Neuartige Methode der Transport der Plasmid-DNA zu Maus Blase Urothel durch Elektroporation

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine neue Methode für die Lieferung von Plasmid DNA in die important-Zellen der Maus Blase in Vivo durch Katheterisierung der Harnröhre und Elektroporation. Freuen Sie sich auf eine schnelle und bequeme Möglichkeit zur Erzeugung von autochthonen Mausmodelle der Blase Krankheiten.

Zusammenfassung

Gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMMs) sind sehr wertvoll bei der Enthüllung neuartige biologische Einblicke in die Initiierung und Progression Mechanismen der menschlichen Krankheiten wie Krebs. Transgenen und bedingte Knockout-Mäusen werden häufig seit Überexpression des Gens oder Ablation in bestimmten Geweben oder Zellen in Vivo-Typen. Generierung von Keimbahn Mausmodellen kann Zeit- und kostenaufwändige jedoch. Neue Zuführungen in gen Bearbeiten von Technologien und die Machbarkeit liefern DNA Plasmide durch Virusinfektion haben schnelle Generierung von nicht Keimbahn autochthonen Mausmodellen Krebs für mehrere Organe aktiviert. Die Blase ist ein Organ, das für virale Vektoren aufgrund des Vorhandenseins einer Glykosaminoglykan Schicht deckt das Urothel Zugang zu schwierig gewesen sei. Hier beschreiben wir eine neuartige Methode, entwickelt im Labor für die effiziente Bereitstellung von DNA Plasmide in der Maus Blase Urothel in Vivo. Durch die intravesikale Instillation von pCAG-GFP DNA Plasmid und Elektroporation chirurgisch freigelegten Blase zeigen wir, dass das Plasmid DNA spezifisch in die Blase important Zellen für transiente Expression geliefert werden kann. Unsere Methode bietet eine schnelle und bequeme Möglichkeit für Überexpression und Knockdown von Gene in der Maus Blase und zum Aufbau von GEMMs von Blasenkrebs und anderen urologischen Krankheiten angewendet werden kann.

Einleitung

Gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMMs) spielen eine wesentliche Rolle bei der Erweiterung unseres Wissens über TIERENTWICKLUNG, gen Funktionen in Vivound Mechanismen der Krankheit Fortschreiten^1,2. Keimbahn GEMMs werden traditionell in zweierlei Hinsicht entwickelt. Die erste ist die Schaffung von transgenen Mäusen durch man Injektion von DNA Plasmid, gefolgt von der Transplantation von Zygoten in pseudopregnant Weibchen. Die andere ist die Generierung von Knock-Out/Knock-in Mäusen durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen und die Entwicklung der Chimären. Bedingte ko von Genen in bestimmten Geweben oder Zellen Art von Interesse gehört die Zucht von gentechnisch Allele mit Cre und Flox Standorten über mehrere Generationen. Der gesamte Prozess kann teuer und zeitaufwändig sein, besonders wenn das Ziel ist es, mehrere Gene Gewebe-gezielt. Vor kurzem haben mehrere Organe der Mäuse induzieren Gewebe-spezifische genetische Veränderungen für autochthone Krebs Modellierung^{3gen Bearbeitung Technologien wie gruppierte regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) zugewiesen wurde, 4,5,6,7} oder richtige Krankheit Mutationen in Situ^8,9. In diesen Studien wurde die Lieferung der gRNA Vektoren in der Regel durch adenoviralen oder Lentivirale Infektion der Orgel oder hydrodynamischen Tail-Vein Injektion erreicht. Die relative Leichtigkeit der Lieferung der CRISPR-Komponenten auf die Lunge und Leber hat sich verbessert den Komfort und die Effizienz von Krebs in diesen Organen im Vergleich zu den traditionellen Cre-Lox-basierte Mausmodellen Modellierung.

Die Blase Urothel ist wo die meisten Blase Tumoren entstehen. Die Lieferung von DNA-Vektoren an der Blase Urothel für die Krebstherapie Modellierung oder gen scheitert an ein Glykosaminoglykan-Schicht auf der apikalen important Oberfläche fungiert als ein Hindernis für die Einhaltung von infektiösen Viren^10,11. Mehrerer Vorbehandlung Agenten wie Syn3 und Dodecyl-β-d-maltosid wurden zur stören diese Barriere und Adenovirus-Infektion Effizienz^12,13,14zu erhöhen. Ob Adeno-assoziierten Viren (Flugabwehrpanzer) effektiv die Blase infizieren können, wurde nicht berichtet. Alles in allem wäre eine nicht-viralen basierend Übermittlungsmethode wünschenswert. Hier beschreiben wir eine neuartige Methode, die im Labor für effiziente DNA Plasmid-Lieferung an die Maus Urothel durch Katheterisierung der Harnröhre und Elektroporation entwickelt. Da unser Ansatz nicht chemische Vorbehandlung der Glykosaminoglykan-Schicht oder Virus Produktion involviert ist, es wesentlich vereinfacht die Bereitstellung von DNA Plasmide in der Maus Blase Urothel, und sollte erleichtern verschiedene in-Vivo -Studien Erkrankungen der Blase.

Protokoll

Alle hier beschriebene Verfahren wurden gemäß den Richtlinien und Verordnungen aus dem institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der University of California Santa Cruz durchgeführt.

(1) Plasmid und Vorbereitung der Werkzeuge

1. Für jede Blase zu transfizieren, mindestens 20 µL DNA Plasmid (1 µg/µL) vorzubereiten.
2. Die 20 µL Plasmid-Lösung in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch 1 µL Trypan blau hinzufügen. Pipette gut mischen.
3. Autoklav alle chirurgischen Instrumente und den Arbeitsbereich mit 70 % Ethanol zu sterilisieren. Sprühen von chirurgischen Instrumenten und Handschuhe mit 70 % Ethanol häufig oder mit einem Glas Bead Sterilisator bei der Durchführung der folgenden Schritte um sterile Bedingungen zu halten.

(2) betäubende Tier

1. Verwenden Sie ein Tischsystem Top Anästhesie, um das Tier mit Isofluran zu betäuben. O₂ Tank schalten Sie ein und einstellen Sie der Sauerstoff-Durchflussmesser auf 1 L/min.
2. Legen Sie eine Erwachsene weiblichen C57BL/6J Maus in der Induktion-Kammer. Einschalten und Einstellen des Verdampfers Isoflurane auf 3 % für die Induktion. Die Maus sollte in Narkose innerhalb von 2 min. verwalten Buprenorphin Analgetikum (0,1 mg/kg) subkutan nach Entfernung der Maus aus der Induktion Kammer für präemptiven Analgesie.
   Hinweis: In diesem Protokoll werden weibliche Mäuse verwendet sind einfacher, mit zu arbeiten, während Katheterisierung der Harnröhre. Das Protokoll funktioniert auch für männliche Mäuse, aber besondere Vorsicht ist erforderlich, wenn Schritt 3 ausführen.
3. Gelten Sie ophthalmologischen Salbe für die Augen des Tieres um Trockenheit zu verhindern. Platzieren Sie die narkotisierter Maus nach oben auf ein Heizkissen mit seiner Nase in die bugnase. Schalten Sie die Luft Schaltung Isofluran die bugnase durchlaufen zu lassen.
4. Der Kopf und die bugnase mit Klebeband zurückhalten. Isofluran Vaporizer auf 2 % für die Wartung einstellen.
5. Zurückhalten der Gliedmaßen mit Klebeband. Durchführen Sie Zehe-Prise Tests um sicherzustellen, dass das Tier in Tiefe Narkose und dann rasieren Bauchbereich.

3. Urin Erschöpfung und Blase spülen

1. Gelten Sie Gleitmittel für Katheter (24G, Länge von 2,11 cm, Außendurchmesser von 0,045 cm) und sicherzustellen Sie, dass seine äußere Oberfläche vollständig abgedeckt ist.
2. Einführen Sie den Katheter in die Harnröhre Öffnung und schieben Sie langsam ein, bis zu welchem Zeitpunkt der Urin durch den Katheter abfließen sollte die Blase erreicht. Drücken Sie vorsichtig den Bauch Urin Erschöpfung helfen.
   1. Überprüfen Sie, ob der Katheter in die Blase richtig eingesetzt ist, durch die Beobachtung automatischer Urin out fließen. Vermeiden Sie piercing von der Harnröhre und Blase Wand, und wenden Sie Schmiermittel mehrmals, wenn nötig.
3. Verwerfen Sie den Urin mit einer Pipette in ein Abfall Becherglas.
4. Pipette 80 µL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in das äußere Ende des Katheters, mit dem anderen Ende noch in der Blase. Befestigen Sie eine 1 mL Spritze vorsichtig um den Katheter. Drücken Sie vorsichtig die Spritze, die PBS in der Blase zu injizieren. Lassen Sie einige PBS in den Katheter zu vermeiden, Luftblasen in der Blase.
5. Ziehen Sie die Spritze. Warten Sie auf PBS aus der Blase zu entleeren. Drücken Sie vorsichtig den Bauch, PBS zu evakuieren.
6. Entsorgen Sie die PBS in den Katheter mit einer Pipette in den Abfall Becher.
7. Wiederholen Sie PBS (Waschschritten 3.4-3.6) für zwei weitere Male.
   Hinweis: Es ist wichtig, während diese Waschschritte sanft arbeiten. Blut in den Katheter oder das Fehlschlagen der automatischen Out-Flüssigkeit fließen in der Regel zeigt die Harnröhre durchbohrt. Es ist auch wichtig zur Vermeidung von Luftblasen, die Einführung, wie sie die Elektroporation Effizienz sinkt.

(4) Plasmid Lieferung

1. Gelten Sie 70 % igem Ethanol für die Maus-Bauch und verwenden Sie ein Skalpell, um einen vertikalen Schnitt von 1 cm, öffnen Sie die Bauchhaut oberhalb der Blase machen.
2. Pipette mindestens 20 µL Plasmid Plus Trypan blau-Lösung in das äußere Ende des Katheters, und befestigen Sie die Spritze.
3. Die Plasmid-Lösung in die Blase zu injizieren. Wenn die blase blau leuchtet, ist die Injektion erfolgreich. Lassen Sie etwas Flüssigkeit in den Katheter zu vermeiden, Luftblasen in der Blase.
4. Greifen Sie der äußeren Harnröhrenmündung mit einer Pinzette zu, und entfernen Sie den Katheter und Spritze. Verwenden Sie eine Zeichenfolge an der äußeren Harnröhrenmündung festziehen. Zwei Schleifen mit der Zeichenfolge zu machen und dann mit zwei Knoten binden.
   Hinweis: Verschärfung der die Harnröhre ist wichtig zur Verhinderung von Rückfluss von Plasmid Flüssigkeit.
5. Schalten Sie die Elektroporation-Generator mit den folgenden Parametern: 33V, 50 ms, Arbeitszeit und 950 ms Intervallzeit.
6. Halten Sie die Blase mit einer Pinzette und Klemmen Sie die Blase mit zwei Elektroden. Drücken Sie das Fußpedal die Elektroporation durchführen.
   Hinweis: Die elektrischen Impulse sollen 5 Mal mit kurzen Abständen auftreten, nachdem jedes Pedal drücken. Die Maus kann in diesem Prozess zucken. Schieben das Fußpedal mehr als einmal die Transporteffizienz erhöhen kann, aber zu viele elektrische Impulse können die Gewebe Integrität das Urothel beschädigen.
   1. Vermeiden Sie jeglichen Kontakt zwischen die Pinzette und die Elektroden, da dies einen Funken zu erzeugen.

5. Wiederherstellung

1. Naht der Bauch- und Haut Eröffnung mit sterilen chirurgischen Naht und Clips. Jod auf die Wunde auftragen
2. Entfernen Sie das Tier aus dem Isofluran-System. Verwalten von Buprenorphin Analgetikum (0,1 mg/kg) subkutan, um postoperative Schmerzen zu lindern.
3. Halten Sie das Tier auf das Heizkissen und wieder nach Hause Käfig nach vollständiger Genesung. Überprüfen Sie das Tier mindestens einmal täglich für normale Beweglichkeit, trinken und Fütterung Verhalten und keine Anzeichen einer Infektion, bis der Schnitt verheilt ist und entfernen Sie dann die Clips. Verabreichen Sie nachfolgende Injektionen von Buprenorphin Schmerzmittel, wenn das Tier Schmerzen Symptom zeigt, wie putzen, gesteigerte Aggressivität und Vokalisation reduziert.

Ergebnisse

Um den Erfolg der Gen-Lieferung in die Blase Urothel zu demonstrieren, haben wir die pCAG-GFP¹⁵ Plasmid für Elektroporation verwendet. 20 µL Plasmid und Trypan blau Lösung wurde durch die Harnröhre injiziert und 5 elektrische Impulse verabreicht wurden. Nach 48 h wir seziert die Maus Blase und Flecken von GFP Fluoreszenz unter dem Dissektion-Fluoreszenz-Mikroskop beobachtet, während eine Negative Kontrolle Blase, die nicht unterziehen Elektroporation zeigte ke...

Diskussion

Elektroporation verbessert die Durchlässigkeit der Zellmembran und ist eine leistungsstarke Technologie für gen-Electrotransfer-¹⁶. Gen-Lieferung in lebenden Nagetiere durch Elektroporation wurde häufig in der Neurobiologie Felder^{17,18,19,20,21}verwendet. Seine Anwendungsmöglichkeiten in vielen anderen Organen haben nicht ausgiebig e...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD 1mL TB Syringe	Fisher	148232E
Buprenorphine	Sigma	B9275-50MG
Dumont Tweezers	Roboz Surgical Instr	RS-5005	Treat with 70% ethanol before surgical use
ECM830 SQ Wave Electroporator	Harvard Apparatus	450052
Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters	Fisher Scientific	14-841-21	24G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter
Extra Fine Micro Dissecting Scissors	Roboz Surgical Instr	RS-5135	Treat with 70% ethanol before surgical use
Isoflurane	Vet one	501017
K&H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 Inches	Amazon	n/a	Cover the heat mat with paper towels
Ophthalmic ointment	Fisher	NC0849514
PBS, pH7.4	Life Technologies	10010049
Pipet tips 200 µL	USA Scientific	1111-0206
Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 µL	Fisher	02707438(CS)
PIPETMAN NEO P2	Gilson	F144561
PIPETMAN NEO P200N	Gilson	F144565
plasmid CAG-GFP	Addgene	16664
Platinum tweezertrode 5 mm	Harvard Apparatus	450489	5 mm diameter
Scissors	Roboz Surgical Instr	RS-5880	Treat with 70% ethanol before surgical use
String cord	Amazon	n/a	Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord
Tape, Scotch	Fisher	19047257
Therio-gel Veterinary Lubricant	PBS animal health	353-736
Trypan Blue Stain	Life Technologies	15250061
V-1 Table top system anesthesia	VetEquip	901806
Vicryl violet suture 18" FS-2 cutting 5-0	Fisher	NC0578475
Walgreens Povidone Iodine 10%	Walgreens	953982
Wound clip	Fisher	018045
Wound clip applier	Fisher	01804