Préparer le développement de tissu olfactif périphérique pour moléculaire et analyse Immunohistochemical chez la drosophile

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour organiser et disséquer à développer le tissu olfactif des espèces de drosophile . Le tissu découpé peut ensuite être utilisé pour des analyses moléculaires, comme quantitative RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) ou l’ARN séquençage (RNAseq), ainsi que des analyses in vivo , comme immunohistochemistry ou in situ hybridation.

Résumé

Le système olfactif de la drosophile est un système largement utilisé dans la neurobiologie développementale, neurosciences des systèmes, ainsi que neurophysiologie, comportement et évolution comportementale. Des tissus de drosophile olfactifs maison les neurones récepteurs olfactifs (ORN) détectant les signaux chimiques volatils en plus des neurones hydro - et thermo-sensorielle. Dans ce protocole, nous décrivons la dissection de mettre au point des tissus périphériques olfactif de l’espèce de drosophile adulte. Tout d’abord, nous décrivons comment organiser et l’âge des larves de drosophile , suivies par la dissection du disque antennaire de premiers stades nymphales, suivies par la dissection des antennes des adultes et de milieu-pupal étapes. Nous montrons également les méthodes où les préparations doivent être utilisées dans les techniques moléculaires, tels que l’extraction de l’ARN pour qRT-PCR, RNAseq ou immunohistochimie. Ces méthodes peuvent également être appliquées à d’autres espèces de drosophile après temps de développement nymphal spécifique à l’espèce sont déterminés et stades respectifs sont calculés pour le vieillissement approprié.

Introduction

Le système olfactif de la drosophile est un système largement utilisé dans la neurobiologie développementale, neurosciences des systèmes, ainsi que neurophysiologie, études de comportement et évolution comportementale^{1,2,3, 4}. Des tissus de drosophile olfactifs abritent les neurones récepteurs olfactifs (ORN) détectant les signaux chimiques volatils en plus de l’hydro - et thermo-sensorielle neurones^1,5,6. L’objectif global de ce manuscrit est de démontrer comment organiser et disséquer développant des pupe et adult tissu olfactif chez les espèces de drosophile . La justification de cette technique consiste à produire des échantillons de différents stades nymphales analyses moléculaires et du développement du système olfactif périphérique, tels que RNAseq et RT-PCR quantitative, en outre à in vivo des tissus techniques de marquage . Cette technique peut être particulièrement utile pour identifier la dynamique des profils de transcriptionnelles dans le développement du système olfactif adult des espèces non -melanogaster de drosophile , qui n’ont pas tous les réactifs transgéniques pour le type de cellule spécifique labels et analyses. Dans ce manuscrit, nous démontrons comment disséquer les disques antennaires et antennes d’espèce Drosophila pupe et adulte. Tout d’abord, nous montrons comment identifier Drosophila 0 h de formation puparium (APF, nymphes blanches ou prénymphes) mise en scène du développement et du vieillissement spécifique à l’espèce. Ensuite, nous montrons comment disséquer les disques antennaires et le troisième segment antennaire ; plus précisément, comment les désolidariser le disque oculaire et l’antennaire deuxième pour la pureté de tissu nécessaire pour RNAseq ou RT-PCR. Les étapes chez d. melanogaster décrit dans le présent protocole, à peu près correspondent à des motif disque antennaire (prénymphes), la sélection des précurseurs de l’antennaire disc (8 h CSA), le début de la différenciation terminale pour Orn (40 h CSA), et antenne adulte. Enfin, nous donner des exemples pour une RT-PCR quantitative d’antennes adultes isolés à l’aide de la méthode et pour en vivo immunohistochemistry. Cette méthode peut être utilisée pour générer des échantillons pour l’analyse de l’ARN/ADN et immunohistochimie sur le développement des tissus périphériques olfactives provenant de différentes espèces de drosophile .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

Le protocole suivant est compatible avec les orientations de l’éthique mis en place par le Duke University Research Ethics Committee.

1. tissu préparation et développement mise en scène de Drosophila melanogaster Pupa

1. Tout d’abord, identifiez les mouches combien sera nécessaires pour la dissection. Pour la RT-PCR et RNAseq, collecter 100-200 disques antennaires et antennes émanant de particuliers qui sont nécessaires aux stades prénymphal, de 8 h CSA, 40 h CSA et adulte. Pour immunohistochemistry, disséquer individu de 10-20.
2. Nettoyer tous les matériaux, y compris les plaquettes de dissection et forceps, à l’aide de lingettes avec 70 % EtOH. Si la substance découpée pour être utilisé pour les extractions de RNA, de nettoyer le tout avec des agents neutralisants RNase et de faire toutes les solutions en utilisant soit exempte de nucléase ou diéthyl pyrocarbonate (DEPC) l’eau traitée.
   Remarque : Ce protocole utilise des tampons de dissection de silicone au lieu de verre pour les dissections. Coussinets silicone sont sympathiques à pince ultra-fine et promouvoir les dissections de rapides et de qualité.
3. Recueillir la nymphe à la 0 h stade prénymphal/CSA.
   1. Afin d’assurer la mise en scène plus précise, surveiller les larves à 30 min à 1 h d’intervalle.
      NOTE : Errant troisième stade larvaire dans une bouteille modérément bondée va probablement se transforment en pupes en quelques heures.
   2. Une fois que les larves deviennent immobiles et sont entourés de très clair (presque blanc) couleur pupe, transférez-les dans un petit 2 - en boîte de Pétri avec papier filtre humide.
   3. Continuer pendant 1-2 h, suivi de temps en temps, identifier et le transfert prénymphes.
      NOTE : Sinon, effacer une bouteille de toutes les pupes et permettre les larves à développer pendant 2 h. Toutes les nymphes, recueillies après que 2 h sera dans une fourchette de CSA 0 - 2 h.
4. Immédiatement, passez à l’étape 3.1 à disséquer le disque antennaire prénymphal pour la scène de CSA 0 h. Si la prépupale doit être vieillies, les recueillir dans un plat, couvrir le plat et placer un film de paraffine sur les bords pour empêcher le dessèchement et placez la boîte de Pétri à 25 ° C.
   Remarque : Les pupes peuvent maintenant être âgés à éclosion.
5. Pour les nymphes recueillies dans un intervalle de 2 h, ans les prénymphes pendant 2 h de moins que l’âge désiré afin de s’assurer que les nymphes ne sont pas dépassement.
6. Utilisation ultra fines pinces (Dumont 55) comme le tissu est très petit et fragile.

2. tissu préparation et mise en scène du développement de nymphe des autres espèces de drosophile

1. Pour déterminer la longueur du développement pupe chez d’autres espèces de drosophile , placer les échantillons à une température optimale, enregistrer les dates quand on observe les prénymphes, triez-les dans un nouveau flacon et noter le nombre de jours de prépupale à l’âge adulte.
2. Enregistrer le rapport des temps pour le perfectionnement nymphe pour les espèces non -melanogaster et melanogaster. Multipliez le rapport entre la durée du développement par le nombre d’heures utilisé pour la stadification melanogaster pour obtenir le nombre d’heures jusqu'à l’âge de l’espèce non -melanogaster .

3. dissection du disque antennaire pupes de d. melanogaster

Remarque : Tous les temps de vieillissement et tous les protocoles de dissection sont décrites pour Drosophila melanogaster. Pour toutes les autres espèces, une modification du protocole vieillissement issu des points dans le temps de développement propres à chaque espèce sera requise, tel que décrit ci-dessus.

1. Pour les dissections de pupes disque antennaire, recueillir 50-100 0 - 2 h ou pupes vieux de 6 à 8 heures à l’aide d’une spatule et placez-les sur un socle de dissection.
2. Pipetter 150 µL de solution d’isolation du RNA dans une RNase free microtubes de 1,5 mL de tube à l’aide d’une pipette de 200 µL et placer le tube sur la glace.
3. Disséquer les pupes dans les 150-200 µL de PBS 1 x (solution saline tamponnée au phosphate, exempte de nucléase). Placez plusieurs gouttes de PBS (150-200 µL par goutte) sur la tablette de dissection.
4. Sur le pavé de la dissection, placer le 0 - 2 h ou pupes h 6-8 ans (une nymphe par goutte) pour être disséqués dans l’un des 1 x gouttelettes de PBS. Utilisez des pinces dans une main pour stabiliser le corps.
5. Pour les 0 - 2 h âgés de nymphes, avec une pincette dans l’autre main, maintenez sur la partie plus antérieure (les crochets de la bouche) de la prépupale et retirez-la pour exposer les cerveaux et les disques imaginaux attachés à la pupe antérieur.
6. Pour les nymphes de CSA 8 h, d’abord doucement décoller la pupe par rapport au trimestre antérieur de plus de la pupe, exposer la tête dans le sac de la membrane qui entoure le corps.
   Remarque : Le corps, à ce stade, ressemble à une larve de dégénérescence.
7. Sortez la tête au niveau du joint de cou.
   NOTE : Ceci fait en sorte que les disques antennaires ne seront pas perdus, qui à ce stade sont liées principalement aux lobes optiques du cerveau.
8. Transférer le tissu avec le cerveau et les disques imaginaux un autre 1 x gouttelette de PBS à l’aide de pinces ou une pipette 20 µL.
9. Identifier le disque oeil-antennaire connecté au cerveau dans les lobes optiques. À l’aide de pinces, débranchez le disque oeil-antennaire du cerveau et de la pupe. Transférer vers un nouveau 1 x gouttelette de PBS à l’aide de pinces ou une pipette 20 µL.
   Remarque : Le disque prénymphal eye-antennaire est un tissu plat. Cependant, par les nymphes de 8 h, les disques de le œil sont tournées ventouses les disques antennaires, qui se trouve devant le cerveau central.
10. À l’aide de pinces, coupez le tissu à l’endroit de connexion entre le œil et le disque antennaire. Utiliser une pipette de 20 µL de transférer doucement le tissu découpé dans le réactif de solution d’isolement ARN. Réduire la quantité de liquide transféré en pipettant également, un montant aussi faible que possible.
11. Répétez jusqu'à ce que toutes les nymphes ont été disséqués.

4. dissection de d. melanogaster Mid-pupes et adultes antennes

Remarque : 40 h CSA, la majorité de la métamorphose est complète, et les structures adultes deviennent apparentes, mais sont encore blanches et indéfinissable. À ce moment du développement, l’antenne adulte a pris sa forme définitive mais est toujours transparente et la majorité des récepteurs olfactifs, à l’exception de quelques uns, n’ont pas commencé expression.

1. Pour les dissections antennaires pupes, recueillir 50-100 prénymphes, tel que décrit à l’étape 1 et leur âge pendant 40 h à 25 ° C.
2. Ajouter 150 µL de solution d’isolation du RNA dans un microtubes de 1,5 mL gratuit RNase tube à l’aide d’une pipette de 200 µL et placer le tube sur la glace.
3. Sur le pavé de la dissection, placez la pupe à être disséqué dans l’une des 1 x gouttelettes de PBS. Utilisez des pinces dans une main pour stabiliser le corps. Avec une pincette en revanche, décollez délicatement la pupe par rapport au trimestre antérieur de plus de la pupe, exposer la tête dans le sac de la membrane qui entoure le corps.
4. À l’aide de pinces, découpez soigneusement la tête du reste du corps de nymphe en tenant le corps avec un jeu de pinces et en arrachant la tête au cou en collaboration avec un autre ensemble de pinces. Transférer délicatement la tête dans un autre 1 x gouttelette de PBS avec une pincette. Pipetter en haut et en bas pour nettoyer le contenu de la tête (le cerveau, etc.), afin d’obtenir une membrane claire utilisé pour entourer la tête en développement de la drosophile .
   Remarque : À 40-50 h CSA, les antennes sont connectés à la section la plus antérieure de la membrane. Ils deviendront apparents pour la dissection lorsque le contenu de la tête est effacé avec la pipette.
5. Avec une pincette, débrancher les antennes pupes de la membrane. Débranchez le segment 2^nd de l’antenne de la 3^rd avec une pincette à trancher au niveau du joint segmentaire, car seul le segment 3^rd abritera les neurones récepteurs olfactifs.
6. Utiliser une pipette de 20 µL de transférer doucement le tissu découpé dans le réactif de solution d’isolement ARN. Réduire la quantité de liquide transféré en pipettant également, un montant aussi faible que possible. Répétez jusqu'à ce que toutes les nymphes ont été disséqués.
7. Pour les dissections antennaires adultes, recueillir environ 50 adultes et leur âge pour une éclosion après semaine.
   Remarque : L’expression des gènes des récepteurs olfactifs et autres gènes pic une semaine après l’éclosion. Les adultes sont vieillis pendant une semaine assurer biologiquement pertinentes gènes transcrits de faible abondance s’élever au-dessus du seuil de détection.
8. Pour les extractions de RNA, disséquer les mouches alors qu’ils sont encore en vie sur une garniture de CO₂ . Traiter le CO₂ pad avec des inhibiteurs de la RNase. Pour l’imagerie confocale, disséquer les mouches sur une plateforme de dissection dans 1 x PBS ou PBS + 0,2 % Triton.
9. Tout d’abord, mettre les adultes dormir sur le pad de station CO₂ dans le cadre de la dissection. Sur le pavé de la station₂ CO, à l’aide de forceps dans une main pour stabiliser le corps, utiliser forceps en revanche pour doucement tirer/manchon sur le troisième segment antennaire dès la seconde.
10. Transférer les antennes dans une solution d’isolation du RNA, avec une pincette pour placer les antennes directement dans le liquide. Répétez jusqu'à ce que tous les adultes ont été disséqués.
    Remarque : Vérifiez que les antennes soient immergés dans la solution d’isolation du RNA. Les antennes se bloquent sur les bords du tube. Cela entraînera une augmentation de la dégradation de l’ARN, réduire la quantité et la qualité de la RNA.
11. Directement, procédez à l’extraction de l’ARN ou placer le tube à-80 ° C pour le stockage à long terme.

5. isolement de tissus disséqués

1. Retirez tous les échantillons de l’entreposage de-80 ° C et les décongeler sur la glace.
2. Brièvement, spin (5-6 s, ~ 6 000 x g) chaque échantillon pour recueillir le matériel au fond du tube.
3. Moudre de chaque échantillon à l’aide d’un pilon en plastique autoclavable et un moteur électrique pour 10 s sur la glace.
4. Répétez les étapes 5.2 et 5,3 4.
5. Effectuer l’extraction de l’ARN à l’aide de kits disponibles dans le commerce et à la suite de protocoles par le fabricant pour un rendement optimal.
6. Effectuer qRT-PCR en utilisant des réactifs disponibles dans le commerce et les amorces spécifiques contre les gènes d’intérêt et à la suite des protocoles par le fabricant.
   1. Effectuer toutes les réactions de PCR utilisant les conditions suivantes : dénaturation de 95 ° C pendant 10 min suivi de 40 cycles de 95 ° C pendant 15 s, 55 ° C pendant 30 s et 60 ° C pendant 30 s.
      Remarque : Des paires d’amorces pour gènes DIP et RMR sont répertoriés dans le tableau 1et amorces pour des gènes de récepteurs olfactifs sont répertoriés dans CE Hueston et al. ⁸.

6. fixation des disques antennaires pupes et antennes pour Immunohistochemistry

NOTE : Fixer les tissus par lots de 10 à 20 personnes pour s’assurer que les tissus sont fixés pour le même laps de temps. Réduire la quantité de temps que les échantillons restent en PBT (PBS avec un détergent) avant de les transférer sur un fixatif pour maximiser l’intégrité des tissus.

1. Recueillir les disques antennaires disséqués ou antennes pupes dans un tube PCR de 200 µL contenant 200 µL de 0,2 % PBT sur glace pour maintenir l’intégrité des tissus et d’éviter l’échantillon de coller à la paroi de 200 µL PCR tubes qui conduira à une fixation incomplète.
   Remarque : Les antennes pupes et disques antennaires peuvent être difficiles à voir car ils sont tout à fait translucides. Il est conseillé d’utiliser une portée de dissection pour toutes les étapes de lavage pour éviter toute perte de tissu. Alternativement, plaques à 96 puits Terasaki peuvent être utilisé pour la fixation et coloration pour mieux suivre le tissu.
2. Difficulté le disque antennaire disséqué et les échantillons antennaires de pupe dans environ 200 µL de 4 % PFA (paraformaldéhyde) pendant 30 min à température ambiante. Pour cela et les suivantes étapes, garder les lampes avec les échantillons sur un nutator pour bien mélanger les échantillons dans la solution. Progrès réalisés à l’étape de 6,7.
3. Pour l’antenne adulte, disséquer la tête entière tout d’abord et le fixer à environ 200 µL de 4 % PFA (paraformaldéhyde) pendant 1 h à température ambiante.
4. Laver 3 x avec 200 µL de 0,2 % PBT pour 10 min chacun. Conserver les échantillons sur le nutator au cours de l’incubation.
5. Revenir au microscope à dissection pour une dissection plus fine du second segment antennaire des têtes fixes. À l’aide de pinces pour stabiliser la tête, doucement tirer/manchon sur le troisième segment antennaire dès la seconde.
6. Transférer les troisième antennaires disséqués dans environ 200 µL de 4 % PFA (paraformaldéhyde) et fixez-les pendant 30 min à température ambiante.
7. Laver 3 x avec 200 µL de 0,2 % PBT pour 10 min chacun. Conserver les échantillons sur le nutator au cours de l’incubation.
8. Stocker les échantillons à 4 ° C ou continuer directement avec l’ensemble Mont immunohistochimie.
   Remarque : L’efficacité de la coloration peut changer lorsque l’anticorps est utilisé. Cette méthode doit être apte à moins de balises de protéine abondante ou faibles des anticorps. Cependant, parfois, il peut nécessiter une optimisation du protocole (soit l’identité ou quantité du fixateur ou le temps de fixation).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Le tissu olfactif en développement disséqué peut être utilisé pour l’extraction de l’ARN suivie par RT-PCR pour évaluer l’expression des gènes ou peut être pris par le biais de protocoles d’immunohistochemistry pour déterminer son modèle d’expression et la localisation subcellulaire des gènes de intérêt. Dans cette section, nous présentons des résultats représentatifs de chaque protocole. La figure 1 est le représentant RT-PCR quant...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Ce protocole est une ressource utile pour les laboratoires intéressés d’identifier les programmes génétiques et transcriptionnelles opérant dans le développement de la drosophile tissu olfactif, en plus d’une analyse comparative de ces programmes à travers de la drosophile espèces. Il est particulièrement utile si les systèmes au niveau transcriptionnels profils de différentes étapes du développement sont nécessaires comme une amorce pour de futures études. Le protocole décrit ici il...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X Phosphate-buffered Saline	Gibco	70011-044	Dilute to 1X in RNase free water
CO2 tank	Air Gas	CD R200
Two sharp forceps (Dumont #55)	Fine Science Tools	11255-20
Trizol	Invitrogen	15596-026	RNA isolation solutions
Dissecting Microscope
Small bucket with ice
P20 and P200 micropipettes and tips
1.7 mL Microfuge tubes			Purchase nuclease free for best results
0.2 mL PCR tubes
Paraformaldehyde powder	Polysciences	380
10% Triton X-100	Teknova	T1105	Dilute to 0.2% v/v in 1X PBS
2" petri dishes
55mm filter paper	Whatman	1001-055	Wet with water and place in a petri dish to keep pupae moist
25 C incubator
deionized H2O			Purchase nuclease free or treat with DEPC
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning		to be used for making dissection pads from Terizaki plate covers.
MicroWell Mini Trays with lids	Nunc	438733	Lids can be used to make silicone dissection pads
Rabbit anti-GFP antibody	MBL international corpor	PM005	primary antibody
Mouse anti RAT CD2	AbD seroTec	MCA154RHDL	primary antibody
ADL195 (anti lamin, mouse)	Dev studies hydoma ban	ADL195-s	primary antibody
Alexa Fluor® 488 goat anti-rabbit IgG (H+L)	invitrogen	A11008	Secondary antibody
Cy3 Goat Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-166-003	Secondary antibody
Triton X-100, Protein Grade Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered	CALBIOCHEM	648463	detergent
Lab Rotator	Thermo scientific		Rotator
Nuclease Free Water	Growcells.com	NUPW-0125	Water
Light-Duty Tissue Wipers	VWR	82003-822	For cleaning dissection supplies
Superscript II	invitrogen	18064014	Reverse Transcriptase
QIAshredder (50)	RNA extraction	QIAGEN	79654
Oligo(dT)12-18 Primer	RT	life technologies	18418012
RNeasy MinElute Cleanup Kit (50)	RNA extraction	QIAGEN	74204
FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN)	qPCR	Roche	04913850001
FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER	qPCR	Roche	06402712001
LIGHTCYCLER 480 - MULTIWELL PLATE 96	qPCR	Roche	04729692001
NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix	qPCR	NEB	M0541S