JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מתארים שיטה למסירה של הדנ א פלסמיד לתאים urothelial של העכבר שלפוחית השתן ויוו דרך השופכה צנתור אלקטרופורציה. הוא מציע דרך נוחה ומהירה ליצירת מודלים העכבר autochthonous של מחלות שלפוחית השתן.

Abstract

מודלים מהונדס גנטית עכבר (GEMMs) יקרים מאוד בגילוי הרומן ביולוגי תובנות החניכה, התקדמות מנגנוני מחלות אנושיות כגון סרטן. העכברים הטרנסגניים, מותנה נוקאאוט שימשו לעיתים קרובות ביטוי גנים או אבלציה רקמות ספציפיות או תא סוגי בתוך vivo. עם זאת, יצירת מודלים העכבר germline יכול להיות זמן רב ויקרות. הפיתוחים האחרונים בתחום הגן עריכה טכנולוגיות ואת הכדאיות של אספקת פלסמידים DNA על ידי זיהום ויראלי אפשרו דור מהירה של הלא-germline autochthonous העכבר סרטן מודלים עבור מספר איברים. שלפוחית השתן הוא איבר זה היה קשה עבור וקטורים ויראלית לגשת, בשל נוכחותם של שכבה גליקוזאמינוגליקן המכסים את urothelium. כאן, אנו מתארים שיטה שפותחה במעבדת לאספקה יעילה של ה-DNA פלסמידים לתוך העכבר שלפוחית השתן urothelium vivo בתוך. דרך intravesical החדרה של pCAG-GFP דנ א פלסמיד אלקטרופורציה השלפוחית בניתוח חשוף, אנו מראים כי פלסמיד דנ א יכולה להיות מועברת במיוחד לתוך התאים urothelial שלפוחית השתן לביטוי ארעית. השיטה שלנו מספק דרך נוחה ומהירה ביטוי נוקאאוט של גנים בשלפוחית עכבר, ניתן להחיל על בניין GEMMs של סרטן שלפוחית השתן ומחלות אורולוגיים אחרים.

Introduction

מודלים מהונדס גנטית עכבר (GEMMs) יש משחק תפקיד חיוני בהרחבת הידע שלנו על בעלי חיים, ג'ין פונקציות ויווופיתוח מנגנוני המחלה התקדמות1,2. Germline GEMMs מפותחים באופן מסורתי בשתי דרכים. הראשונה היא היצירה של העכברים הטרנסגניים בזריקה pronuclear של הדנ א פלסמיד ואחריו את השתלת של מופרות לתוך נקבות pseudopregnant. השני הוא הדור של עכברים טוק-אאוט/טוק-in על-ידי רקומבינציה הומולוגית בתאי גזע עובריים לבין התפתחות כימרות. נוקאאוט מותנה של גנים ספציפיים ברקמות או תא סוג עניין כרוך הרבייה של אללים מהונדסים עם Cre ואתרים flox דורות מרובים. כל התהליך יכול להיות יקר ולא זמן רב, במיוחד אם המטרה היא היעד גנים מרובים רקמות-במיוחד. לאחרונה, עריכת ג'ין טכנולוגיות כגון באשכולות interspaced בקביעות קצר palindromic חזרה (CRISPR) הוחלו על מספר איברים של העכברים לזירוז רקמות ספציפיות שינויים גנטיים לסרטן autochthonous מידול3, 4,5,6,7 או מוטציות המחלה הנכונה בחיי עיר8,9. במחקרים אלה, המסירה של הווקטורים gRNA הושג בדרך כלל דרך זיהום adenoviral או lentiviral של האיבר או הזרקת וריד הזנב hydrodynamic. הקלות היחסית משלוח של הרכיבים CRISPR ריאות ולכבד השתפרה במידה את הנוחות והיעילות של סרטן מידול באיברים אלה לעומת הדגמים העכבר Cre-לקס המבוסס מסורתית.

Urothelium שלפוחית השתן היא איפה שמקורן רוב גידולים בשלפוחית השתן. המשלוח של ה-DNA וקטורים שלפוחית השתן urothelium לטיפול דוגמנות או ג'ין סרטן היא הקשו על ידי שכבה גליקוזאמינוגליקן על פני השטח urothelial הפסגה, אשר משמש כמחסום ב"זכות של הווירוסים זיהומיות10,11. מספר סוכנים pretreatment כגון Syn3 ו- dodecyl-β-d-maltoside שימשו כדי לשבש את מחסום זה ולשפר אדנו זיהום יעילות12,13,14. אם adeno-הקשורים וירוסים (AAVs) יכול להדביק ביעילות שלפוחית השתן לא דווחה. בסך הכל, שיטת משלוח מבוסס נגיפי יהיה רצוי. כאן, אנו מתארים שיטה שפותחה במעבדה למסירה יעיל דנ א פלסמיד urothelium העכבר דרך השופכה צנתור אלקטרופורציה. כי הגישה שלנו אינו כרוך רעלני כימי של השכבה גליקוזאמינוגליקן או וירוס הייצור, שזה משמעותי מפשט את המסירה של ה-DNA פלסמידים לתוך urothelium שלפוחית השתן העכבר, צריך להקל על מחקרים שונים אין ויוו מחלות שלפוחית השתן.

Protocol

כל ההליכים המתוארים כאן בוצעו בהתאם הנחיות והתקנות מוסדיים טיפול בעלי חיים, שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת קליפורניה בסנטה קרוז.

1. פלסמיד והכנת כלים

  1. עבור כל שלפוחית השתן transfect, להכין µL לפחות עשרים של הדנ א פלסמיד (µg 1/µL).
  2. להוסיף 1 µL של Trypan Blue µL 20 של פתרון פלסמיד צינור microcentrifuge 1.5 mL. פיפטה לערבב היטב.
  3. אוטוקלב כירורגי כל כלים ולחטא את סביבת העבודה עם 70% אתנול. לרסס סטריליים, כפפות עם אתנול 70% בתדירות גבוהה או להשתמש מעקר חרוז זכוכית בעת ביצוע השלבים הבאים כדי לשמור על תנאים סטריליים.

2. anaesthetizing בעלי חיים

  1. השתמש מערכת הרדמה בראש הטבלה כדי עזים ומתנגד החיה עם איזופלוריין. להפעיל את הטנק2 O ולהתאים את זרימה חמצן כדי 1 ליטר/דקה.
  2. המקום העכבר C57BL/6J הנשי למבוגרים בבית הבליעה אינדוקציה. הפעל והתאם את מאדה איזופלוריין 3% עבור אינדוקציה. העכבר צריך להיות בהרדמה תוך 2 דק מנהל הבופרנורפין שיכוך כאב (0.1 מ"ג/ק"ג) subcutaneously על ההסרה של העכבר מן החדר אינדוקציה על שיכוך כאבים מונעת.
    הערה: פרוטוקול זה, נקבה עכברים משמשים, כפי שהם יותר קל לעבוד עם במהלך צנתור השופכה. הפרוטוקול פועל גם על עכברים זכר, אך נדרש לנקוט משנה זהירות בעת ביצוע שלב 3.
  3. משחה אופטלמולוגיות חלות על העיניים של החיה למניעת יובש. הנח את העכבר anaesthetized פונה כלפי מעלה על משטח חימום עם האף שלה בקונוס האף. תלחץ על המתג מעגל אוויר כדי לאפשר איזופלוריין לעבור את חרוט האף.
  4. לרסן את הראש והחרוט האף עם דבק. התאם את מאדה איזופלוריין ל-2% לצורך תחזוקה.
  5. לרסן את הגפיים עם דבק. לבצע הבוהן-קמצוץ בדיקות כדי לוודא החיה בהרדמה עמוקה, ואז מגלחים את אזור הבטן.

3. שתן דלדול ושטיפה שלפוחית השתן

  1. חלות סיכה הקטטר (G 24, אורך של 2.11 ס"מ, הקוטר החיצוני של ס"מ 0.045) ולהבטיח כי השטח החיצוני שלה מכוסה.
  2. הכנס את הצנתר לתוך הפתח השופכה, לאט לדחוף אותו עד שהוא מגיע שלפוחית השתן, ובו בזמן השתן צריך לזרום החוצה דרך הקטטר. לחץ בעדינות את הבטן כדי לסייע דלדול שתן.
    1. בדוק אם הצנתר הוכנס לתוך שלפוחית השתן על ידי התבוננות שתן אוטומטיים יותר זורם. להימנע פירסינג הקיר שופכה ושלפוחית ולהחיל סיכה מספר פעמים במידת הצורך.
  3. למחוק את השתן עם פיפטה לתוך גביע פסולת.
  4. פיפטה µL 80 תמיסת פוספט buffered (PBS) אל הקצה החיצוני של הקטטר, בקצהו השני עדיין בשלפוחית. בזהירות לצרף מזרק 1 מ"ל הצנתר. דחף בעדינות את המזרק כדי להזריק את החינוכית לתוך שלפוחית השתן. להשאיר קצת PBS הקטטר כדי להימנע מיצירת בועות אוויר בתוך שלפוחית השתן.
  5. הסר את המזרק. המתן PBS לנקז החוצה שלפוחית השתן. לחץ בעדינות את הבטן לפנות PBS.
  6. למחוק את PBS הקטטר עם פיפטה לתוך כשהספל פסולת.
  7. חזור על PBS שטיפה (שלבים 3.4-3.6) עוד פעמיים.
    הערה: זה חיוני כדי לעבוד בעדינות במהלך השלבים כביסה. דם קטטר או כשל אוטומטי מחוץ זרימה של נוזל בדרך כלל מצביע על השופכה היא חדרה מבעד. חשוב גם להימנע היכרות עם בועות אוויר, כפי שהם יקטין את היעילות אלקטרופורציה.

4. פלסמיד משלוח

  1. להחיל 70% אתנול בבטן בעכבר ולהשתמש אזמל לעשות חתך אנכי של 1 ס מ כדי לפתוח את העור בבטן מעל שלפוחית השתן.
  2. פיפטה µL לפחות עשרים של פלסמיד בתוספת Trypan Blue פתרון אל הקצה החיצוני של הקטטר, ולצרף את המזרק.
  3. להזריק את הפתרון פלסמיד לתוך שלפוחית השתן. אם שלפוחית השתן הופך לכחול, הזריקה הוא מוצלח. יוצאים נוזל הקטטר כדי להימנע מיצירת בועות אוויר בתוך שלפוחית השתן.
  4. . תפוס את פתח השופכה חיצוני באמצעות פינצטה ולאחר מכן הסר את הקטטר ואת המזרק. להשתמש במחרוזת כדי להדק את פתח השופכה חיצוניים. להפוך את שתי לולאות עם המחרוזת, ואז לקשור עם שני קשרים.
    הערה: הידוק של השופכה חשוב למניעת זרם אחורי של נוזל פלסמיד.
  5. להפעיל את הגנרטור אלקטרופורציה עם הפרמטרים הבאים: 33V, 50 מילישניות זמן עבודה, ו- 950 ms מרווח הזמן.
  6. להחזיק את השלפוחית עם פינצטה וצבטתי את השלפוחית עם שתי אלקטרודות. ללחוץ על דוושת רגל כדי לבצע את אלקטרופורציה.
    הערה: פולסים חשמליים מוגדרים יכולה להופיע 5 פעמים עם מרווחי זמן קצר לאחר כל דחיפה פדלים. העכבר עשוי להתעוות בתהליך זה. לוחץ על דוושת רגל יותר מפעם אחת יכול להגביר את היעילות המסירה, אך פולסים חשמליים רבים מדי עלולה לגרום נזק על urothelium שלמות רקמות.
    1. הימנע מכל מגע בין את הפינצטה האלקטרודות, כמו פעולה זו תיצור ניצוץ.

5. השבת

  1. תפר פתיחת בטן, עור עם תפירה סטריליים, אטבים. החל יוד לתוך הפצע.
  2. הסר את החיה המערכת איזופלוריין. לנהל הבופרנורפין שיכוך כאב (0.1 מ"ג/ק"ג) subcutaneously כדי להקל על הכאב לאחר ניתוח.
  3. לשמור את החיה על כרית חימום ולהחזיר אותה לכלוב הביתה לאחר החלמה מלאה. בדוק את החיה לפחות פעם ביום לניידות נורמלי, השתייה והאכלת התנהגויות, אין סימנים לזיהום עד החתך נרפאה ולאחר מכן הסר את הקליפים. לנהל זריקות עוקבות של הבופרנורפין שיכוך כאב אם החיה מציגה סימפטום כאב כגון מופחתת לטפח, גדל תוקפנות, והניקוד.

תוצאות

כדי להדגים את ההצלחה של המסירה הגן לתוך urothelium שלפוחית השתן, השתמשנו על פלסמיד15 pCAG-GFP עבור אלקטרופורציה. 20 µL של פלסמיד Trypan Blue פתרון הוזרק דרך השופכה, נוהלו 5 פולסים חשמליים. לאחר 48 שעות, אנחנו גזור העכבר שלפוחית השתן ולא נצפתה כתמים של קרינה פלואורסצנטית GFP תחת מ...

Discussion

אלקטרופורציה משפר את חדירות קרום התא, טכנולוגיה רבת עוצמה עבור ג'ין electrotransfer16. המסירה הגן לתוך החיים מכרסמים מאת אלקטרופורציה שימש לעתים קרובות נוירוביולוגיה שדות17,18,19,20,21. שלה יישומים א?...

Disclosures

המחברים מצהירים שום עניין מתחרות.

Acknowledgements

אנו מודים חן סל פרופסור דוקטור יואה ג'אנג, Kendy הואנג לקבלת עזרה בהתקנת מערכת אלקטרופורציה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מן סנטה קרוז סרטן לטובת קבוצה NIH Z.A.W.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BD 1mL TB SyringeFisher148232E
BuprenorphineSigmaB9275-50MG
Dumont TweezersRoboz Surgical InstrRS-5005Treat with 70% ethanol before surgical use
ECM830 SQ Wave ElectroporatorHarvard Apparatus450052
Exel International Disposable Safelet I.V. CathetersFisher Scientific14-841-2124G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter
Extra Fine Micro Dissecting ScissorsRoboz Surgical InstrRS-5135Treat with 70% ethanol before surgical use
IsofluraneVet one501017
K&H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 InchesAmazonn/aCover the heat mat with paper towels
Ophthalmic ointmentFisherNC0849514
PBS, pH7.4Life Technologies10010049
Pipet tips 200 µLUSA Scientific1111-0206
Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 µLFisher02707438(CS)
PIPETMAN NEO P2GilsonF144561
PIPETMAN NEO P200NGilsonF144565
plasmid CAG-GFPAddgene16664
Platinum tweezertrode 5 mmHarvard Apparatus4504895 mm diameter
ScissorsRoboz Surgical InstrRS-5880Treat with 70% ethanol before surgical use
String cordAmazonn/aMandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord
Tape, ScotchFisher19047257
Therio-gel Veterinary LubricantPBS animal health353-736
Trypan Blue StainLife Technologies15250061
V-1 Table top system anesthesiaVetEquip901806
Vicryl violet suture 18" FS-2 cutting 5-0FisherNC0578475
Walgreens Povidone Iodine 10%Walgreens953982
Wound clipFisher018045
Wound clip applierFisher01804

References

  1. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
  2. Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat Rev Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
  3. Maddalo, D., et al. In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system. Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).
  4. Xue, W., et al. CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver. Nature. , (2014).
  5. Sanchez-Rivera, F. J., et al. Rapid modelling of cooperating genetic events in cancer through somatic genome editing. Nature. 516 (7531), 428-431 (2014).
  6. Romero, R., et al. Keap1 loss promotes Kras-driven lung cancer and results in dependence on glutaminolysis. Nat Med. 23 (11), 1362-1368 (2017).
  7. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  8. Yin, H., et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nat Biotechnol. 32 (6), 551-553 (2014).
  9. Yang, Y., et al. A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice. Nat Biotechnol. 34 (3), 334-338 (2016).
  10. Negrete, H. O., Lavelle, J. P., Berg, J., Lewis, S. A., Zeidel, M. L. Permeability properties of the intact mammalian bladder epithelium. Am J Physiol. 271 (4 Pt 2), F886-F894 (1996).
  11. Lilly, J. D., Parsons, C. L. Bladder surface glycosaminoglycans is a human epithelial permeability barrier. Surg Gynecol Obstet. 171 (6), 493-496 (1990).
  12. Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Mol Ther. 10 (4), 697-705 (2004).
  13. Yamashita, M., et al. Syn3 provides high levels of intravesical adenoviral-mediated gene transfer for gene therapy of genetically altered urothelium and superficial bladder cancer. Cancer Gene Ther. 9 (8), 687-691 (2002).
  14. Engler, H., et al. Ethanol improves adenovirus-mediated gene transfer and expression to the bladder epithelium of rodents. Urology. 53 (5), 1049-1053 (1999).
  15. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. P Natl Acad Sci USA. 101 (1), 16-22 (2004).
  16. Yarmush, M. L., Golberg, A., Sersa, G., Kotnik, T., Miklavcic, D. Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges. Annu Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).
  17. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  18. Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3 (4), e1883 (2008).
  19. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
  20. Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. Gene delivery to postnatal rat brain by non-ventricular plasmid injection and electroporation. J Vis Exp. (43), (2010).
  21. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239 (2007).
  22. Follenzi, A., Santambrogio, L., Annoni, A. Immune responses to lentiviral vectors. Curr Gene Ther. 7 (5), 306-315 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

135urothelial

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved