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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt eine einfache Protein Microarray Methode für Clostridium Difficile Antigene im menschlichen Serum Profilerstellung humorale Immunantworten auf einer 7-Plex Jury hoch gereinigt werden. Das Protokoll kann zur Bestimmung der spezifischen Antikörperantworten in die Vorbereitungen der polyklonalen intravenöses Immunglobulin erweitert werden.

Zusammenfassung

Wir bieten eine detaillierte Übersicht über ein neuartiges Hochdurchsatz-Protein-Microarray-Assay für die Bestimmung der Anti -Clostridium Difficile -Antikörpern im menschlichen Serum und in separaten Vorbereitungen von polyklonalen intravenöses Immunglobulin (IVIg). Das Protokoll beschreibt die methodischen Schritte zur Probenvorbereitung, Druck von Arrays, Testverfahren und Datenanalyse. Darüber hinaus könnte dieses Protokolls weiter ausgebaut werden, um vielfältigen klinischen Proben einschließlich Plasma und Zell-Kultur Überstände. Wir zeigen, wie Protein Microarray verwendet werden kann, um festzustellen, eine Kombination aus Isotype (IgG, IgA, IgM), Unterklasse (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2) und Stamm-spezifische Antikörper gegen hoch gereinigt ganze C. Difficile Toxin A und B (Toxinotype 0, Stamm VPI 10463, ribotyp 087), Toxin B aus einem C. Difficile Toxin-B-nur mit dem Ausdruck ihrer Stamm (CCUG 20309), eine Vorstufe-Form eines B-Fragments des binären Toxins, pCDTb, ribotyp-spezifische ganze Oberflächenschicht Proteine (SLPs, 001, 002, 027), und Steuern Proteine (Tetanus Toxoid und Candida Albicans). Während des Experiments sind Microarrays sondiert mit Sera von Einzelpersonen mit C. Difficile -Infektion (CDI), Einzelpersonen mit Cystischer Fibrose (CF) ohne Durchfall, gesunden Kontrollpersonen (HC), und von Einzelpersonen Pre- und Post-IVIg Therapie für die Behandlung von CDI, kombinierte Immundefizienz Unordnung und chronisch entzündliche demyelinisierende polyradikulopathie. Wir begegnen erhebliche Unterschiede in Toxin Neutralisation Wirksamkeiten und Multi-Isotype spezifischen Antikörpertiter Patientengruppen, kommerzielle Vorbereitung der IVIg, und Sera vor und nach IVIg Verabreichung. Außerdem gibt es eine signifikante Korrelation zwischen Microarray und Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) für Antitoxin-IgG-Werte in Serumproben. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Microarray ein viel versprechendes Instrument für die Profilerstellung Antikörperantworten auf C.difficile Antigene in geimpften oder infizierten Menschen werden könnte. Mit der Verfeinerung der Antigen-Panels und eine Reduzierung der Produktionskosten rechnen wir Microarray-Technologie optimieren und wählen Sie die klinisch nützlichen Immuntherapien für C. Difficile Infektion in einer Patienten-spezifischen Weise helfen kann.

Einleitung

Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung und Validierung eines neuartigen und kundenspezifische Protein Microarray Assays für die Erkennung und semi-Quantifizierung der Bakterienstamm und Isotype-spezifischen Antikörper-Reaktionen auf C. Difficile -Antigene. Wir nutzen erfolgreich unsere C. Difficile-spezifische Microarray-Assay als viel versprechende neue Werkzeug für die kompositorische Bioanalytik der spezifischen Antikörper Inhalte in Patientenseren1,2, Vorbereitungen von IVIg3, und Kennung der Antikörper-Besonderheiten, die mit schlechten Ergebnissen im CDI4korrelieren. Wir zeigen wie Biobanked Serumproben und kommerzielle Vorbereitung der IVIg auf Microarray Folien, analysiert werden können, ermöglicht qualitativ hochwertige reproduzierbare profiling von C. Difficile Erreger-spezifischen Antikörper-Reaktionen in diesem Assay.

Viele gesunde Kinder und Erwachsene haben nachweisbar Serum IgG und IgA Antikörper gegen C. Difficile Toxine A und B5,6. Diese werden gedacht, um nach vorübergehender Exposition in der Kindheit und nach Exposition gegenüber C. Difficile im Erwachsenenalter auftreten. Aus diesem Grund wurde polyklonale IVIg off-Label-zur Behandlung von wiederkehrenden und fulminanten CDI7,8,9verwendet. Seine endgültige Rolle und Wirkungsweise bleibt jedoch unklar. Mehrere Studien haben gezeigt, dass die Humorale Immunantwort auf C. Difficile Toxine in Krankheit Präsentation und das Ergebnis eine Rolle spielt. Insbesondere zeigen asymptomatische Patienten eine erhöhte Serum Anti-Toxin A IgG Konzentration im Vergleich zu Patienten, die Symptomen der Krankheit10zu entwickeln. Eine nachweisbare Verbindung wurde für mittlere Anti-Toxin-A IgG-Titer und 30-Tage Mortalität aller Ursachen11berichtet. Mehrere Berichte haben auch gezeigt, dass eine Vereinigung mit einem Schutz gegen Rezidive und Antikörper Reaktionen auf Toxin A, B und mehrere nicht-Toxin-Antigene (Cwp66, Cwp84, FliC, FliD und Oberflächenschicht Proteine (SLPs))12,13 , 14 , 15. diese Beobachtungen haben die Entwicklung der ersten passiven Immuntherapie Drug targeting C. Difficile Toxin B (Bezlotuxumab), die vor kurzem von der US Food and Drug Administration und die Europäische Arzneimittel-Agentur genehmigt wurde angespornt Agentur für die Prävention von wiederkehrenden CDI16. Impfstrategien mit inaktivierten Toxinen oder rekombinantes Toxin Fragmente sind auch derzeit in der Entwicklung17,18,19. Diese neue Therapieansätze werden zweifellos die Voraussetzung für die Bewertung der humoralen Immunantwort auf mehrere Antigene in große Stichprobenumfänge stimulieren.

Heute gibt es ein bemerkenswerten Mangel an handelsüblichen Hochdurchsatz-Assays in der Lage, gleichzeitig Bakterienstamm und Isotype-spezifischen Antikörper-Reaktionen auf C. Difficile -Antigene zu beurteilen. Es besteht ein ungedeckter Bedarf, solche Tests Erleichterung künftiger Forschung und klinische Anwendungen zu entwickeln. Protein Microarrays sind eine Methode, um große Anzahl von einzeln-gereinigte Proteine als räumlich organisierten Array von Flecken auf einer mikroskopischen folienbasierten Oberfläche zu immobilisieren, mit einem Robot-System, die entweder ein Kontakt20 oder ein berührungsloses sein kann Drucken Tool21. Die Spots können komplexe Mischungen wie Zelle Lysates, Antikörper, Gewebe Homogenates, endogenen oder rekombinante Proteine oder Peptide, Körperflüssigkeiten oder Drogen22,23darstellen.

Protein-Microarray-Technologie bietet deutliche Vorteile gegenüber standard im Haus ELISA-Techniken, die traditionell verwendet wurden, um Anti -C. Difficile Antikörperantworten zu beurteilen. Dazu gehören eine erhöhte Kapazität für eine Reihe von Multi-Isotype-spezifische Antikörper gegen eine umfangreichere Gruppe von Protein-Targets, geringerer Anforderungen für Antigene, Proben und Reagenzien, Erkennung und eine verbesserte Fähigkeit, eine größere integrieren Anzahl der technischen Replikationen, zusätzlich mehrere interne Qualitätskontrolle (QC) misst1. Microarrays sind daher sensibel, präzise und reproduzierbare und haben einen größeren Dynamikbereich. Diese Faktoren machen Microarrays eine billigere und potenziell günstige Alternative zu ELISAs für die groß angelegte Erkennung von bekannten Proteinen. Jedoch Nachteile der Microarray-Technologie resultieren im Wesentlichen aus der große Vorabkosten zugeordnet zur Gründung einer Gruppe von hochgereinigten Antigenen und die technologische Plattform einrichten.

Protein Microarrays haben in den letzten zwei Jahrzehnten als Diagnose- und grundlegende Recherche-Tool in der klinischen Anwendung intensiv genutzt. Spezielle Anwendungen sind Protein-Expression profiling, das Studium der Enzym-Substrat-Beziehungen, Biomarker Screening, Analyse von Host-Mikroben-Interaktionen und profiling Antikörper Spezifität23,24, 25,26,27,28. Viele neue Erreger Protein/Antigen Microarrays entstanden unter anderem Malaria (Plasmodium)29, HIV-130, Grippe31, schwere akute respiratorische Syndrom (SARS)32, virale hämorrhagische Fieber33, , Herpesviren34und Tuberkulose35.

Dieses Protokoll bezieht sich auf die Einrichtung eine einfach operative C. Difficile reaktive Antigen Microarray Assay, ermöglicht präzise, genaue und spezifische Quantifizierung der Multi-Isotype und Stamm-spezifischen Antikörper-Reaktionen auf C. Difficile Antigene in Sera und polyklonalen IVIg. Hier zählen wir repräsentative Ergebnisse in Bezug auf eine akzeptable Microarray Testleistung im Vergleich zu ELISA sowie Assay-Präzision und Reproduzierbarkeit Profile. Dieser Test könnte weiter entwickelt werden, um andere klinikmustern Profil und setzt einen neuen Standard für die Forschung in der molekularen Grundlagen des CDI.

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Protokoll

1. Vorbereitung einer Microarray-Platte

  1. C. Difficile Antigene mit einem Drucken Puffer [PBS-Tween-Trehalose (50 mM)] bei der optimalen Konzentration (das vordefiniert wurde vor dem Ausführen der Patientenseren) verdünnen: Toxin ein (200 µg/mL) und Toxin B (100 µg/mL), pCDTb (200 µg/mL) und gereinigte Native ganze SLPs abgeleitet ribotypen 001 und 002 027 (200 µg/mL).
    Hinweis: Toxin B war ein Toxin B exprimierenden Stamm CCUG 20309 (90 µg/mL) entnommen.
    1. Die Positivkontrollen Lysates von C. Albicansund Tetanus-Toxoid mit dem Drucken Puffer bei 100 µg/mL zu verdünnen. Zu guter Letzt Verdünnen der gereinigten Immunglobulin vom Menschen passend getesteten Antikörper Isotype seriell, beginnend bei 50 µg/mL über 10 Verdünnungen im Drucken Puffer eine Kalibrierkurve erstellen.
  2. Übertragen Sie 10 µL Verdünnungen im Drucken Puffer in einem 384-Well-Platte.
  3. Die Platte mit einer Platte Dichtung und Zentrifuge bei 300 X g für 5 min abdecken.

2. Druck-Arrays mit einem Kontakt Roboter

  1. Hitze der Silizium-Pin mit der Hand Gasbrenner 3 x 2 s und spülen in sauberem Wasser 3 x 3 s.
  2. Platzieren Sie die Microarray-Platte, in die Patrone geladen von der Arrayer.
  3. Der Diahalter aminosilan Folien auflegen.
    Hinweis: Der Diahalter fasst 27 Folien: drei Reihen von neun Folien. Die Folien sind im Hochformat, die ausgehend von der linken Seite der unteren Reihe angeordnet und der Rest der Räume sind bedeckt mit leeren Folien um sicherzustellen, dass die Löcher auf den Diahalter abgedeckt sind.
    1. Drücken Sie "OK" und überprüfen Sie, dass ein Vakuum aktiviert wurde und alle Folien sicher sind. Verlassen Sie die Folien in der feuchten Umgebung für mindestens 1 h vor dem Start des Drucks.
      Hinweis: Die aminosilan Folien sind in einem versiegelten Beutel mit Trockenmittel ausgestattet. Einmal geöffnet, sollten alle unbenutzten Folien sofort in den Exsikkator für Lagerung bis zum Verfallsdatum zurückgegeben werden.
  4. Clostridium Difficile Antigene Drucken geeignet Drucken Programm eingerichtet. Starten Sie die TAS-Anwendungs-Suite und öffnen Sie die erforderlichen Druckparameter laufen-Datei aus dem Verzeichnis "My Gridding läuft". Wählen Sie Clostridium Difficile -Datei für den Druck die Clostridium Difficile -Antigene in vervierfacht.
  5. Nach Doppelklick auf das MicroArray-Symbol im Hauptfenster erscheint ein Fenster mit drei Registerkarten genannt "MicroArraying Parameter".  Die drei Registerkarten sind "Quelle", "Target" und "Optionen". Die Registerkarte "Quelle" zeigt Details die Anzahl der Stichproben in der Microarray-Platte verwendet. Registerkarte "Target" zeigt Details wie die Folien sind geladen werden, wo das Array auf die Folie gedruckt werden soll und das Folienlayout (16 Subarrays Formate) zu bearbeiten. Die Registerkarte "Optionen" zeigt Details der waschen Protokoll und Tool verwendet zBwerden. Waschen Sie nach jedem abgeschlossenen Probe. Reinigen Sie die Silizium-Pin zwischen Proben, Kreuzkontamination zwischen verschiedenen Proben zu vermeiden.
  6. Die Programmiermöglichkeiten befinden sich unter Optionen > führen Sie Einstellungen in der TAS-Anwendungs-Suite-Symbolleiste. Es gibt 9 Registerkarten in diesem Abschnitt durcharbeiten und wie Sie komplette ein Tab zum nächsten wechseln indem Sie darauf klicken. Klick auf "OK" Schaltfläche gelangen Sie aus "Run Vorlieben." Im Register "Allgemein" den "Run-Einstellungen" gibt es eine Reihe von Kontrollkästchen unter diesem Abschnitt in Bezug auf das Instrument Verhalten wird, wenn eine Programm gestartet wird. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Prime Bad vor Beginn der Ausführung" alle drei Waschstationen durchläuft eine kurze Priming-Sequenz vor laufen. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Waschen bei Beginn der Ausführung", das Stift-Werkzeug wird gewaschen werden, bevor die erste Quelle besuchen. "Wash am Ende des Laufs" das Kontrollkästchen, das Stift-Werkzeug wird gewaschen werden, nachdem die letzte Quelle zu besuchen. Der Benutzer kann die Anzahl der Waschgänge festlegen. Starten Sie im Register "Klima" der "Run-Einstellungen" die Befeuchtung. Die Einstellung, die wir verwenden sind wie folgt: start Preis 55 %, Ausführen von 55 %, minimum Luftfeuchtigkeit 55 %, Ziel Luftfeuchtigkeit 60 %. Starten Sie den Durchlauf nicht, bis die soll-Luftfeuchtigkeit erreicht wurde, ansonsten die Spots die falsche Größe werden und die Bibliothek wird schnell verdunsten.
  7. Klicken Sie in der Menü Bar des TAS auf grüne gehen.  Starten Sie den Durchlauf und in regelmäßigen Abständen zu beobachten Sie, dass die Arrayer während der Auflage zu bestimmten alles in Ordnung ist.
    Hinweis: Dies ermöglicht die Analyse von 15 Proben parallel auf jeder Folie ein Unterarray als Negativkontrolle verwendet wird. Das Design von Teilmatrizen richtet sich nach der Anzahl der gedruckten Proteine (Antigene) und die Anzahl der gedruckten biologischen repliziert.
    Hinweis: Nach dem Drucken jede Probe, der Kopf bewegt sich in Richtung der waschbäder erlauben mehrere Eintauchen des Stiftes in zwei waschen Bäder mit destilliertem Wasser und 0,002 % Tween 20 für 1.5 s in jedem Bad, gefolgt von der Pin mit Reinstwasser Spülung und Trocknung den Stift im die wichtigsten Waschstation für 4 s.

3. Lagerung der Arrays

  1. Halten Sie die gedruckten Folien, die über Nacht bei Raumtemperatur in den Exsikkator gelagert.
    Hinweis: Die bedruckten Folien können bis zu einer Woche aufbewahrt werden.

(4) Array sondieren

  1. Platzieren Sie sorgfältig gedruckte Folien in einen Diahalter 16 Multi-gut Kammern Format.
    Hinweis: Die Kammern, mit einer Tiefe von ca. 7,5 mm bieten eine großzügige Fläche Volumen-Verhältnis zu mischen und Waschschritte.
  2. Lassen Sie alle Reagenzien vor Gebrauch auf Zimmertemperatur erwärmen. Sofern nicht anders angegeben, führen Sie die folgenden Schritte bei Raumtemperatur.
  3. Fügen Sie 100 µL gefilterte 5 % Rinderserumalbumin Tweens (BSAT; Gebrauch einer 0,2 µm Spritze Filter), jeder block, decken die Folien und inkubieren sie mit Schütteln für 1 h.
  4. Waschen der Dias 5 x 1 min in 120 µL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung mit Tween 20 (PBST; 0,1 % Tween) pro Bohrloch mit schütteln. Lassen Sie sich nicht die Folien austrocknen.
  5. Die Serumproben für 20 min auf Eis Auftauen und mit Hintergrund verringern Komponente jede Probe mit einem handelsüblichen Antikörper Verdünnungsmittel verdünnen (siehe Tabelle der Materialien).
    1. Optimieren Sie die Verdünnung die Serumproben nach der getesteten Immunglobulin, wie in Tabelle 2dargestellt.
  6. Alle Blöcke mit einer Ausnahme, die als Negativkontrolle verwendet werden übermitteln Sie 100 µL verdünnter Serumproben; dieser Block fügen Sie nur 100 µL Antikörper Verdünnungsmittel hinzu. Inkubieren Sie die Folien mit sanften Agitation für 1 h.
  7. Die Objektträger 5 x 3 min in 120 µL PBST waschen (0,1 % Tween) pro Bohrloch mit schütteln.
  8. Fügen Sie 100 µL eines biotinylierte Ziege Anti-Human-Antikörpers mit Antikörper Verdünnungsmittel verdünnt.
    1. Optimieren Sie die Verdünnung der Sekundärantikörper nach der getesteten Immunglobulin, wie in Tabelle 2beschrieben. Decken Sie die Folien und inkubieren sie mit sanft Schütteln für 1 h.
  9. Waschen Sie die Folien 5 x 3 min in 120 µL PBST pro Bohrloch mit zitternden.
  10. Jeder Block verdünnt 1: 2000 in 5 % BSA fügen Sie 100 µL Streptavidin Cy5 hinzu. Decken Sie die Folien mit einer Folie zum Schutz vor Licht, während 15 min. unter Rühren sanft schütteln.
  11. Waschen Sie die Dias 5 x 1 min in 120 µL der PBST pro Bohrloch mit schütteln, gefolgt von 2 Wäschen von 1 min in PBS nur mit zittern.
  12. Drehen Sie die Folien für 5 min bei 300 X g zu trocknen.
  13. Halten Sie die Folien in einer dunklen Box für Transport und Lagerung bei Raumtemperatur.
  14. Gehen Sie zum Scannen die Arrays sofort um Signal Konsistenz nach sondieren zu gewährleisten.
    Hinweis: Allerdings sondierten Folien können im Dunkeln aufbewahrt und innerhalb einer Woche nach sondieren gescannt.

5. Scannen die Arrays

  1. Schalten Sie den Laserscanner (siehe Tabelle der Materialien) 30 min vor dem Scannen zum Aufwärmen des Lasers. Laden Sie die Scanner-Software und verbinden Sie den Computer mit dem Scanner.
  2. Legen Sie eine Folie mit der beschrifteten Seite nach oben in den Scanner, bis das Spiel leuchtet grün Lämpchen.
  3. Drücken Sie die Schaltfläche " Einstellungen " und passen Sie die folgenden Einstellungen beim Scannen von Dias wie folgt:-Scan-Modus, Median; Erwerb, 635 nur; Akquisitionsmodus, Handbuch; Gewinn, 20; Power, Low; Folie Typ, unbeschriftete Folie; Fokus, Autofokus. Deaktivieren Sie automatischer Bildlauf und Barcode Reading Pixel Größe 10 und Scannen 35.
  4. Speichern Sie die resultierenden Bilder als 16-Bit-Graustufen mehrere Bild-TIFF-Format. Drücken Sie die Schaltfläche " Import Grid " und wählen Sie die entsprechende Arrayliste.
    Hinweis: Die Array-Liste beschreibt die Größe und Position von Teilmatrizen und die Namen der bedruckten Stoffe verbunden mit jedem Feature-Indikator.
    1. Richten Sie das Gitter, um die Flecken auf der Folie.
  5. Analysieren Sie die Bilder durch Drücken der Taste Quantifizierung Prozess um die Fluoreszenz Signalintensitäten an jeder Stelle zu messen und die Ergebnisse in einem Textformat namens GenePix Ergebnisse (GPR) speichern.
    Hinweis: Die GPR-Datei enthält die Lokalisierung und Identifizierung Variablen Antigen Ziele auf das Array und auch der mittlere Fluoreszenzintensität und lokalen Hintergrund, der die Antikörperbindung darstellt signalisieren Werte von jedem Fleck.

(6) Datenanalyse

  1. Den Median für die Wiederholungen der jedes Antigen nach Hintergrundabzug mit eine kostenlose Microarray-Analyse-Software namens reverse Phase Protein Arrays (RPPA) Analyzer, ein Modul innerhalb der statistischen Sprache auf CRAN36R zu berechnen.
  2. Plot der Standardkurve und interpolieren die Signale der jedes Antigen im Verhältnis zu der Immunglobulin-Standardkurve mit kommerziellen wissenschaftliche Grafik und Statistik-Software (siehe Tabelle der Materialien), die Antikörpertiter zu berechnen.

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Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm, beschreibt die wichtigsten Schritte in der beschriebenen Protokoll. Abbildung 2 zeigt Spearman Korrelationstests zeigen bedeutende Abkommen zwischen Microarray und ELISA für IgG und IgA Anti-Toxin A und B im Patiententest Sera Ebenen. Abbildung 3 zeigt differenzierte IgG und IgA Antikörper-Klasse spezifische antikörperreaktionen auf Toxin A und Toxin B binäres...

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Diskussion

In diesem Protokoll haben wir gezeigt, dass diese Microarray eine geeignete Plattform für die Humorale Immunantwort auf C. Difficile -Protein-Antigene in Patientenseren (Abbildungen 3 und 6) und kommerzielle Vorbereitung der IVIg (Abbildung 5) Definition ist. Wir haben auch gezeigt, dass die Microarray-Technik führt auch im Vergleich zu konventionellen ELISA (Abbildung 2) und zeigt hervorragende Reproduzierbarkeit mit...

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Offenlegungen

Keine.

Danksagungen

Diese Forschung wurde durch eine Hermes-Fellowship Ola Negm und Tanya Monaghan und durch gesonderte Finanzierung von Nottingham verdauungsfördernden Krankheiten Zentrum und die NIHR Nottingham verdauungsfördernden Krankheiten Biomedical Research Centre unterstützt.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
BioRobotics MicroGrid II arrayerDigilab, Malborough, MA, USAN/AContact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides.
Scanner InnoScan 710.InnopsysN/AA fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction.
MAPIX software version 7.2.0InnopsysN/AMeasure signal intensities of the spots.
Silicon contact pinParallel Synthesis TechnologiesSMT-P75Print the samples onto the slides.
Thermo Scientific Nalgene DesiccatorThermo Scientific41102426To store the new and printed slides.
384-well plateGenetixX7022UNTo prepare the antigens.
Plate coverSigma Aldrich, UKCLS6570-100EATo reduce evaporation of the samples.
Aminosilane slidesSchott,  Germany1064875The slide of choice for printing the antigens.
Slide holdersGraceBio Labs, USA204862Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells . 
Candida albicans lysateNIBSCPR-BA117-SPositive control
Tetanus Toxoid Athens Research and Technology04/150Positive control
Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma Athens research and  technology  16-16-090707Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma. 
Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma Athens research and  technology  16-16-090707-1Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma. 
Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma Athens research and  technology  16-16-090707-2Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma. 
Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma Athens research and  technology  16-16-090707-3Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma. 
Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma Athens research and  technology  16-16-090707-4Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma. 
Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma Athens research and  technology  16-16-090701Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma.
Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma Athens research and  technology  16-16-090701-1MPurified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma.
Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma Athens research and  technology  16-16-090701-2MPurified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma.
Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma Athens research and  technology  16-16-090713Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma.
Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specificVector LabsBA-3080Goat anti- human IgG (γ-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOTSouthern Biotec9052-08 Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOTSouthern Biotec9060-08  Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOTSouthern Biotec9210-08   Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG4 pFc'-BIOTSouthern Biotec9190-08  Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat - BiotinylatedVector LabsBA-3030Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA1-BIOTSouthern Biotec9130-08Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA2-BIOTSouthern Biotec9140-08  Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgM-BIOTSouthern Biotec9020-08 Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
0.2 mm syringe filterThermo scientific723-2520Filter the 5% BSA.
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma Aldrich, UKA7284Use 5% BSA for blocking the slides.
Antibody diluentDako, UKS3022To dilute the serum and the secondary antibody.
Streptavidin Cy5eBioscienceSA1011Detection of the immune reaction.
Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087)Toxins Group, Public Health EnglandNA
Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain)Toxins Group, Public Health EnglandNA
Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTbUniversity of Bath NAProduced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70)
Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteinsDublin City University NA
Vigam (IVIg preparation 1)Nottingham University Hospitals NHS TrustN/A
Privigen (IVIg preparation 2)Nottingham University Hospitals NHS TrustN/A
Intratect (IVIg preparation 3)Nottingham University Hospitals NHS TrustN/A

Referenzen

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