새로운 방식의 마우스 방광 Urothelium Electroporation에 의해 플라스 미드 DNA 전달

요약

마우스 방광에서 vivo에서 요도 도관 법 및 electroporation 통해의 urothelial 세포로 DNA 플라스 미드의 배달에 대 한 새로운 방법을 설명합니다. 그것은 방광 질환의 학위 마우스 모델을 생성 하기 위한 신속 하 고 편리한 방법을 제공 합니다.

초록

유전자 조작된 마우스 모델 (GEMMs)은 암과 같은 인간의 질병의 개시 그리고 진행 성 메커니즘에 새로운 생물 학적 통찰력을 공개에 매우 중요 합니다. 유전자 변형 및 조건부 녹아웃 쥐 유전자 overexpression 자주 사용 되었습니다 또는 특정 조직 또는 세포 제거에 비보유형. 그러나, 생식 마우스 모델 생성 시간과 비용이 많이 드는 수 있습니다. 최근 발전 기술과 DNA 플라스 미드 바이러스 성 감염에 의해 제공의 타당성을 편집 진에 여러 장기에 대 한 비 생식 autochthonous 마우스 암 모델의 빠른 생성을 활성화 했습니다. 방광 액세스, 취재는 urothelium glycosaminoglycan 계층의 존재 때문에 바이러스 성 벡터에 대 한 어려운 되었습니다 기관 이다. 여기, 우리가 마우스 방광 urothelium 비보에 플라스 미드 DNA의 효율적인 배달에 대 한 실험실에서 개발 된 새로운 방법을 설명 합니다. PCAG-GFP DNA 플라스 미드의 intravesical 주입 및 수술 노출된 방광의 electroporation를 통해 우리는 DNA 플라스 미드 방광 urothelial 셀 과도 식으로 구체적으로 전달 될 수 있습니다 보여줍니다. 우리의 방법은 overexpression 및 마우스 방광에 유전자의 최저 신속 하 고 편리한 방법 이며 방광 암 및 다른 비뇨기과 질환의 GEMMs를 건물에 적용할 수 있습니다.

서문

유전자 조작된 마우스 모델 (GEMMs) 동물 개발, 유전자 기능에서 vivo에서및 질병 진행^1,2의 메커니즘에 대 한 우리의 지식을 확장에 필수적인 역할을 연주 하고있다. 생식 GEMMs는 전통적으로 두 가지 방법으로 개발 됩니다. 첫 번째 pseudopregnant 여성에 zygotes의 이식 뒤 DNA 플라스 미드의 pronuclear를 주입 하 여 유전자 변형 생쥐의 창조 이다. 다른 노크-아웃/노크-에서 생쥐 배아 줄기 세포에서 동종 재결합에 의해의 생성 및 키메라의 개발 이다. 특정 조직 또는 세포 유형의 관심 있는 유전자의 조건부 녹아웃 포함 여러 세대에 대 한 Cre flox 사이트와 대립 유전자 조작된 유전자의 번 식을 한다. 전체 프로세스는 비싸고 시간이 많이 걸리는, 목표는 조직 특히 여러 유전자를 대상으로 하는 경우에 특히 될 수 있습니다. 최근, 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) 같은 유전자 편집 기술 학위 암^{3, 모델링에 대 한 조직의 특정 유전 변경 유도를 쥐의 여러 장기에 적용 된 4,5,,67} 또는 정확한 병 변이 라^8, 에서⁹. 이러한 연구에서 gRNA 벡터의 전달 기관 또는 유체역학 꼬리 정 맥 주입의 adenoviral 또는 lentiviral 감염을 통해 일반적으로 달성 되었다. 폐와 간 CRISPR 부품의 납품의 상대적 용이성은 편리 하 고 암 전통적인 Cre Lox 기반 마우스 모델에 비해 이러한 기관에서 모델링의 효율성에 크게 향상 됩니다.

방광 urothelium 대부분 방광 종양의 발원지 이다. 암 모델링 이나 유전자 치료에 대 한 방광 urothelium DNA 벡터의 배달 glycosaminoglycan 레이어 전염 성 바이러스^10,11의 준수에 대 한 장벽 역할 꼭대기 urothelial 표면에 의해 방해 된다. Syn3 라우릴-β-d-maltoside 등 여러 가지 전처리 에이전트 하이 배리어를 중단 하 고 아 데 노비 루스 감염 효율^12,,1314강화 사용 되었습니다. Adeno 관련 바이러스 (AAVs) 효과적으로 방광을 감염 수 있습니다 여부 하지 보고 되었습니다. 전반적으로, 비 바이러스 성 기반된 전달 방법 바람직한 것입니다. 여기는 요도 도관 법 및 electroporation 통해 마우스 urothelium 효율적인 DNA 플라스 미드 배달 위한 실험실에서 개발 된 새로운 방법에 설명 합니다. 우리의 접근 glycosaminoglycan 레이어 또는 바이러스 생산의 화학 전처리를 포함 하지 않습니다, 때문에 그것은 크게 마우스 방광 urothelium로 DNA 플라스 미드의 납품을 간소화 하 고 다양 한 생체 내에서 연구를 촉진 해야 방광 질환의.

프로토콜

여기에서 설명한 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 캘리포니아 대학 산타 크루즈의 지침에 따라 수행 했다.

1. 플라스 미드 및 도구 준비

1. 각 방광 transfect에 대 한 DNA 플라스 미드 (1 µ g / µ L)의 적어도 20 µ L를 준비 합니다.
2. Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 플라스 미드 솔루션의 20 µ L을 Trypan 블루의 1 µ L를 추가 합니다. 잘 섞어 피 펫입니다.
3. 압력솥에 모든 수술 장비 및 작업 영역 70% 에탄올으로 소독. 자주 수술 기구와 장갑 70% 에탄올 스프레이 또는 무 균 상태를 유지 하기 위해 다음 단계를 수행할 때 유리 구슬 소독 기를 사용.

2. 동물 anaesthetizing

1. 테이블 상단 마 취 시스템을 사용 하 여 anesthetize isoflurane와 동물. O₂ 탱크를 켜고 1 L/min에 산소 유량을 조정.
2. 유도 실에서 성인 여성 C57BL/6J 마우스를 놓습니다. 설정 하 고 유도 3 %isoflurane 기화 기를 조정 합니다. 마우스 선제 무 통 유도 챔버에서 마우스의 제거에 따라 피하 마 취 2 분 관리 buprenorphine 진통제 (0.1 mg/kg) 이내에 있어야 한다.
   참고:이 프로토콜에서 여성 쥐로 사용 됩니다, 그들은 요도 도관 법 동안에 함께 작동 하도록 쉽습니다. 프로토콜 또한 남성 마우스 작동 하지만 여분의 주의 3 단계를 수행할 때 필요 하다.
3. 건조를 방지 하기 위해 동물의 눈에 안과 연 고를 적용 합니다. 코 콘에 그것의 코를 가진 난방 패드에 향하도록 anaesthetized 마우스를 놓습니다. 공기 회로 스위치 isoflurane 코 콘을 통과 하도록 설정 합니다.
4. 머리와 접착 테이프로 코 콘 제 지. 유지 보수에 대 한 2 %isoflurane 기화 기를 조정 합니다.
5. 접착 테이프를 가진 사지를 제 지. 동물과 깊은 마 취에 복 부 영역을 면도 되도록 발가락-핀치 테스트를 수행 합니다.

3. 소변 고갈 및 방광 세 정

1. 카 테 터 (24 G, 2.11 c m의 길이, 0.045 cm의 외부 직경)에 윤활제를 적용 하 고 그것의 외부 표면 완전히 덮여 확인 합니다.
2. 요도 오프닝으로 카 테 터를 삽입 하 고 이때 소변 카 테 터를 통해 밖으로 흘러 한다 방광에 도달할 때까지 천천히 그것을 밀어. 부드럽게 소변 고갈 수 있도록 복 부를 누릅니다.
   1. 카 테 터 삽입 됩니다 올바르게 방광에 자동 소변 흐름 밖을 관찰 하 여 확인 하십시오. 요도 방광 벽을 피어 싱을 방지 하 고 필요한 경우 윤 활 유를 여러 번 적용.
3. 폐기물 비 커에는 피 펫으로 소변을 삭제 합니다.
4. 방광에 여전히 다른 끝으로 카 테 터의 외부 끝에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 80 µ L 플라스틱. 신중 하 게 카 테 터를 1 mL 주사기를 연결 합니다. 부드럽게 PBS을 방광에 주입 하는 주사기를 밀어. 방광에 공기 방울을 만드는 피하기 위해 카 테 터에 일부 PBS를 남겨 주세요.
5. 주사기를 제거 합니다. PBS는 방광에서 배수를 기다립니다. 부드럽게 복 부 PBS 대피를 누릅니다.
6. 폐기물 비 커에는 피 펫으로 카 테 터에 PBS를 삭제 합니다.
7. PBS (단계 3.4-3.6) 세척 두 번 더 반복 합니다.
   참고: 이러한 세척 단계 동안 부드럽게 작동에 필수적입니다. 카 테 터 또는 자동의 실패에 피가 밖으로 액체의 흐름 일반적으로 요도 통해 피어 싱을 나타냅니다. 그들은 electroporation 효율성을 줄일 것으로 소개 하는 공기 방울을 피하기 위해 중요 한 이기도 합니다.

4. 플라스 미드 배달

1. 마우스 복 부에 70% 에탄올을 적용 하 고 메스를 사용 하 여 방광 위의 복 부 피부 열을 1 cm의 수직 절 개를 하 게.
2. 플라스 미드 플러스 Trypan 블루 솔루션의 적어도 20 µ L, 카 테 터의 외부 끝에 플라스틱 하 고 주사기를 연결 합니다.
3. 방광에 플라스 미드 솔루션을 삽입할. 방광 파란색 경우, 주사에 성공한 것입니다. 방광에 공기 방울을 만드는 피하기 위해 카 테 터에 어떤 액체를 남겨 주세요.
4. 핀셋을 사용 하 여 외부 요도 구멍을 카 테 터와 주사기를 제거. 문자열을 사용 하 여 외부 요도 구멍을 조여. 문자열 두 개의 루프를 확인 하 고 두 개의 매듭으로 묶어.
   참고:이 요도의 강화 플라스 미드 액체의 역류를 방지 하기 위한 중요 합니다.
5. 다음 매개 변수 electroporation 발전기 설정: 33V, 작업 시간과 950 간격 시간 50 ms.
6. 핀셋으로 방광을 누른 두 전극으로 방광을 꼬집어. 수행은 electroporation에 발 페달을 밀어.
   참고: 전기 펄스 각 페달 푸시 후 5 번 짧은 간격으로 발생 하도록 설정 됩니다. 마우스는이 과정에는 트 위치 수 있습니다. 발 페달을 여러 번 추진 전달 효율을 높일 수 있습니다 하지만 너무 많은 전기 펄스는 urothelium의 조직의 무결성을 손상 시킬 수 있습니다.
   1. 불꽃 생성 됩니다 핀셋과 전극, 사이 어떤 접촉을 든 지 피하십시오.

5입니다. 복구

1. 무 균 수술 봉합 및 클립 복 부와 피부 열기 봉합 요오드는 상처에 적용 됩니다.
2. Isoflurane 시스템에서 동물을 제거 합니다. 수술 후 통증을 완화 시키기 위해 피하 buprenorphine 진통제 (0.1 mg/kg)를 관리 합니다.
3. 난방 패드에 동물을 유지 하 고 전체 복구 후 홈 케이지 돌아갑니다. 적어도 한 번 매일 정상적인 이동성, 음주와 절 개 치유 되 고 다음 클립 제거 될 때까지 동작 및 감염의 흔적을 먹이 대 한 동물을 확인 하십시오. 동물 손질, 공격 성, 그리고 발성 증가 감소와 같은 통증 증상을 표시 하는 경우 후속 buprenorphine 진통제 주사를 관리 합니다.

결과

설명 하기 위해 방광 urothelium로 유전자 배달의 성공, 우리 electroporation pCAG GFP¹⁵ 플라스 미드 사용. 20 µ L 플라스 미드 및 Trypan 블루 솔루션의 요도 통해 주입 했다 그리고 5 전기 펄스 관리 되었다. 48 h 후 마우스 방광을 해 부 하 고 부정적인 electroporation 보여주었다 (그림 1A) GFP 신호를 받아야 하지 않았다 방광을 제어 하는 반면 해 부 ...

토론

Electroporation 세포 막 침투성을 강화 하 고 유전자 electrotransfer¹⁶에 대 한 강력한 기술 이다. Electroporation에 의해 생활 설치류에 유전자 배달 신경 생물학 분야^{17,,1819,20,21}에 자주 사용 되었습니다. 다른 많은 기관에 그것의 잠재적인 응용 프로그램 광범위 하 게...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD 1mL TB Syringe	Fisher	148232E
Buprenorphine	Sigma	B9275-50MG
Dumont Tweezers	Roboz Surgical Instr	RS-5005	Treat with 70% ethanol before surgical use
ECM830 SQ Wave Electroporator	Harvard Apparatus	450052
Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters	Fisher Scientific	14-841-21	24G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter
Extra Fine Micro Dissecting Scissors	Roboz Surgical Instr	RS-5135	Treat with 70% ethanol before surgical use
Isoflurane	Vet one	501017
K&H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 Inches	Amazon	n/a	Cover the heat mat with paper towels
Ophthalmic ointment	Fisher	NC0849514
PBS, pH7.4	Life Technologies	10010049
Pipet tips 200 µL	USA Scientific	1111-0206
Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 µL	Fisher	02707438(CS)
PIPETMAN NEO P2	Gilson	F144561
PIPETMAN NEO P200N	Gilson	F144565
plasmid CAG-GFP	Addgene	16664
Platinum tweezertrode 5 mm	Harvard Apparatus	450489	5 mm diameter
Scissors	Roboz Surgical Instr	RS-5880	Treat with 70% ethanol before surgical use
String cord	Amazon	n/a	Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord
Tape, Scotch	Fisher	19047257
Therio-gel Veterinary Lubricant	PBS animal health	353-736
Trypan Blue Stain	Life Technologies	15250061
V-1 Table top system anesthesia	VetEquip	901806
Vicryl violet suture 18" FS-2 cutting 5-0	Fisher	NC0578475
Walgreens Povidone Iodine 10%	Walgreens	953982
Wound clip	Fisher	018045
Wound clip applier	Fisher	01804