הכנת לפתח רקמות היקפיים חוש הריח עבור מולקולרית וניתוח Immunohistochemical ב דרוזופילה

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שלב ומנתחים לפתח חוש הריח רקמות ממינים דרוזופילה . הרקמה ביתור מאוחר יותר ניתן להשתמש עבור ניתוחים מולקולריים, כגון כמותיים RT-PCR (הפוך תמלול-תגובת שרשרת פולימראזית) או RNA רצף (RNAseq), כמו גם ניתוחים ויוו כגון אימונוהיסטוכימיה או בחיי עיר הכלאה.

Abstract

מערכת הריח של דרוזופילה הוא בשימוש נרחב מערכת הנוירו-ביולוגיה התפתחותית, מערכות neuroscience, כמו גם נוירופיזיולוגיה, התנהגות ו אבולוציה התנהגותית. רקמות חוש הריח דרוזופילה בית הנוירונים קולטני ריח (ORNs) לזהות סימנים כימיים נדיפים בנוסף הידרו - ו התרמו-החישה הניריונים. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את הקרע לפתח רקמות היקפיים חוש הריח של המין דרוזופילה למבוגרים. ראשית נתאר כיצד שלב גיל דרוזופילה הזחלים, ואחריה את הקרע של הדיסק antennal הגולמי בשלבים המוקדמים, ואחריה ניתוח מחושיהם שלבים אמצע-הגולמי ומבוגרים. אנו גם מראים שיטות שבו ההכנות יכול להיות מנוצל טכניקות מולקולריות, כגון החילוץ RNA לרביעיית-PCR, RNAseq או אימונוהיסטוכימיה. שיטות אלה ניתן להחיל גם למינים אחרים דרוזופילה לאחר פיתוח הגולמי תלויי מין פעמים נקבעים, בשלבים המתאימים מחושבים להזדקנות המתאים.

Introduction

מערכת הריח של דרוזופילה הוא מערכת הנפוצה הנוירו-ביולוגיה התפתחותית, מערכות neuroscience, כמו גם נוירופיזיולוגיה, לימודי התנהגות ו אבולוציה התנהגותית^{1,2,3, 4}. רקמות חוש הריח דרוזופילה בית הנוירונים קולטני ריח (ORNs) לזהות סימנים כימיים נדיפים בנוסף הידרו - ו התרמו-החישה הניריונים^1,5,6. המטרה הכוללת של כתב יד זה הוא כדי להדגים כיצד שלב ומנתחים לפתח רקמות חוש הריח הגולמי ומבוגרים במינים דרוזופילה . הרציונל של טכניקה זו היא כדי ליצור דוגמאות מתוך שלבים שונים הגולמי עבור ניתוחים התפתחותית המולקולריים של מערכת הריח היקפיים, כגון RNAseq ו- RT-PCR כמותי, בנוסף ויוו רקמת תיוג טכניקות . טכניקה זו יכולה להיות שימושית במיוחד לזהות את הדינמיקה של פרופילים תעתיק במערכת בפיתוח חוש הריח למבוגרים מן הלא -melanogaster דרוזופילה מינים, אשר אין כל ריאגנטים הטרנסגניים עבור סוג התא הספציפי תיוג וניתוחים. כתב יד זה, נדגים כיצד לנתח דיסקים antennal ומחושים ממינים דרוזופילה הגולמי ומבוגרים. ראשית, אנו מראים כיצד לזהות דרוזופילה הו היווצרות puparium (APF, גלמים לבנים או prepupae) עבור הזמני התפתחותית והזדקנות ספציפית. בשלב הבא, אנו מציגים כיצד לנתח דיסקים antennal ו- antennal המגזר השלישי; באופן ספציפי, כיצד לבטל אותם מן העין דיסק קטע antennal שני טוהר רקמת RNAseq או RT-מותני. שלבי ד melanogaster שמתואר פרוטוקול זה בערך שיתאימו הדיסק antennal בדוגמת מראש (prepupae), הבחירה של סימנים מקדימים של antennal דיסק (8 שעות APF), ההתחלה של בידול מסוף עבור ORNs (40 h APF), ו אנטנה למבוגרים. בסופו של דבר, אנחנו נותנים דוגמאות עבור RT-PCR כמותי של אנטנות למבוגרים מבודדים בשיטת, ובשביל ויוו אימונוהיסטוכימיה. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי ליצור דוגמאות עבור ניתוח RNA/DNA, אימונוהיסטוכימיה על פיתוח רקמות היקפיים חוש הריח של מינים שונים דרוזופילה .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

פרוטוקול הבאים הוא תואם ההנחיות האתיקה שנקבעו על-ידי ועדת האתיקה של המחקר באוניברסיטת דיוק.

1. רקמות והכנה הזמני התפתחותית של גולם דרוזופילה melanogaster

1. ראשית, עליך לזהות כמה זבובים יהיה צורך הקרע. RT-PCR, RNAseq, לאסוף 100-200 דיסקים antennal אנטנות מאנשים אשר נחוצים בשלבים prepupal, 8 שעות APF, 40 h APF, ולמבוגרים. עבור אימונוהיסטוכימיה, לנתח אדם 10-20.
2. לנקות את כל החומרים, כולל רפידות לנתיחה, מלקחיים, באמצעות מגבונים לחים עם 70% EtOH. אם החומר והטרף הוא לשמש RNA עקירות, לנקות את הכל עם RNase neutralizers ולעשות כל הפתרונות משתמש ללא נוקלאז או מים מטופלים diethyl pyrocarbonate (DEPC).
   הערה: פרוטוקול זה משתמש רפידות ניתוח סיליקון במקום זכוכית עבור ניתוח. רפידות סיליקון ידידותי מלקחיים ultra-בסדר, לקדם והניתוחים באיכות גבוהה ומהירה.
3. לאסוף גולם לעבר 0 הבמה APF/prepupal.
   1. כדי להבטיח שהצג הזמני, המדויקת ביותר את הזחלים ב 30 דקות ל- 1 h מרווחי.
      הערה: נודד הזחלים לחלל השלישי בבקבוק צפוף למדי סביר להניח pupate תוך מספר שעות.
   2. לאחר הזחלים להיות משותק, מוקפים קל מאוד (כמעט לבן) מקרה הגולמי צבעוניים, להעביר אותם לתוך קטנים 2 - בתוך צלחת פטרי עם נייר סינון לח.
   3. נמשכות h 1-2, מעת לעת ניטור, זיהוי, ולהעביר prepupae.
      הערה: לחלופין, לנקות בקבוק של הגלמים כל ולאפשר את הזחלים לפתח כבר שעתיים. כל הגלמים נאספים אחרי 2 h יהיה בטווח של APF 0 - 2 h.
4. מיד לעבור שלב 3.1 שאנתח את הדיסק antennal prepupal לבמה APF 0 h. אם prepupa צריך ליישן, לאסוף אותם לתוך תבשיל, מכסים את הכלי במקום סרט פרפין בקצוות כדי לעכב יובש, במקום הפטרי בגיל 25 º C.
   הערה: הגלמים יכול עכשיו להיות בני כדי וגיחתו.
5. על הגלמים נאספים בטווח 2 h, גיל את prepupae כבר שעתיים פחות הגיל הרצויה על מנת להבטיח כי הגלמים אין עודף.
6. השתמש בסדר אולטרה מלקחיים (דומונט 55) הרקמה הוא מאוד קטן, שברירי.

2. רקמת והכנה הזמני התפתחותית של גולם ממינים אחרים דרוזופילה

1. כדי לקבוע את משך הפיתוח הגולמי במינים אחרים דרוזופילה , למקם את הדגימות בטמפרטורה אופטימלית את תאריכי מתי prepupae הם נצפו, למיין אותם לתוך בקבוקון טריים, לרשום את מספר הימים prepupa ועד לבגרות.
2. להקליט את היחס בין זמן לפיתוח הגולמי עבור מינים שאינהmelanogaster ועבור melanogaster. הכפל את היחס בין הזמן התפתחותית לפי מספר שעות המשמש להפקת melanogaster כדי לקבל את מספר שעות גיל המין הלא -melanogaster .

3. ניתוח דיסק Antennal הגולמי melanogaster ד

הערה: כל הזדקנות פעמים ואת הפרוטוקולים לנתיחה מתוארים עבור melanogaster דרוזופילה. עבור כל המינים האחרים, שינוי של פרוטוקול ההזדקנות המבוססת על נקודות זמן התפתחותית תלויי מין יידרש, כמתואר לעיל.

1. עבור דיסק antennal הגולמי והניתוחים, לאסוף 50-100 0 - 2 h או 6-8 h הגלמים הישן באמצעות מרית ולמקם אותם על משטח חיתוך.
2. פיפטה µL 150 של RNA בידוד פתרון לתוך RNase microfuge 1.5-mL חינם צינור באמצעות פיפטה של 200-µL ומניחים את הצינורית על קרח.
3. לנתח את הגלמים ב- 150-200 µL ל- 1 x PBS (buffered פוספט תמיסת מלח, ללא נוקלאז). במקום מספר טיפות של PBS (150-200 µL לכל droplet) על משטח חיתוך.
4. על משטח חיתוך, מקום של 0 - 2 h או 6-8 h בגילאי גלמי (גולם אחד לכל טיפה) ניסויים באחד ה 1 x טיפות PBS. להשתמש מלקחיים ביד אחת כדי לייצב את הגוף.
5. עבור 0 - 2 h בני הגלמים, באמצעות מלקחיים ביד אחרים, להחזיק לחלק הקדמי ביותר (ווים הפה) prepupa, תוציא את זה החוצה כדי לחשוף את המוח ואת דמותי הדיסקים המחוברים לתיק הגולמי הקדמי.
6. עבור 8 שעות APF הגלמים, תחילה בעדינות לקלף את המקרה הגולמי מהעיר הקדמי ביותר של הגולם, לחשוף את הראש בתוך השק קרום העוטף את הגוף.
   הערה: הגוף, בשלב זה, נראה כמו זחל המתנוונת.
7. הסר את הראש צוואר המשותפת.
   הערה: פעולה זו מבטיחה כי הדיסקים antennal לא יאבדו, אשר בשלב זה קשורים בעיקר האונות הראייה של המוח.
8. להעביר את רקמת המוח, הדיסקים דמותי עוד 1 x droplet PBS באמצעות מלקחיים או על פיפטה 20-µL.
9. לזהות את הדיסק עין-antennal מחובר אל המוח-האונות אופטיים. באמצעות מלקחיים, נתק את הדיסק עין-antennal את המוח ואת המקרה הגולמי. . להעביר אותו אחד x droplet PBS באמצעות מלקחיים או פיפטה 20-µL
   הערה: הדיסק עין-antennal prepupal הוא רקמה שטוח. עם זאת, על-ידי הגלמים 8 שעות, הדיסקים העין מסובבות cupping הדיסקים antennal, אשר יושב והשתרשה עמוק בלבה המוח המרכזי.
10. באמצעות מלקחיים, חותכים את הרקמה באתר של הקשר בין העין לבין הדיסק antennal. להשתמש על פיפטה 20-µL להעביר הרקמה ביתור בעדינות לתוך RNA בידוד פתרון הכימית. למזער את כמות הנוזל שהועברו על-ידי pipetting סכום קטן ככל האפשר.
11. חזור עד הגלמים כל יש כבר גזור.

4. ניתוח melanogaster ד אמצע-הגולמי ומחושים למבוגרים

הערה: מאת 40 h APF, הרוב המכריע של הגלגול השלם, המבנים למבוגרים הופכים לכאורה, אבל הם עדיין לבנים, ייחוד. בשלב זה הזמן התפתחותית, האנטנה למבוגרים לקח את צורתה הסופית אך עדיין הוא שקוף, הרוב המכריע של קולטני הריח, מלבד כמה, לא התחלת הביטוי.

1. עבור ניתוח antennal הגולמי, לאסוף 50-100 prepupae כפי שמתואר בשלב 1, גיל אותם עבור h 40-25 º C.
2. Pipet 150 µL של RNA פתרון הבידוד לתוך microcentrifuge 1.5-mL חינם RNase צינור באמצעות pipet 200-µL ומניחים את הצינורית על קרח.
3. על משטח חיתוך, במקום הגולם ניסויים לאחד 1 x טיפות PBS. להשתמש מלקחיים ביד אחת כדי לייצב את הגוף. באמצעות מלקחיים וביד השנייה, לקלף בעדינות. את המקרה הגולמי מהעיר הקדמי ביותר של הגולם, לחשוף את הראש בתוך השק קרום העוטף את הגוף
4. באמצעות מלקחיים, בזהירות לחתוך את הראש משאר חלקי הגוף הגולמי על ידי החזקת הגוף בעזרת ערכה אחת של מלקחיים לשדוד את הראש על הצוואר משותפת עם עוד זוג מלקחיים. בעדינות להעביר את הראש לתוך עוד 1 x droplet PBS באמצעות מלקחיים. פיפטה למעלה ולמטה כדי לנקות את התוכן של הראש (המוח, וכדומה) כדי לקבל קרום צלול זה המשמש להקפת ראשו דרוזופילה המתפתח.
   הערה: ב- 40-50 h APF, מחושיהם מחוברים אל המקטע הקדמי ביותר של הקרום. הם יהפכו לעין עבור ניתוח כאשר התוכן של הראש נמחקים עם pipetting.
5. באמצעות מלקחיים, נתק מחושיהם הגולמי של הקרום. נתק על קטע 2^nd של האנטנה 3^rd באמצעות מלקחיים פרוסה המשותפת סגמנטלי, כפי רק על קטע 3^rd יהיה בית הנוירונים קולטני ריח.
6. להשתמש על פיפטה 20-µL להעביר הרקמה ביתור בעדינות לתוך RNA בידוד פתרון הכימית. למזער את כמות הנוזל שהועברו על-ידי pipetting סכום קטן ככל האפשר. חזור עד הגלמים כל יש כבר גזור.
7. ניתוח antennal למבוגרים, לאסוף כ 50 מבוגרים, גיל אותם עבור וגיחתו פוסט שבוע.
   הערה: הביטוי של גנים קולטני ריח וגם אחרות הגנים שיא שבוע אחרי וגיחתו. המבוגרים הם בגילאי במשך שבוע להבטיח גנים ביולוגית רלוונטית תעתיקי שפע נמוך להתעלות מעל לסף גילוי.
8. עבור ה-RNA עקירות, לנתח זבובים כאשר הם עדיין חיים על משטח₂ CO. פנקו את הפנקס₂ CO עם מעכבי RNase. עבור הדמיה קונאפוקלית, לנתח את הזבובים על משטח חיתוך 1 x PBS או PBS + 0.2% טריטון.
9. ראשית, שים המבוגרים לישון על משטח התחנה₂ CO מתחת למיקרוסקופ לנתיחה. על משטח התחנה של₂ CO באמצעות מלקחיים ביד אחת כדי לייצב את הגוף, להשתמש מלקחיים וביד השנייה כדי בעדינות משיכה/קמצוץ החוצה קטע שלישי antennal מן השני.
10. העברת מחושיהם לתוך פתרון בידוד ה-RNA, באמצעות מלקחיים כדי למקם את האנטנה ישירות לתוך הנוזל. חזור עד מבוגרים יש כבר גזור.
    הערה: ודא כי מחושיהם טובע בפתרון בידוד ה-RNA. מחושיהם ייתכן נתקעות בצד של הצינור. זה יגרום של השפלה מוגברת של RNA, הפחתת כמות ואיכות של RNA.
11. ישירות להמשיך החילוץ RNA או מקם את הצינור ב-80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.

5. RNA בידוד רקמות גזור

1. להסיר את כל הדגימות מהמחסן-80 ° C, להפשיר אותם על קרח.
2. בקצרה ספין (5-6 s, g x ~ 6,000) כל דגימה כדי לאסוף את החומר בתחתית הצינורית.
3. לטחון כל דגימה באמצעות שהעקב פלסטיק של בלוק מנוע חשמלי עבור 10 s על קרח.
4. חזור על שלבים 5.2 ו- 5.3 4.
5. לבצע את החילוץ RNA באמצעות ערכות זמינים מסחרית ובעקבות הפרוטוקולים של היצרן עבור תשואה האופטימלית.
6. לבצע לרביעיית-PCR תוך שימוש זמינים מסחרית ריאגנטים ספציפיים primers נגד גנים עניין ובעקבות הפרוטוקולים של היצרן.
   1. לבצע את כל תגובות PCR תוך שימוש בתנאים הבאים: דנטורציה 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ואחריו 40 מחזורי 95 ° C 15 s, 55 ° C ל 30 s, ו- 60 ° C ל 30 s.
      הערה: פריימר זוגות עבור גנים DIP ו dpr המפורטים בטבלה1, צבעי יסוד גנים קולטני ריח מפורטים Hueston CE. et al. ⁸.

6. קיבוע של דיסקים Antennal הגולמי, אנטנה עבור אימונוהיסטוכימיה

הערה: לתקן את הרקמות בקבוצות של 10-20 אנשים כדי להבטיח שהרקמות קבועות עבור אותה כמות זמן. למזער את כמות הזמן שהדגימות להישאר PBT (PBS עם חומר ניקוי) לפני אכלוסם לשבועיים כדי למקסם את התקינות של הרקמות.

1. לאסוף הדיסקים antennal גזור או אנטנה הגולמי צינור PCR 200-µL המכיל 200 µL של 0.2% PBT על קרח כדי לשמור על שלמות רקמות, וכדי למנוע את הדגימה של דבק הקיר של ה-PCR 200-µL צינורות שיוביל קיבעון לא שלם.
   הערה: אנטנות הגולמי ודיסקים antennal יכול להיות קשה לראות כפי שהם שקופים למדי. רצוי להשתמש טווח ניתוח עבור כל שלבי הכביסה כדי למנוע אובדן של רקמת. לחלופין, צלחות Terasaki 96-ובכן עשוי להיות משמש הקיבעון מכתימים לעקוב בצורה הטובה ביותר את הרקמה.
2. לתקן את דיסק antennal גזור ודוגמאות antennal מן הגלמים כ-200 µL של 4% מחברים (Paraformaldehyde) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בשביל זה ובעקבות צעדים, לשמור את הצינורות עם הדגימות על nutator כראוי לערבב את הדגימות בפתרון. ההתקדמות לשלב 6.7.
3. עבור האנטנה למבוגרים, לנתח את הראש כולו קודם ולתקן את זה כ-200 µL של 4% מחברים (paraformaldehyde) לשעה בטמפרטורת החדר.
4. לשטוף 3 x עם 200 µL של 0.2% PBT למשך 10 דקות. שומרים את הדגימות-nutator בזמן הדגירה.
5. לחזור למיקרוסקופ לנתיחה על הקרע עדינה יותר של המקטע השני antennal מראשן קבוע. באמצעות מלקחיים כדי לייצב את הראש, בעדינות משיכה/קמצוץ החוצה קטע שלישי antennal מן השני.
6. להעביר את מקטעי antennal השלישי גזור כ-200 µL של 4% מחברים (paraformaldehyde) ולתקן אותם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
7. לשטוף 3 x עם 200 µL של 0.2% PBT למשך 10 דקות. שומרים את הדגימות-nutator בזמן הדגירה.
8. לאחסן את הדגימות ב 4 ° C או להמשיך ישירות עם אימונוהיסטוכימיה הר שלמה.
   הערה: היעילות של צביעת עשויים להשתנות כאשר הנוגדן נמצא בשימוש. שיטה זו צריכה להיות נוגדנים המתאימים פחות חלבון בשפע תגיות או חלש יותר. עם זאת, לעיתים, זה עשוי לדרוש לאופטימיזציה של הפרוטוקול (זהות או כמות מקבע או את הזמן של קיבוע).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הרקמה ביתור חוש הריח המתפתח יכול לשמש לחילוץ RNA ואחריו RT-PCR כדי להעריך ביטוי גנים או יכול להיתפס באמצעות פרוטוקולים אימונוהיסטוכימיה כדי לקבוע את דפוס הביטוי שלו, לוקליזציה תת הסלולר של הגנים של ריבית. בחלק זה, אנו מציגים תוצאות נציג או פרוטוקול. איור 1 הוא ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פרוטוקול זה הוא משאב שימושי עבור מעבדות מעוניין לזהות את גנטי תעתיק ותוכניות הפעלה בפיתוח דרוזופילה רקמות חוש הריח, כמו גם ניתוח השוואתי של תוכניות אלה על פני דרוזופילה מינים. זה שימושי במיוחד אם מערכות ברמת פרופילים תעתיק של שלבים התפתחותיים שונים נדרשים בתור פריימר עבור מחקרי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X Phosphate-buffered Saline	Gibco	70011-044	Dilute to 1X in RNase free water
CO2 tank	Air Gas	CD R200
Two sharp forceps (Dumont #55)	Fine Science Tools	11255-20
Trizol	Invitrogen	15596-026	RNA isolation solutions
Dissecting Microscope
Small bucket with ice
P20 and P200 micropipettes and tips
1.7 mL Microfuge tubes			Purchase nuclease free for best results
0.2 mL PCR tubes
Paraformaldehyde powder	Polysciences	380
10% Triton X-100	Teknova	T1105	Dilute to 0.2% v/v in 1X PBS
2" petri dishes
55mm filter paper	Whatman	1001-055	Wet with water and place in a petri dish to keep pupae moist
25 C incubator
deionized H2O			Purchase nuclease free or treat with DEPC
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning		to be used for making dissection pads from Terizaki plate covers.
MicroWell Mini Trays with lids	Nunc	438733	Lids can be used to make silicone dissection pads
Rabbit anti-GFP antibody	MBL international corpor	PM005	primary antibody
Mouse anti RAT CD2	AbD seroTec	MCA154RHDL	primary antibody
ADL195 (anti lamin, mouse)	Dev studies hydoma ban	ADL195-s	primary antibody
Alexa Fluor® 488 goat anti-rabbit IgG (H+L)	invitrogen	A11008	Secondary antibody
Cy3 Goat Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-166-003	Secondary antibody
Triton X-100, Protein Grade Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered	CALBIOCHEM	648463	detergent
Lab Rotator	Thermo scientific		Rotator
Nuclease Free Water	Growcells.com	NUPW-0125	Water
Light-Duty Tissue Wipers	VWR	82003-822	For cleaning dissection supplies
Superscript II	invitrogen	18064014	Reverse Transcriptase
QIAshredder (50)	RNA extraction	QIAGEN	79654
Oligo(dT)12-18 Primer	RT	life technologies	18418012
RNeasy MinElute Cleanup Kit (50)	RNA extraction	QIAGEN	74204
FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN)	qPCR	Roche	04913850001
FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER	qPCR	Roche	06402712001
LIGHTCYCLER 480 - MULTIWELL PLATE 96	qPCR	Roche	04729692001
NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix	qPCR	NEB	M0541S