Preparando a desenvolver tecido olfativo periférico para Molecular e análise imuno-histoquímica em Drosophila

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para estágio e dissecar a desenvolver o tecido olfativo de espécies de Drosophila . O tecido dissecado mais tarde pode ser usado para análises moleculares, como quantitativa de RT-PCR (Reverse transcrição-Polymerase Chain Reaction) ou RNA sequenciamento (RNAseq), bem como na vivo de análise como a imuno-histoquímica ou em situ hibridização.

Resumo

O sistema olfativo de Drosophila é um sistema amplamente utilizado em neurobiologia do desenvolvimento, neurociência de sistemas, bem como neurofisiologia, comportamento e evolução comportamental. Drosófila olfativos tecidos casa os neurônios olfactory do receptor (ORNs) que detectam sugestões químicas voláteis, além dos neurônios-hidro e thermo-sensorial. Neste protocolo, descrevemos a dissecação de desenvolver tecido olfativo periférico da espécie Drosophila adulto. Primeiro, descrevemos como fase e idade larvas de Drosophila , seguidas pela dissecação do disco da antena de primeiros estágios pupal, seguidos pela dissecação de antenas de adultos e estágios meados-pupal. Mostramos também métodos onde as preparações podem ser utilizadas em técnicas moleculares, tais como a extração de RNA para qRT-PCR, RNAseq ou imuno-histoquímica. Esses métodos também podem ser aplicados a outras espécies de Drosophila , após desenvolvimento pupal espécie-específicos são determinados e respectivas fases são calculados para envelhecimento adequado.

Introdução

O sistema olfativo de Drosophila é um sistema amplamente utilizado em neurobiologia do desenvolvimento, neurociência de sistemas, bem como neurofisiologia, estudos de comportamento e evolução comportamental^{1,2,3, 4}. Drosófila olfativos tecidos casa os neurônios olfactory do receptor (ORNs) que detectam sinais químicos voláteis além de neurônios sensoriais hidro - e thermo^1,5,6. O objetivo geral do presente manuscrito é demonstrar como estágio e dissecar desenvolvimento pupal e adulto tecido olfativo em espécies de Drosophila . A justificativa para esta técnica é para gerar amostras de diferentes estágios pupal para análises moleculares e no desenvolvimento do sistema olfativo periférico, tais como RNAseq e RT-PCR quantitativo, além na vivo tecido técnicas de rotulagem . Esta técnica pode ser especialmente útil para identificar a dinâmica do transcriptional perfis no sistema olfativo em desenvolvimento adulto da espécie non -melanogaster da drosófila , que não dispõem de todos os reagentes transgênicos para o tipo de célula específico rotulagem e análises. Neste manuscrito, demonstramos como dissecar discos da antena e antenas de espécies de Drosophila pupa e adultas. Primeiro, mostramos como identificar Drosophila 0 h de formação do casulo (APF, pupas brancas ou pré-pupa) para preparo do desenvolvimento e envelhecimento espécie-específicos. Em seguida, mostramos como dissecar os discos da antena e o terceiro segmento da antena; especificamente, como dissociar o disco do olho e o segundo segmento da antena para a pureza de tecido necessária para RNAseq ou RT-PCR. Os estágios no d. melanogaster descrito neste protocolo aproximadamente correspondem ao disco da antena previamente padronizado (pré-pupa), a seleção de precursores da antena de disco (8 h APF), o início da diferenciação terminal para ORNs (40 h/a APF), e antena de adulta. Finalmente, damos exemplos para um RT-PCR quantitativo de antenas adultas isoladas usando o método e por imuno-histoquímica na vivo . Esse método pode ser usado para gerar amostras para uma análise de DNA/RNA e imuno-histoquímica no desenvolvimento de tecidos periféricos olfativos, de diferentes espécies de Drosophila .

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Protocolo

O seguinte protocolo é consistente com as diretrizes de ética estabelecidas pelo Comitê de ética de pesquisa Universidade Duke.

1. tecido preparação e encenação do desenvolvimento da Drosophila melanogaster Pupa

1. Em primeiro lugar, identifica quantas moscas serão necessárias para a dissecação. Por RT-PCR e RNAseq, colete 100-200 discos da antena e antenas de indivíduos que são necessários nas fases prepupal, de 8 h APF, 40 h/a APF e adulto. Por imuno-histoquímica, disse o indivíduo 10-20.
2. Limpar todos os materiais, incluindo almofadas de dissecação e fórceps, usando lenços com 70% EtOH. Se o material dissecado é para ser usado para extração de RNA, limpar tudo com neutralizador de RNase e fazer todas as soluções usando uma nuclease-livre ou pyrocarbonate de dietilo (DEPC) água tratada.
   Nota: Este protocolo usa almofadas de dissecação do silicone em vez de vidro para as dissecções. Almofadas do silicone são simpáticos a fórceps ultra-fina e promovem dissecações rápidas e de alta qualidade.
3. Recolha a pupa à h 0 palco APF/prepupal.
   1. Para garantir a encenação mais precisa, monitore as larvas em 30 min com intervalos de 1 h.
      Nota: Errante terceiro ínstar larvas numa garrafa moderadamente lotada serão provavelmente pupate dentro de algumas horas.
   2. Uma vez que as larvas ficam imobilizadas e estão rodeadas por um caso de pupa muito leve (quase branco) colorido, transferi-los para uma pequena 2 - em placa de Petri com papel de filtro úmido.
   3. Continue por 1-2 h, ocasionalmente monitoramento, identificação e transferência de pré-pupa.
      Nota: Como alternativa, limpar uma garrafa de todas as pupas e permitem que as larvas desenvolver para 2h. Todas as pupas coletadas após 2h será dentro de um intervalo APF 0 - 2 h.
4. Afastar-se imediatamente para o passo 3.1 para dissecar o disco da antena prepupal para a fase APF h 0. Se o prepupa precisa ser envelhecido, recolhê-los em um prato, cubra o prato e coloque uma película de parafina em torno das bordas para inibir a secura e coloque o prato de Petri a 25 ° C.
   Nota: As pupas podem agora ser envelhecidas a eclosão.
5. Para pupas coletadas em um intervalo de 2 h, era a pré-pupa por 2 h a menos do que a idade desejada a fim de assegurar que as pupas não excedente.
6. Use o fórceps ultra-fina (Dumont 55) como o tecido é muito pequeno e frágil.

2. tecido preparação e encenação do desenvolvimento da Pupa de outras espécies de Drosophila

1. Para determinar o comprimento do desenvolvimento pupal em outras espécies de Drosophila , coloque as amostras à temperatura ideal, gravar as datas quando a pré-pupa é observadas, classificá-los dentro de um frasco de fresco e registrar o número de dias de prepupa a idade adulta.
2. Recorde a proporção de tempo para desenvolvimento pupal para espécies não -melanogaster e melanogaster. Multiplica a relação do tempo do desenvolvimento pelo número de horas utilizadas para encenar melanogaster para obter o número de horas de idade das espécies não -melanogaster .

3. dissecação do disco da antena Pupal de d. melanogaster

Nota: Todas as vezes de envelhecimento e protocolos de dissecação são descritos por melanogaster da drosófila. Para todas as outras espécies, uma modificação do protocolo de envelhecimento com base em pontos de tempo de desenvolvimento específicas serão necessária, como descrito acima.

1. Para dissecções do disco da antena pupal, coletar 50-100, 0 - 2 h ou pupas velho 6-8 h, usando uma espátula e coloque-os sobre uma almofada de dissecação.
2. Pipete 150 µ l de solução de isolamento de RNA para um RNase livre microcentrífuga de 1,5 mL com uma pipeta de 200 µ l de tubo e colocar o tubo no gelo.
3. Disse as pupas em 150-200 µ l de 1X PBS (tampão fosfato solução salina, livre de nuclease). Coloca várias gotículas de PBS (150-200 µ l por gotículas) na rampa de dissecação.
4. Na rampa de dissecação, coloque o 0 - 2 h ou pupas de 6-8 h envelhecido (uma pupa por gota) para ser dissecado em um do 1x gotículas de PBS. Use o fórceps em uma mão para estabilizar o corpo.
5. Para o 0 - 2 h envelhecido pupas, usando fórceps na outra mão, segure a parte mais anterior (os ganchos de boca) o prepupa e puxe-o para expor o cérebro e os discos imaginária anexados ao caso anterior pupal.
6. Para as pupas APF de 8 h, primeiro suavemente Descole o pupa caso do bairro mais anterior da pupa, expondo a cabeça dentro do saco de membrana que envolve o corpo.
   Nota: O corpo, nesta fase, se parece com uma larva de degeneração.
7. Remova a cabeça na articulação do pescoço.
   Nota: Isso garante que os discos da antena não serão perdidos, que nesta fase estão ligados principalmente a óptica lóbulos do cérebro.
8. Transferi o tecido com o cérebro e os discos imaginária para outro 1x gotículas de PBS usando fórceps ou uma pipeta de 20 µ l.
9. Identifica o olho-antena disco conectado ao cérebro em lóbulos óptica. Usando fórceps, desconecte-o olho-antena disco o cérebro e o caso de pupa. Transferi-lo para um novo 1x gotículas de PBS usando fórceps ou uma pipeta de 20 µ l.
   Nota: O disco olho-antena prepupal é um tecido liso. No entanto, pelas pupas de 8 h, os discos de olho são girados colocando os discos da antena, que se senta à frente do cérebro central.
10. Usando a pinça, corte o tecido no local da conexão entre o olho e o disco da antena. Use uma pipeta de 20 µ l para transferir suavemente o tecido dissecado para o reagente de solução de isolamento de RNA. Minimize a quantidade de líquido transferido pipetando uma quantidade tão pequena quanto possível.
11. Repita até que todas as pupas tem sido dissecadas.

4. dissecação de d. melanogaster Mid-pupa e adulto antenas

Nota: Por 40 h APF, a maioria da metamorfose é completa, e as estruturas de adultas são evidentes, mas são ainda branco e anódino. Neste ponto do tempo do desenvolvimento, a antena adulta tomou sua forma final, no entanto, ainda é transparente e a maioria dos receptores de olfativo, com exceção de alguns, não ter começado a expressão.

1. Para dissecções antenais pupal, coletar 50-100 pré-pupa, conforme descrito na etapa 1 e idade-los para 40 h/a 25 ° C.
2. Pipetar 150 µ l de solução de isolamento de RNA em uma RNase livre microcentrifuga de 1,5 mL tubo utilizando uma pipeta de 200 µ l e colocar o tubo no gelo.
3. Na rampa de dissecação, coloque a pupa para ser dissecado em um do 1x gotículas de PBS. Use o fórceps em uma mão para estabilizar o corpo. Usando fórceps na outra mão, retire suavemente o caso pupal do bairro mais anterior da pupa, expondo a cabeça dentro do saco de membrana que envolve o corpo.
4. Usando a pinça, cuidadosamente corte a cabeça do resto do corpo pupal, mantendo o corpo com um conjunto de pinças e arrancando a cabeça no colo da conjunta com outro conjunto de pinças. Transferi suavemente a cabeça outro 1x gotículas de PBS usando fórceps. Pipete para cima e para baixo para limpar o conteúdo da cabeça (o cérebro, etc.) para obter uma membrana clara que costumavam cercar a cabeça de Drosophila em desenvolvimento.
   Nota: A 40-50 h APF, as antenas estão ligadas à seção anterior-a maioria da membrana. Eles se tornarão aparentes para dissecação quando o conteúdo da cabeça é limpas com pipetagem.
5. Usando fórceps, desconecte as antenas pupal da membrana. Desconecte o segmento 2^nd da antena 3^rd usando fórceps a fatia na articulação segmentar, como apenas o segmento de 3^rd vai abrigar os neurônios olfactory do receptor.
6. Use uma pipeta de 20 µ l para transferir suavemente o tecido dissecado para o reagente de solução de isolamento de RNA. Minimize a quantidade de líquido transferido pipetando uma quantidade tão pequena quanto possível. Repita até que todas as pupas tem sido dissecadas.
7. Para adultas antenais dissecações, coletar aproximadamente 50 adultos e idade-los para uma pós-eclosão semana.
   Nota: A expressão de genes de receptores olfativos e outros genes pico uma semana após a eclosão. Os adultos são envelhecidos por uma semana para garantir biologicamente relevantes genes com transcrições de baixa abundância a subir acima do limite de deteção.
8. Para extração de RNA, disse moscas enquanto eles ainda estão vivos em uma almofada de₂ CO. Trate o CO₂ pad com inibidores de RNase. Para a imagem latente confocal, dissecar as moscas num bloco de dissecação em 1X PBS ou PBS + 0,2% Triton.
9. Primeiro, coloca os adultos para dormir na plataforma de estação de CO₂ , no âmbito de dissecação. No pad Estação CO₂ , usando a pinça na mão para estabilizar o corpo, use fórceps na outra mão para gentilmente puxe/pitada para fora o terceiro segmento da antena do segundo.
10. Transferi as antenas para uma solução de isolamento de RNA, usando a pinça para colocar as antenas diretamente no líquido. Repita até que todos os adultos têm sido dissecados.
    Nota: Certifique-se que as antenas estão submersos em solução de isolamento de RNA. A antena pode ficar preso na lateral do tubo. Isso fará com que uma maior degradação do RNA, reduzindo a quantidade e a qualidade do RNA.
11. Diretamente, prossiga para a extração do RNA ou colocar o tubo a-80 ° C para armazenamento a longo prazo.

5. RNA isolamento dos tecidos dissecados

1. Remova todas as amostras do armazenamento-80 ° C e descongelá-los no gelo.
2. Brevemente gire (5-6 s, ~ 6.000 x g), cada amostra para coletar o material na parte inferior do tubo.
3. Moer cada amostra usando um pilão de plástico esterilizado e um motor elétrico para 10 s no gelo.
4. Repita os passos de 5,2 e 5,3 4.
5. Realize a extração do RNA usando kits comercialmente disponíveis e seguindo o protocolo do fabricante para um rendimento ideal.
6. Execute qRT-PCR utilizando primers específicos contra os genes de interesse e seguindo os protocolos do fabricante e reagentes disponíveis comercialmente.
   1. Realizar todas as reações de PCR usando as seguintes condições: desnaturação de 95 ° C por 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C por 15 s, 55 ° C por 30 s e 60 ° C por 30 s.
      Nota: Pares de Primer para mergulho e dpr genes estão listados na tabela 1, e primers para genes olfactory do receptor são listados no CE Hueston et al ⁸.

6. fixação dos discos antenais Pupal e antenas para imuno-histoquímica

Nota: Corrigi os tecidos em lotes de 10 a 20 indivíduos para assegurar que os tecidos são fixos para a mesma quantidade de tempo. Minimize a quantidade de tempo que as amostras fiquem em PBT (PBS com detergente) antes de transferi-las para um fixador para maximizar a integridade dos tecidos.

1. Recolher os discos antenais dissecados ou pupal antenas em um tubo PCR de 200 µ l contendo 200 µ l de 0,2% PBT no gelo para manter a integridade do tecido e para evitar a amostra da colagem na parede de 200 µ l do PCR tubos que levará a uma fixação incompleta.
   Nota: Antenas Pupal e discos da antena podem ser difícil de ver como eles são completamente translúcidos. É aconselhável usar um escopo de dissecação para todas as etapas de lavagem para evitar qualquer perda de tecido. Alternativamente, placas de 96 poços Terasaki podem ser usado para a fixação e coloração para controlar melhor o tecido.
2. Corrigir o disco da antena dissecado e amostras da antena de pupas em aproximadamente 200 µ l de 4% PFA (paraformaldeído) por 30 min à temperatura ambiente. Por isto e subsequentes etapas, manter os tubos com as amostras em um nutator para misturar corretamente as amostras na solução. Progresso para a etapa de 6,7.
3. Para a antena de adulta, dissecar a cabeça primeiro e corrigi-lo em aproximadamente 200 µ l de 4% PFA (paraformaldeído) por 1h à temperatura ambiente.
4. Lavar 3x com 200 µ l de 0,2% PBT por 10 min cada. Mantenha as amostras no nutator durante a incubação.
5. Volte para o microscópio de dissecação para dissecção mais fino do segundo segmento da antena das cabeças fixas. Usando o fórceps para estabilizar a cabeça, suavemente puxe/pitada para fora o terceiro segmento da antena do segundo.
6. Transferir os segmentos antenais terceiros dissecados em aproximadamente 200 µ l de 4% PFA (paraformaldeído) e corrigi-los por 30 min à temperatura ambiente.
7. Lavar 3x com 200 µ l de 0,2% PBT por 10 min cada. Mantenha as amostras no nutator durante a incubação.
8. Armazenar as amostras em 4 ° C ou continuar diretamente com toda montagem immunohistochemistry.
   Nota: A eficiência de coloração pode mudar quando o anticorpo está sendo usado. Este método deve ser apropriados para menos etiquetas de proteína abundante ou mais fracos de anticorpos. No entanto, às vezes, ele pode requerer uma otimização do protocolo (a identidade ou quantidade do fixador ou o tempo de fixação).

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Resultados

O tecido olfativo em desenvolvimento dissecado pode ser usado para a extração de RNA, seguida por RT-PCR para avaliar a expressão do gene ou pode ser tomado através de protocolos de imuno-histoquímica para determinar seu padrão de expressão e a sub celular localização de genes de interesse. Nesta seção, apresentamos resultados representativos de qualquer protocolo. A Figura 1 é o representante RT-PCR quantitativo mostrando a transcrição dos gene...

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Discussão

Este protocolo é um recurso útil para laboratórios interessados em identificar os programas genéticos e transcriptional operando no desenvolvimento de tecido olfativo de Drosophila , bem como uma análise comparativa destes programas através de Drosophila espécies. É especialmente útil se sistemas-nível transcricionais perfis de diferentes estádios de desenvolvimento são necessários como um primer para futuros estudos. O protocolo descrito aqui demonstra como estágio e isolar a desenvolver ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X Phosphate-buffered Saline	Gibco	70011-044	Dilute to 1X in RNase free water
CO2 tank	Air Gas	CD R200
Two sharp forceps (Dumont #55)	Fine Science Tools	11255-20
Trizol	Invitrogen	15596-026	RNA isolation solutions
Dissecting Microscope
Small bucket with ice
P20 and P200 micropipettes and tips
1.7 mL Microfuge tubes			Purchase nuclease free for best results
0.2 mL PCR tubes
Paraformaldehyde powder	Polysciences	380
10% Triton X-100	Teknova	T1105	Dilute to 0.2% v/v in 1X PBS
2" petri dishes
55mm filter paper	Whatman	1001-055	Wet with water and place in a petri dish to keep pupae moist
25 C incubator
deionized H2O			Purchase nuclease free or treat with DEPC
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning		to be used for making dissection pads from Terizaki plate covers.
MicroWell Mini Trays with lids	Nunc	438733	Lids can be used to make silicone dissection pads
Rabbit anti-GFP antibody	MBL international corpor	PM005	primary antibody
Mouse anti RAT CD2	AbD seroTec	MCA154RHDL	primary antibody
ADL195 (anti lamin, mouse)	Dev studies hydoma ban	ADL195-s	primary antibody
Alexa Fluor® 488 goat anti-rabbit IgG (H+L)	invitrogen	A11008	Secondary antibody
Cy3 Goat Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-166-003	Secondary antibody
Triton X-100, Protein Grade Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered	CALBIOCHEM	648463	detergent
Lab Rotator	Thermo scientific		Rotator
Nuclease Free Water	Growcells.com	NUPW-0125	Water
Light-Duty Tissue Wipers	VWR	82003-822	For cleaning dissection supplies
Superscript II	invitrogen	18064014	Reverse Transcriptase
QIAshredder (50)	RNA extraction	QIAGEN	79654
Oligo(dT)12-18 Primer	RT	life technologies	18418012
RNeasy MinElute Cleanup Kit (50)	RNA extraction	QIAGEN	74204
FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN)	qPCR	Roche	04913850001
FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER	qPCR	Roche	06402712001
LIGHTCYCLER 480 - MULTIWELL PLATE 96	qPCR	Roche	04729692001
NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix	qPCR	NEB	M0541S