周辺嗅覚組織の開発を準備する分子とショウジョウバエの免疫組織化学的解析

要約

ここでは、ステージし、解剖ショウジョウバエ種から嗅覚の組織を開発するためのプロトコルを提案する.解剖組織は、免疫組織化学または上皮内などの生体内解析だけでなく、定量的 RT-PCR (逆転写ポリメラーゼ連鎖反応) や RNA 配列 (RNAseq) などの分子生物学的解析の後で使用できます。交配。

要約

ショウジョウバエの嗅覚は発達神経生物学、システム神経科学、神経生理学、行動、行動の進化で広く使われているシステムです。ショウジョウバエ嗅覚組織の水力発電と熱感覚ニューロンに加え揮発性化学手掛かりを検出嗅覚受容神経細胞 (ORNs) 家します。このプロトコルでは大人のショウジョウバエ種の嗅覚の末梢組織の開発の解剖について述べる。最初にステージングして、半ば蛹と大人からアンテナの解剖によって続いて蛹初期から続く、触角の解剖によってショウジョウバエ幼虫の年齢方法について述べる。我々 も準備を qRT PCR、RNAseq、または免疫組織化学の RNA の抽出など、分子生物学の手法で活用できるメソッドに示します。これらのメソッドは、種特異的な蛹の発育度の決定、および適切な高齢化の各段階の計算後、他のショウジョウバエの種に適用もできます。

概要

発達神経生物学、システム神経科学、神経生理学、行動学、行動の進化^{1,2,3、ショウジョウバエの嗅覚システムは広く使用されているシステム 4}。ショウジョウバエ嗅覚組織の水力発電と熱感覚ニューロン^1,5,6に加えて揮発性化学手掛かりを検出嗅覚受容神経細胞 (ORNs) 家します。この原稿の全体的な目標は、ステージおよびショウジョウバエ種の蛹と大人の嗅覚組織の開発を分析する方法を示すことです。この技術のための理論的根拠は体内組織ラベリング技術にさらに RNAseq、定量的 RT-PCR など、周辺の嗅覚システムの分子・発達的分析に蛹の段階からサンプルを生成するには.この手法は、特定型のセルのすべての遺伝子導入試薬を持っていない非キイロショウジョウバエ ショウジョウバエの種から開発大人嗅覚システムの転写プロファイルのダイナミクスを識別する特に役立ちますラベリングと分析。本稿では、触角のディスクと蛹と大人のショウジョウバエ種からアンテナを分析する方法を示します。まず、ショウジョウバエの蛹殻形成過程 (APF、白い蛹や前蛹) 発達のステージングと種特異的な高齢化のための 0 h を識別する方法を示します。次に、触角ディスクと 3 番目の触角セグメントを分析する方法を示す具体的には、目のディスクと RNAseq または RT-Pcr に必要な組織の純度の第 2 触角セグメントからそれらを分離する方法。キイロショウジョウバエ約このプロトコルで記述されている段階対応済みパターンの触角 (前蛹)、前駆体、触角からの選択ディスク (8 h APF) ORNs (40 h APF) の分化の開始とアダルト アンテナ。メソッドを使用して分離された大人アンテナからと生体内での免疫組織化学の最後に、我々 は、定量的 RT-PCR 法の例を与えます。このメソッドは、RNA ・ DNA 分析、ショウジョウバエ種から末梢の嗅覚組織の開発に免疫組織化学のサンプルを生成する使用できます。

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プロトコル

次のプロトコルは、デューク大学研究倫理委員会の倫理規範と一致。

1. 組織ショウジョウバエ蛹の発育の準備及び

1. まず、どのように多くのハエが郭清の必要があります。RT-PCR および RNAseq は、前、8 h APF、40 h APF、および大人の段階で必要である個人から 100-200 触角ディスクと触角を収集します。免疫組織の個々 の 10-20 を解剖します。
2. 郭清パッドおよび鉗子、70% のワイプを使用してを含むすべての材料をきれい江藤。切り裂かれた材料は RNA の抽出に使用する RNase 中和剤できれい、ヌクレアーゼ フリーのいずれかを使用してすべてのソリューションまたはピロ炭酸ジエチルエステル (DEPC) 処理水。
   注: このプロトコルは、ガラスではなく、解離の解離のシリコン パッドを使用します。シリコン パッドは超微細鉗子にやさしい、高速かつ高品質の解離を促進します。
3. 0 h APF/前ステージで蛹を収集します。
   1. 最も正確なステージングを確認するには、30 分を 1 時間間隔で幼虫を監視します。
      注: やや混雑したボトルで放浪 3 齢幼虫は数時間以内は蛹可能性が高い。
   2. 幼虫は不動なり非常に軽い (ほぼ白) 色蛹ケースに囲まれている、一度、小 2 で湿ったろ紙を敷いたシャーレに転送します。
   3. 1-2 時間、時折監視、識別、および前蛹の転送を続けます。
      注: または、すべて蛹のボトルをオフにし、幼虫は、2 h の開発を許可します。すべての蛹は、APF 範囲 2 h が 0 - 2 h になります後に収集されました。
4. ステップ 3.1 0 h APF ステージ前の触角を解剖するすぐに移動します。イラガ前蛹が熟成する場合は、皿にそれらを収集、カバー皿とパラフィン膜の乾燥を抑制するエッジの周りを配置し、25 ° C にペトリ皿を配置
   注: 蛹は、羽化に今老化することができます。
5. 蛹は 2 h の範囲で収集の蛹がないことを確保するために 2 h 希望年齢未満の前蛹を年齢超過。
6. 組織が非常に小さく、壊れやすい、超微細鉗子 (デュモン 55) を使用します。

2. 組織他のショウジョウバエの種から蛹の発達の準備及び

1. 他ショウジョウバエ種の蛹の発育日数を調べるには、最適な温度でサンプルを配置、前蛹を観察するときの日付を記録、新鮮なバイアルに並べ替えたり、イラガ前蛹から成人期までの日数数を記録します。
2. 非キイロショウジョウバエ種とキイロショウジョウバエの蛹の発育のための時間の割合を記録します。キイロショウジョウバエのステージング非キイロショウジョウバエ種を年齢に時間の数を取得するために使用時間の数によって発達の時間の割合を乗算します。

3.ショージョーバエ ・蛹の触角の郭清

注: すべてのエージング時間と解剖のプロトコルの説明がキイロショウジョウバエ。他のすべての種のため、種特異的な発達時期に基づく高齢化プロトコルの変更は、前述のよう、必要になります。

1. 蛹の触角解剖の 50 100 0 - 2 h やヘラを使用して 6 ~ 8 h 古い蛹を収集し、郭清パッドの上に置きます。
2. RNA 分離ソリューションの 150 μ L のピペット、RNase フリー 1.5 mL および microfuge 200 μ L ピペットを使用してチューブし、チューブを氷の場所に。
3. 1 × PBS (リン酸緩衝生理食塩水、ヌクレアーゼ フリー) の 150-200 μ L 中の蛹を解剖します。郭清パッドに PBS (液滴あたり 150-200 μ L) の複数の滴を配置します。
4. 郭清パッド PBS 滴 × 1 のいずれかで切り裂かれる 0 - 2 h または歳 6-8 h 蛹 (1 ドロップ 1 つ蛹) を配置します。体を安定させるために片方の手で鉗子を使用します。
5. 0 - 2 h 蛹、イラガ前蛹の最も前方部分 (口フック) する一方、ホールドで鉗子を用いた高齢者し、脳と前蛹の場合に添付成虫ディスクを公開するそれを引き出します。
6. 8 h APF 蛹の最初を慎重にはがし本体を囲む膜の袋内のヘッドを公開、蛹の最も前の四半期から蛹ケース。
   注: ボディ、この段階でように見えます変性幼虫。
7. ネック ジョイントの頭を削除します。
   注: これにより、触角のディスクが、失われないだろうことをこの段階では主に脳の視葉に接続しています。
8. 脳と成虫ディスク組織を鉗子または 20 μ L ピペットを使用して PBS 液滴 x 別 1 に転送します。
9. 視葉で脳に接続された目触角のディスクを識別します。鉗子を使用して、脳と蛹のケースから目触角を外します。鉗子または 20 μ L ピペットを使用して PBS 液滴 x 新しい 1 に転送します。
   注: 前の目触角ディスク、フラット組織です。ただし、8 h 蛹目ディスクは回転カッピング触角ディスク中央の脳の前方に座っています。
10. 鉗子を使用すると、目と触角のディスク間の接続のサイトでティッシュをカットします。20 μ L ピペットを使用して、優しく RNA 分離液試薬に切り裂かれたティッシュを転送します。できるだけ小さく量をピペットで転送される液体の量を最小限に抑えます。
11. この操作を繰り返して、すべての蛹を解剖しました。

4.ショージョーバエ ・半ば-蛹とアダルト アンテナの郭清

注: 40 h APF、変容の大部分が完了し、大人の構造、明らかになっているが、まだ白と目立たない。この発達の時点でアダルト アンテナその最終的な形をとっているけれどもまだ透明には、嗅覚受容体の少数を除いて、大半が式を開始していません。

1. 蛹の触角の解剖の手順 1 で説明したように 50-100 の前蛹を収集し、25 ° C で 40 h の年齢
2. ピペット 150 μ L の RNA 分離ソリューションに RNase フリー 1.5 mL 遠心チューブ 200 μ L ピペットを使用して、チューブを氷の場所します。
3. 郭清パッド PBS 滴 x 1 の 1 つに切り裂かれる蛹を配置します。体を安定させるために片方の手で鉗子を使用します。鉗子を使用すると、もう一方の手で、体を取り巻く膜袋内のヘッドを公開、蛹の最も前の四半期から蛹のケースを慎重にはがし。
4. 鉗子のセットが付いているボディを押し、鉗子の別のセットを持つ共同首で頭をリッピング蛹の体の残りの部分から頭を切って鉗子を使用して、慎重に。優しく鉗子を使用して PBS 液滴 x 別 1 に頭を転送します。上下のピペット ヘッド開発ショウジョウバエの頭部を囲む明確な膜を取得する (脳、等) の内容をきれいにします。
   注: 40-50 h で APF、アンテナ膜の前方のセクションに接続しています。ピペッティングで頭の内容が消去されるとき、彼らは郭清の明白になります。
5. 鉗子を使用して、膜から蛹のアンテナを外します。3 からアンテナの 2^ndセグメントを切断^rd 3^rdのセグメントだけが嗅覚受容ニューロンの家として区域の共同でスライスに鉗子を使用します。
6. 20 μ L ピペットを使用して、優しく RNA 分離液試薬に切り裂かれたティッシュを転送します。できるだけ小さく量をピペットで転送される液体の量を最小限に抑えます。この操作を繰り返して、すべての蛹を解剖しました。
7. 大人の触角解剖の約 50 大人を収集し、一週間後羽化の年齢します。
   注: 嗅覚受容体遺伝子の発現と他の遺伝子はピーク羽化後一週間です。大人生体関連遺伝子検出のしきい値を超えて上昇する低豊富の成績証明書を確保するため一週間熟成します。
8. RNA の抽出、CO₂パッドの上まだ生きている間ハエを解剖します。RNase 阻害剤と CO₂パッドを扱います。共焦点レーザー顕微鏡の解剖 1 × PBS または PBS + 0.2% で解剖パッドに乗って飛ぶトリトン。
9. 郭清範囲の下で CO₂駅パッド上で寝る大人はまず、置きます。CO₂駅パッドは、体を安定させるために片方の手で鉗子を使用して 2 番目から 3 番目の触角セグメントを優しくプル/ピンチにもう一方の手で鉗子を使用します。
10. 液体に直接アンテナを配置する鉗子を使用して RNA 分離ソリューションにアンテナを移します。この操作を繰り返して、すべての大人を解剖しました。
    注: は、アンテナが RNA の分離ソリューションに沈んでいることを確認します。アンテナは、チューブの側面に残ることがあります。これは、rna の増加低下を RNA の品質と量を減らすことが生じます。
11. 直接 RNA の抽出に進むか、長期保存のための-80 ° c チューブを配置します。

5 切り裂かれたティッシュから RNA の隔離

1. -80 ° C の記憶域からすべてのサンプルを削除し、氷の上にそれらを解凍します。
2. 簡単にスピン (5-6 s, ~ 6,000 x g) 各サンプル チューブの下部に資料の収集をします。
3. 10 のオートクレーブ養生プラスチック杵と電気モーターを使用して各サンプルを挽く氷上 s。
4. 5.2 と 5.3 の 4 の手順を繰り返します。
5. 市販のキットを使用して、次の最適な収率の製造元のプロトコル、RNA の抽出を実行します。
6. 市販試薬、遺伝子興味のそして次の製造元のプロトコルに対して特異的プライマーを用いた qRT PCR を実行します。
   1. 次の条件を使用してすべての PCR 反応を行う: 95 ° C 10 分の変性に続いて 40 サイクル 95 ° C の 15 s、55 ° C、30 s、および 30 ° C、60 s。
      注:ディップとdprの遺伝子のプライマーは、表 1に記載されて、嗅覚受容体遺伝子のプライマーは、Hueston CEらに表示されます。⁸。

6. 蛹触角ディスクと免疫組織化学のアンテナの固定

注: は、10-20 個人、組織、時間の同じ量の修正の確認からバッチで組織を修正します。サンプルは、組織の完全性を最大化する定着剤にそれらを転送する前に PBT (洗剤で PBS) で滞在時間の量を最小限に抑えます。

1. 収集切り裂かれた触角ディスクまたは 0.2% の 200 μ L を含む 200 μ L の PCR チューブに蛹のアンテナ PBT 氷の上、組織の整合性を維持し、200 μ L の PCR の壁に付着してからサンプルを避けるためには不完全な固定につながる管します。
   注: 蛹触角と触角ディスクかなり半透明を参照してくださいすることは困難にすることができます。組織の損失を防ぐためにすべての洗浄のステップの郭清範囲を使用することをお勧めします。また、96-well テラサキ プレート固定用に使用されると最適組織に管理する染色があります。
2. 4% の約 200 μ L で蛹から解剖の触角と触角のサンプルを修正 PFA (パラホルムアルデヒド) 室温で 30 分間。これおよびそれに続く手順は正しくソリューションのサンプルを混ぜて nutator にサンプル チューブを維持します。6.7 のステップに進みます。
3. アダルト アンテナ頭全体をまず解剖 4% の約 200 μ L でそれを修正、PFA (パラホルムアルデヒド) 室温で 1 時間。
4. 0.2% の 200 μ L で 3 x を洗って 10 分 PBT です。孵化の間に、nutator のサンプルを保ちます。
5. 固定ヘッドからの第 2 触角セグメントの細かい解剖の解剖顕微鏡へ戻る。頭を安定させる、2 番目から 3 番目の触角セグメントを優しくプル/ピンチに鉗子を使用してください。
6. 4% の約 200 μ L に切り裂かれた第 3 触角セグメントを移す PFA (パラホルムアルデヒド) し、室温で 30 分間それらを修正します。
7. 0.2% の 200 μ L で 3 x を洗って 10 分 PBT です。孵化の間に、nutator のサンプルを保ちます。
8. 4 ° C で試料を保存か全体マウント免疫組織化学的に直接進みます。
   注: 抗体が使用されていると、染色の効率が変わります。このメソッドは、以下の豊富なタンパク質タグの適切なまたは弱い抗体をする必要があります。しかし、時に、それは (アイデンティティまたは固定液の量や固定の時間) プロトコルの最適化を必要があります。

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結果

切り裂かれた発展途上の嗅覚組織遺伝子発現を評価する RT-PCR による RNA 抽出の使用ことができますまたはその表現パターンとの遺伝子の細胞内の局在を決定する免疫プロトコルによって取ることができます。関心します。このセクションのいずれかのプロトコルからの代表的な結果を提案する.図 1は、代表定量的 RT-PCR 野生型アダルト アンテナ...

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ディスカッション

この議定書は遺伝子と転写プログラム開発ショウジョウバエ嗅覚組織だけでなく、これらのプログラムの比較分析ショウジョウバエで動作を識別するのに興味を持って実験室のための有用なリソース種。それは、将来の研究のためのプライマーとしてさまざまな発達段階からシステム レベルの転写プロファイルが必要な場合に便利です。ここで説明されているプロトコルはステ...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X Phosphate-buffered Saline	Gibco	70011-044	Dilute to 1X in RNase free water
CO2 tank	Air Gas	CD R200
Two sharp forceps (Dumont #55)	Fine Science Tools	11255-20
Trizol	Invitrogen	15596-026	RNA isolation solutions
Dissecting Microscope
Small bucket with ice
P20 and P200 micropipettes and tips
1.7 mL Microfuge tubes			Purchase nuclease free for best results
0.2 mL PCR tubes
Paraformaldehyde powder	Polysciences	380
10% Triton X-100	Teknova	T1105	Dilute to 0.2% v/v in 1X PBS
2" petri dishes
55mm filter paper	Whatman	1001-055	Wet with water and place in a petri dish to keep pupae moist
25 C incubator
deionized H2O			Purchase nuclease free or treat with DEPC
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning		to be used for making dissection pads from Terizaki plate covers.
MicroWell Mini Trays with lids	Nunc	438733	Lids can be used to make silicone dissection pads
Rabbit anti-GFP antibody	MBL international corpor	PM005	primary antibody
Mouse anti RAT CD2	AbD seroTec	MCA154RHDL	primary antibody
ADL195 (anti lamin, mouse)	Dev studies hydoma ban	ADL195-s	primary antibody
Alexa Fluor® 488 goat anti-rabbit IgG (H+L)	invitrogen	A11008	Secondary antibody
Cy3 Goat Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-166-003	Secondary antibody
Triton X-100, Protein Grade Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered	CALBIOCHEM	648463	detergent
Lab Rotator	Thermo scientific		Rotator
Nuclease Free Water	Growcells.com	NUPW-0125	Water
Light-Duty Tissue Wipers	VWR	82003-822	For cleaning dissection supplies
Superscript II	invitrogen	18064014	Reverse Transcriptase
QIAshredder (50)	RNA extraction	QIAGEN	79654
Oligo(dT)12-18 Primer	RT	life technologies	18418012
RNeasy MinElute Cleanup Kit (50)	RNA extraction	QIAGEN	74204
FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN)	qPCR	Roche	04913850001
FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER	qPCR	Roche	06402712001
LIGHTCYCLER 480 - MULTIWELL PLATE 96	qPCR	Roche	04729692001
NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix	qPCR	NEB	M0541S