度で印刷バッファー [PBS-トゥイーン-トレハロース (50 mM)] c. ディフィシル抗原を希釈: 毒素 (200 μ g/ミリリットル) と毒素 B (100 μ g/mL)、pCDTb (200 μ G/ml) と精製ネイティブ全体の Slp は、ribotypes 001、002、027 (200 μ g/mL) から派生します。
    注: 毒素 B 毒素 B 表現するひずみ CCUG 20309 (90 μ g/mL) から得られました。
    1. ポジティブ コントロール、 c. アルビカンスと 100 μ g/mL で印刷バッファーと破傷風トキソイドの lysates を希釈します。最後に、希釈精製ひと免疫グロブリン テスト抗体アイソタイプを逐次マッチング、検量線を作成するための印刷バッファーで 10 希釈液 50 μ G/ml で開始します。
  2. 384 ウェル プレートに印刷バッファーで希釈液の 10 μ L を転送します。
  3. カバー プレート シールと 300 × g で 5 分間遠心するプレート。

2. 印刷連絡先ロボットと配列

  1. 熱各携帯用ガスバーナー 3 × 2 s を使用してシリコン pin 形ときれいな水 3 x 3 s 各でリンス。
  2. Arrayer のローディングのカートリッジにマイクロ プレートを配置します。
  3. スライド トレイにアミノシラン スライドを配置します。
    注: スライド トレイは 27 のスライドを保持できます: 9 のスライドの 3 行。スライドがから一番下の行の左側にある縦方向に配置され、スペースの残りの部分は、スライド トレイ上のすべての穴をカバーできるように空白のスライドで覆われています。
    1. [Ok]を押し、真空をオンになっているし、すべてのスライドは、セキュリティで保護されたことを確認します。印刷を開始する前に、少なくとも 1 時間の高温多湿の環境でスライドを残します。
      注: アミノシラン スライドは、乾燥剤を密封袋で提供されます。開いたら、任意の未使用のスライドが満了する日まで保存用デシケータにすぐに返されます。
  4. クロストリジウム ・ ディフィシル抗原を印刷に適した印刷プログラムを設定します。TAS アプリケーション スイートを起動し、' 私のグリッド化実行 ' をディレクトリから必要な印刷実行パラメーター ファイルを開きます。4 連ですべてのクロストリジウム ・ ディフィシル抗原の印刷にクロストリジウム ・ ディフィシルファイルを選択します。
  5. メイン ウィンドウにマイクロ アレイのアイコンをダブルクリックする時に 3 つのタブ付きウィンドウと呼ばれる 'MicroArraying パラメーター' が表示されます。 3 つのタブは、「ソース」、「ターゲット」と「オプション」「ソース」タブ詳細にマイクロ プレートで使用されるサンプル数を示します。「ターゲット」タブには、スライド ロード配列のスライドに印刷するか、スライドのレイアウト (16 のサブ配列形式) を編集する方法詳細が表示されます。「オプション」タブには、洗浄、使用などをするツールの詳細が表示されます。すべての完成したサンプル後洗ってください。異なるサンプル間のクロス汚染を避けるためにサンプル間シリコン pin 形をきれい。
  6. プログラミング オプションがオプションの下にある > TAS アプリケーション スイート ツールバーの環境設定を実行します。このセクションで使用する 9 タブがあり、あなたへと移動クリックして完全な 1 つのタブ。「OK」ボタンをクリックすると「実行の設定」からかかります「実行の設定」の「一般」タブでプログラムを起動するときの楽器の動作に関するこのセクション下で利用可能なチェック ボックス数があります。「総理風呂実行が開始する前」にチェックすべての 3 つの洗い場短いプライミング シーケンス実行の開始前に受けることになります。最初のソースを訪問する前に、チェック ボックスの「実行の開始時に洗う」、ピンのツールが洗浄されます。「実行終了時の洗浄」にチェック、最後にソースを訪問した後、ピンのツールが洗浄されます。ユーザーは、洗浄サイクルの数を設定できます。「実行設定」の「気候変動」タブで加湿を開始します。我々 が使用する設定は、次のとおり: 率 55%、最小湿度 55%、目標湿度 60% 開始率 55%、実行します。目標湿度に達している、そうしないスポットは間違ったサイズになり、ライブラリが急速に蒸発するまで実行は開始されません。
  7. TAS のメニュー バーで緑の移動ボタンをクリックします。 実行を開始し、定期的に特定のすべてのものに印刷の実行中に arrayer、[ok] を確認します。
    注: これにより各スライド上で並列に 15 試料の分析、1 つのサブ配列はネガティブ コントロールとして使用され。サブ配列のデザインは、印刷されたタンパク質 (抗原) の数によって決まり、印刷された生物の数をレプリケートします。
    注: 各サンプルを印刷後、頭に向かって移動洗濯風呂蒸留水と 0.002% を含む 2 つの洗浄浴にピンの複数を浸漬を許可する 1.5 のトゥイーン 20 各バースの s に続いて超純水でピンを洗浄・乾燥のピン4 主な洗浄駅 s。

3. 配列のストレージ

  1. 一晩、デシケータで常温保存印刷スライドを維持します。
    注: 印刷のスライドは 1 週間保存できます。

4. アレイ プローブ

  1. 16 ウェル室形式のスライド ホルダーに印刷スライドを慎重に配置します。
    注: 室、約 7.5 mm の深さを持つ混合し、洗浄手順を容易にする容積の比率に寛大な表面を提供します。
  2. すべての試薬を使用する前に室温に戻を許可します。指定がなければ、室温でのすべての次の手順を実行します。
  3. フィルター処理された 5% ウシ血清アルブミン トゥイーン (BSAT; 0.2 μ m シリンジ フィルターを使用)、各ブロック スライドをカバーし、1 時間振とうしながらそれらをインキュベートの 100 μ L を追加します。
  4. Tween 20 と生理食塩水リン酸緩衝の 120 μ L で 5 x 1 分各スライドを洗う (PBST; 0.1% トゥイーン) 揺れもあたり。スライドを乾燥をさせてください。
  5. 20 分間氷の上の血清サンプルを解凍し、コンポーネントを削減の背景を持つ市販抗体希釈検体を希釈 (材料の表を参照してください)。
    1. 表 2に示すように、テストの免疫グロブリンによると血清の希釈を最適化します。
  6. ネガティブ コントロールとして使用される 1 つを除いてすべてのブロックに希釈血清試料 100 μ L を転送します。このブロックのみ抗体希釈の 100 μ L を追加します。1 時間のために穏やかな攪拌とスライドを孵化させなさい。
  7. PBST の 120 μ L で各 5 x 3 分スライドを洗う (0.1% トゥイーン) 揺れもあたり。
  8. ビオチン標識ヤギ抗ひと抗体抗体の希釈剤で希釈の 100 μ L を追加します。
    1. 表 2で説明したテストの免疫グロブリンによると二次抗体の希釈を最適化します。スライドをカバーし、1 時間を穏やかな揺れでそれらを孵化させなさい。
  9. 揺れでよくあたり PBST の 120 μ L でスライド各 5 x 3 分を洗浄します。
  10. ストレプトアビジン Cy5 の 100 μ L を 5 %bsa の配分で希釈した各ブロックに追加します。穏やかな攪拌に 15 分間揺れながら光からそれらを保護するために箔のスライドをカバーします。
  11. 続いて PBS で 1 分の 2 洗浄揺れだけで揺れ、よくあたりスライド 5 x 1 分各 120 μ L の pbst; を洗ってください。
  12. それらを乾燥する 300 × g で 5 分間スライドをスピンします。
  13. 常温輸送および保管用暗箱にスライドをしてください。
  14. 調査した後信号整合性を確実にすぐに配列をスキャンに進みます。
    注: ただし、プローブ スライド暗闇の中で保存できスキャン調査から 1 週間以内。

5. 配列のスキャン

  1. レーザー スキャナーに切り替える (テーブルの材料を参照) ウォーム アップ レーザー スキャンする前に 30 分。スキャナー用のソフトウェアをアップロードし、スキャナーをコンピューターに接続します。
  2. 再生光が緑色に変わったら、スキャナーに印刷面を上にスライドを配置します。
  3. 設定ボタンを押すし、次のようにスライドをスキャンする場合、次の設定を調整: スキャン モード, 中央値;買収、635 だけです。アクイジション ・ モード、マニュアル;ゲイン、20;電源、低;スライド型、ラベルのないスライド;フォーカス、オート フォーカス。自動スクロールをオフし、バーコードの読み取りをピクセル サイズ 10 と 35 のスキャンに設定します。
  4. 16 ビットのグレースケールとして複数画像の TIFF 形式の画像を保存します。インポート グリッドボタンを押すし、適切な配列リストを選択します。
    注: 配列リストは、サイズとサブ配列の位置、および各機能インジケーターに関連付けられている印刷物名をについて説明します。
    1. スライド上のスポットをグリッドに合わせます。
  5. 各スポットの蛍光信号強度を測定し、GenePix 結果 (GPR) と呼ばれるテキスト形式で結果を保存するプロセスを定量化」ボタンを押すことによって、画像を分析します。
    注: GPR ファイルに含まれる抗原ターゲット アレイ上の局在と識別変数とも平均蛍光強度と抗体の結合を表すローカル背景信号を各スポットの値。

6. データの分析

  1. 逆相蛋白質配列 (セルシグナル) アナライザー、クラン36統計解析言語 R 内のモジュールと呼ばれる無料のマイクロ アレイ解析ソフトウェアを用いた背景差分の後各抗原のレプリケートの中央値を計算します。
  2. 標準曲線をプロットし、商業科学グラフと統計ソフトウェア (材料の表を参照) を使用して抗体のレベルを計算する免疫グロブリンの標準曲線を基準にして各抗原の信号を補間します。

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結果

記述されていたプロトコルの主な手順を示すフローチャートを図 1に示します。図 2は、スピアマンの相関関係テスト テスト患者血清中の抗毒素 A と B レベル IgG および IgA のマイクロ アレイと ELISA との重要な契約を示しています。図 3は、下痢なし CF 患者、下痢、CDI 患者と HC 毒素は、毒素 B、およ?...

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ディスカッション

このプロトコルでは、マイクロ アレイは (図 3および6) 患者血清および IVIg (図 5) の商業準備のdifficile C.タンパク質抗原に対する液性免疫応答を定義するための適切なプラットフォームを示しました。マイクロ アレイ技術が従来の elisa 法 (図 2) と比較した場合にも実行して測定内および測定間変動 (精度の許?...

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開示事項

なし。

謝辞

この研究は、エルメス交わりオラ Negm とターニャ モナハンとノッティンガム消化器病センターと NIHR ノッティンガム消化器疾患医療研究センターから個別の資金によって支えられました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
BioRobotics MicroGrid II arrayerDigilab, Malborough, MA, USAN/AContact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides.
Scanner InnoScan 710.InnopsysN/AA fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction.
MAPIX software version 7.2.0InnopsysN/AMeasure signal intensities of the spots.
Silicon contact pinParallel Synthesis TechnologiesSMT-P75Print the samples onto the slides.
Thermo Scientific Nalgene DesiccatorThermo Scientific41102426To store the new and printed slides.
384-well plateGenetixX7022UNTo prepare the antigens.
Plate coverSigma Aldrich, UKCLS6570-100EATo reduce evaporation of the samples.
Aminosilane slidesSchott,  Germany1064875The slide of choice for printing the antigens.
Slide holdersGraceBio Labs, USA204862Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells . 
Candida albicans lysateNIBSCPR-BA117-SPositive control
Tetanus Toxoid Athens Research and Technology04/150Positive control
Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma Athens research and  technology  16-16-090707Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma. 
Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma Athens research and  technology  16-16-090707-1Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma. 
Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma Athens research and  technology  16-16-090707-2Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma. 
Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma Athens research and  technology  16-16-090707-3Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma. 
Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma Athens research and  technology  16-16-090707-4Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma. 
Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma Athens research and  technology  16-16-090701Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma.
Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma Athens research and  technology  16-16-090701-1MPurified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma.
Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma Athens research and  technology  16-16-090701-2MPurified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma.
Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma Athens research and  technology  16-16-090713Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma.
Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specificVector LabsBA-3080Goat anti- human IgG (γ-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOTSouthern Biotec9052-08 Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOTSouthern Biotec9060-08  Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOTSouthern Biotec9210-08   Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG4 pFc'-BIOTSouthern Biotec9190-08  Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat - BiotinylatedVector LabsBA-3030Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA1-BIOTSouthern Biotec9130-08Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA2-BIOTSouthern Biotec9140-08  Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgM-BIOTSouthern Biotec9020-08 Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
0.2 mm syringe filterThermo scientific723-2520Filter the 5% BSA.
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma Aldrich, UKA7284Use 5% BSA for blocking the slides.
Antibody diluentDako, UKS3022To dilute the serum and the secondary antibody.
Streptavidin Cy5eBioscienceSA1011Detection of the immune reaction.
Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087)Toxins Group, Public Health EnglandNA
Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain)Toxins Group, Public Health EnglandNA
Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTbUniversity of Bath NAProduced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70)
Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteinsDublin City University NA
Vigam (IVIg preparation 1)Nottingham University Hospitals NHS TrustN/A
Privigen (IVIg preparation 2)Nottingham University Hospitals NHS TrustN/A
Intratect (IVIg preparation 3)Nottingham University Hospitals NHS TrustN/A

参考文献

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