ההפרדה של תרד תילקואיד חלבון מתחמי מאת מקורית ירוק בג'ל ואפיון הלהקה באמצעות Time-Correlated סופר פוטון יחיד

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להפריד בין מתחמי תילקואיד solubilized על ידי הילידים בג'ל ירוק. להקות ג'ל ירוק לאחר מכן מאופיינים על ידי הזמן בקורלציה יחיד פוטון לספור (TCSPC) ומסופקים שלבים בסיסיים לניתוח נתונים.

Abstract

התגובות אור של הפוטוסינתזה מתבצעות על ידי סדרה של חלבון פיגמנט מתחמי תילקואיד בקרום. סטויכיומטריה וארגון של מתחמי אלה הוא דינמי מאוד ארוך והן פרקי זמן קצרים עקב תהליכים להתאים פוטוסינתזה לתנאי הסביבה המשתנים (קרי, ללא פוטו אטמוספרי שכבתה, מעברים למצב, ו תגובה לטווח ארוך). מבחינה היסטורית, תהליכים אלה תוארו spectroscopically מבחינת שינויים בכלורופיל פלורסצנטיות, ונותרה ספקטרוסקופיה שיטה חיונית עבור ניטור פרמטרים פוטוסינתטיים. יש מספר מוגבל של דרכים שבהן ניתן לאבחן את הדינמיקה מורכבת חלבון המשמש כבסיס. כאן אנו מתארים שיטה מהירה ופשוטה ההפרדה ברזולוציה גבוהה והדמיה של מתחמי תילקואיד, יליד ירוק אלקטרופורזה בג'ל. שיטה זו היא יחד עם הזמן בקורלציה פוטון יחיד סופר על אפיון מפורט של המאפיינים פלורסצנטיות כלורופיל של להקות מופרדים על הג'ל ירוק.

Introduction

אורגניזמים פוטוסינתטיים עליך כל הזמן להתאים את הפיזיולוגיה שלהם לשינוי תנאי הסביבה על מנת למקסם את התפוקה שלהם להתמודד בהצלחה עם השכנים¹. הדבר נכון במיוחד של מכונות אחראי לתגובות אור פוטוסינתזה, כמו תאורת תנאים יכול להשתנות על ידי שלושה סדרי גודל בין צללים ואור שמש מלאה. בנוסף, גורמים סביבתיים כגון: יובש, קור, או עומס חום יכול להפחית את הזמינות של פחמן דו-חמצני עבור קיבוע פחמן, אשר לכיור אלקטרון טבעי עבור המוצרים של תגובות אור. צמחים עליך, לכן, הקציר, לנצל את קרינת השמש בצורה היעילה ביותר האפשרית תוך שמירה על היכולת להפיג את אנרגיית האור עודף לפי הצורך. עדיין, photooxidative נזק מתרחש באופן שגרתי תחת כל תנאי אור^2,3, כשל לנהל נספג עירור אנרגיה בהצלחה יכול לגרום נזק לתאים קטסטרופלי, מוות. מספר מנגנונים גמישים קיימים המאפשרים את המנגנון פוטוסינתטיים ויתכן וייקלטו שינויים בתנאים הסביבתיים השוררים וגם תנודות זמניות (קרי, על פני צירי זמן ארוך וקצר)⁴. אלה כוללים את התגובה לטווח ארוך (משמאל לימין) ללא פוטו אטמוספרי שכבתה (NPQ). NPQ הוא עצמו נחשב להקיף לפחות שלושה תופעה רכיב, כולל מעברים למצב (qT), אנרגיה במהירות inducible שכבתה (qE) של קרינה (qI)⁵.

תהליכים אלה היו במקור נצפתה ומוגדר במידה רבה מבחינת תופעות ספקטרוסקופיות [למשל, NPQ מתייחס ירידה בזריחה שנצפה כלורופיל (שכבתה של כלורופיל זריחה) שאינו בשל עלייה בשיעור של פוטוכימיה]⁶. המונח "מעברים למצב" באופן דומה מתייחס לשינוי נצפתה כמות יחסית של קרינה פלואורסצנטית PSI, PSII⁷. בזמן הטכניקות ספקטרוסקופיות שהפכו ספירה של תופעות אלו אפשרי [בפרט, הדופק משרעת מאופנן (פאם) זריחה ספקטרוסקופיה] ולהמשיך להיות אמצעי חיוני להתבוננות לנתח תהליכים פוטוסינתטיים ב ויוו, במידה רבה של ביוכימיה נדרש כדי להבהיר את המנגנונים האלה תצפיות ספקטרוסקופיות. מעברים המדינה, למשל, כרוך מחזור זרחון/dephosphorylation של החלבונים LHCII על ידי STN7 קינאז ו TAP38/PPH1 פוספטאז, בהתאמה^8,9,10. מחזור זה מכוונן את התפלגות הפיזי של האנטנה LHCII בין photosystems שני על-ידי העברת חלק LHCII trimers מן PSII PSI, וכך לשנות את הספיגה חתך של^11,photosystems¹². הרכיב qE של NPQ ממיר במהירות עירור עודף אנרגיה חום באמצעות הפעולות של מחזור epoxidation/דה-epoxidation violaxanthin/וזאקסנטין ואת החלבון PsbS. התפקיד המדויק של PsbS בתהליך זה הוא עדיין לא מובן במלואו¹³. הרכיב הצ'י של NPQ, קרינה, בדרך כלל המיוחס נזק החלבון D1 של PSII. שיקום הסמכות פוטוסינתטיים מלא דורש תהליך תיקון משוכללת כדי לתקן את photocenters PSII פגום. מחזור תיקון PSII כרוך ההעברה של מתחמי PSII ערימות granal, פירוק מתחמי, החלפה של חלבונים פגומים D1, ההרכבה מחדש של מתחמי PSII, ותנועה של מתחמי PSII בחזרה לתוך ערימות granal¹⁴. טבעו המדוייק של קרינה, נזקי PSII נותרת כנושא של בדיקה אינטנסיבית¹⁵.

הקושי בלימוד תופעות כמו מצב המעברים או תיקון PSII בחלקה נובעת העובדה שזה לא דרך פשוטה אחת כדי להמחיש את המכניקה של מערכות מורכבות הביוכימי. הגישה הביוכימי הקלאסי להבנת תהליך היא להפריד בין מרכיביו קודם כך הם יכולים להתאפיין בבידוד. אלקטרופורזה בג'ל יליד עלתה מן מאמצי מוצלח בשנות השמונים כדי להפריד ולאפיין את מתחמי photosystem של הממברנות תילקואיד עם מפוח שיטות (כלומר צנטריפוגה הדרגתיות סוכרוז ו כרומטוגרפיה) עוד¹⁶. המערכות דטרגנט שפותחו כדי solubilize בעדינות את מתחמי מקורית של הממברנות תילקואיד הוסבו בקרוב כדי שיטות הפרדה electrophoretic, בייחוד על ידי אלן ו- Staehelin¹⁷ , פיטר, Thornber¹⁸, וקורים ירוק יליד ג'ל אלקטרופורזה. בעוד המייצג רק אחד מתוך מגוון רחב של טכניקות בארסנל ניסיוני, יליד דף יש מספר מאפיינים אטרקטיביים שהפכו אותו שיטה נרחב מועסקים במחקר פוטוסינתזה. דף מקורי הוא יחסית מהיר ופשוט, הדורשים ציוד קצת מיוחד, תוך מתן ההפרדה ברזולוציה גבוהה של מספר רב של מתחמי תילקואיד בו זמנית. זה הופך דף יליד כלי נוח ללמוד תילקואיד dynamics, בשילוב עם דף רגיל ב הממד השני, כמו גם מגוון רחב של חומרי ניקוי ומערכות מאגר, מערכת רב תכליתי עבור איתור ואפיון מתחמי תילקואיד חדש.

זה נאמר, יליד ג'ל ירוק היה מוניטין של היותו טכניקה לא אמין, במיוחד בידיים לא מנוסים, כפי קל לייצר תוצאות המסכן המורכב ג'לים פרוותי, smeary עם כמה להקות. פתרו את הבעיה, בין השאר, עם כניסתה של כחול-יליד עמוד¹⁹. השימוש coommassie צבע במערכת מאגר בסון עושה את ההפרדה חלבון עמידים יותר. לכן, בסון-דף הוא לרוב טכניקה קלה ומהימנה יותר עבור טירון יחסית להגדיר, יכול לספק הפרדות צבע ברזולוציה גבוהה של מתחמי תילקואיד. מסיבות אלו, בסון-דף הפכה לשיטת הבחירה למרבית העבודות של שדה זה. בעוד בסון-דף הוא בדרך כלל איטי יותר להפעיל יותר בג'ל ירוק, החיסרון העיקרי שלה זה ההכתמה לצבוע coommassie מפריע הזיהוי של להקות המכילים כלורופיל חלש, תוך גם במורד הזרם ספקטרוסקופיות אפיון בעייתי.

המידע הביוכימי ג'לים יליד ואולם מרחביות 2D-דף יכול להיות חיזקה אצלי מאד בשילוב עם נתונים משיטות ספקטרוסקופיות. בלי קשר המערכת המועסקים, הוא בעיה מרכזית עם באמצעות ג'ל יליד לזיהוי מתחמי כי הזיהוי ניתן תמיד לערער (קרי, החלבונים נמצא בלהקה יכול תמיד לייצג קומפלקסים comigrating או רכיבים, אלא מאשר יחיד אותנטי מבחינה פיזיולוגית קומפלקס). אפיון ספקטרוסקופיות מספק מידע ביופיזיקלי על הפיגמנטים בלהקות ג'ל ירוק והוא יכול לשמש כדי לקבוע אילו סוגים של מתחמי הם נוטים להכיל. כלורופיל הוא שימושי במיוחד בהקשר זה בשל ספקטרום שונה לעיתים קרובות באופן דרמטי ואורך פלורסצנטיות האופייניים של מכלולים שונים פוטוסינתטיים פיגמנט-חלבון. בזמן מצב יציב פשוטה 77K פלורסצנטיות ספקטרה מבחינה היסטורית היו שימושיים המאשרת את הזהויות של מתחמי ג'ל מקורית, מודרני בקורלציה זמן יחיד פוטון לספור (TCSPC) יכול לספק מידע רב יותר. TCSPC מאפשר לא רק אפיון מתחמי מבוסס על קרינה פלואורסצנטית גלגולי חיים, אך גם מאפשר את תיאור מפורט של העברת אנרגיה בין רכיבי ספקטרלי בתוך מתחם. סוג זה של אפיון הופך להיות הכרחי יותר ויותר כמו השימוש של ממרחים שונים של מערכות ג'ל מקורית, מתחמי בשם חדשים מתגלים, המאפשר הזיהוי של חלבון מתחמי כדאי לבצע אימות, מתן חדש מידע ביופיזיקלי על איך אלה מתחמי העבודה.

נייר זה, אנו מספקים שיטה המאפשרת את אלה שיש להם מעט או ללא ניסיון עם יליד אלקטרופורזה בג'ל כדי להשיג רזולוציה באיכות גבוהה של מתחמי תילקואיד יליד במטרה לחקור את המכניקה של התגובות אור של פוטוסינתזה. לאחר מכן ניתן בתוספת טכניקה בסיסית זו על פי שיקול דעתה של הנסיין לשפר תוצאות או להרחיב את תחולת למינים אחרים. לאחר מכן נתאר את התהליך עבור העמדת להקות ג'ל ירוק יליד TCSPC, כמו גם כמה צעדים עבור ניתוח בסיסי והצגת הנתונים שנמסרו על ידי הטכניקה. המושבים של בג'ל מקורית עם ניתוח TCSPC מרחיב את התועלת של מערכות אלה ג'ל על-ידי אספקת אימות ואפיון ביופיזיקלי של חלבון מתחמי בתוך הלהקות. מערכת ג'ל ירוק המתוארים כאן מבוסס על שפותחה על ידי אלן ו- Staehelin¹⁷ עם מספר שינויים, זהה בשימוש שוורץ ואח. ²⁰. מערכת זו היא אחת מני רבות אבל יש תכונות ספציפיות שימושיות על מתודולוגיה זו. זה מספיק מהירה כך תילקואיד בידוד, בג'ל, וניתוח TCSPC נוח יכול להתבצע ביום אחד, obviating בעיות פוטנציאליות של אחסון מדגם והשפלה. אנחנו גם מוצאים כי שיטה זו היא חזקה בידיים של משתמשים לא מנוסים, תוך כדי מתן תוצאות שנעים בטווח שבין טוב הממונה, ובהתאם למידת אופטימיזציה.

חשוב לזכור כי מתחמי דמיינו על ג'ל יליד תלויים במערכות דטרגנט וגם מאגר בשימוש, כמו גם על הביולוגיה של האורגניזם תחת חקירה. חומרי ניקוי שונים ומערכות מאגר מעדיפים להפריד בין סוגים שונים של מתחמי, אורגניזם פוטוסינתטיים נתון יהיו מתחמים שונים של אורגניזמים אחרים, לא כולן להיות נוכחים בכל נסיבות נתון. מערכת המתוארים כאן מתאימה בעיקר במחקר של PSI megacomplexes, כפי שמתואר שוורץ ואח. ²⁰, אבל זה נופל על קצה הספקטרום יותר חמוד על הלומדים PSII megacomplexes. עבור מחקר מקיף של דטרגנט ומאגר המערכות השונות בשימוש בג'ל מקורית של חלבונים תילקואיד, מומלץ לסקור ירווי ואח. ²¹ ו- Rantala. et al. ²².

Protocol

1. מלאי פתרונות הכנה למזיגה יליד ג'ל ירוק

1. הכן של 4x בופר מרוכזים לפתרון ג'לים בהיקף של 40% גליצרול, 200 מ"מ גליצין ו- 100 מ מ טריס buffered ל pH 8.3.
2. היכונו של 4x בופר מרוכז ג'לים הערימה בהיקף של 40% גליצרול, 200 מ"מ גליצין ו- 100 מ מ טריס buffered ל pH 6.3.
3. חנות מאגרים אלה ב 4 ° C כדי למנוע הצמיחה של עובש.
   הערה: המאגרים הם יציבים במשך חודשים 4 ° C, כך הכנה של 100-200 מ"ל כל מאגר המשך השימוש מומלץ.
4. להכנת 1 ליטר של 10 x הפעלת מאגר המכיל 250 מ מ טריס HCl pH 8.3, גליצין 1.92 מ', ו 1% מרחביות. אחסן את 10 x פועל מאגר benchtop.

2. פתרון מניות הכנה בידוד, Solubilization של Thylakoids

1. להכין 100 מ ל TMK המגון מאגר המכיל מאגר טריס 50 מ מ (pH 7), 10 מ מ MgCl₂ו- 10 מ"מ אשלגן כלורי, ולאחסן ב 4 º C.
   הערה: זהו המאגר הראשי homogenizing וטיפול תילקואיד דגימות. לחלופין, מרוכזים מלאי פתרונות יכול להיות מוכן, מדולל לפי הצורך (טריס מאגר, MgCl₂ו אשלגן כלורי תוכל להישמר בקלות benchtop כפי מתרכזת 1 מ').
2. להכין מלאי פתרונות של תילקואיד solubilization דטרגנטים, B-decyl maltoside (DM) ו- n-אוקטיל-B-d-אסיאתית (OG), על ידי המסת בכל דטרגנט במאגר TMK ב-20% w / v ההקפאה ב-20 ° C ב- 1 מ ל aliquots.
3. להכין מאגר solubilization תילקואיד (SB), אשר גם הוא המאגר טעינה הדגימה.
   1. ראשית, ודא TMK-גליצרול מאגר על-ידי שילוב mLs 7 מאגר TMK mLs 3 של גליצרול.
   2. כדי μL 800 TMK-גליצרול המאגר, להוסיף 100 μL של פתרון מניות מיט μL 100 של פתרון מניות אוג. חנות זו הפתרון עובד SB, המכיל 2% OG מיט ל- 2%, קפוא ב-20 ° C ב- 1 מ ל aliquots.
      הערה: כל aliquot יכול להיות הקרת והוקפאו מחדש לפי הצורך

3. לשפוך את הירוק מיני ג'לים לשימוש מאוחר יותר

1. הכינו ערימה נפרדת ופתרון ג'ל פתרונות במבחנות חד פעמית 15 מ"ל.
   הערה: אמצעי האחסון המסופקים מספיקים עבור ג'ל מיני יחיד באמצעות מפרידי צלחת 1.5 מ מ.
   1. כדי להפוך את הפתרון ג'ל הערמה, לשלב 1.25 מ של 4 x מאגר ג'ל הערמה, 0.5 מ של 40% אקרילאמיד מניות פתרון (39:1 C) ו 3.25 מ ל מים לתת 5 מ של אקרילאמיד 4% 1 x מאגר הערימה. כדי להפוך את הפתרון ג'ל פתרון לשלב 1.875 מ של 4 x לפתרון מאגר, 0.94 מ של 40% אקרילאמיד מניות פתרון (39:1 C) ו- 4.7 מ ל מים לתת 7.5 mL של אקרילאמיד 5% 1 x לפתרון מאגר.
2. יוצקים את הג'ל פתרון.
   1. להוסיף 50 μL של 10% קירור (APS) הפתרון ג'ל פתרון, ולאחר מכן להוסיף 10 μL של TEMED, קאפ הצינור, היפוך בעדינות מספר פעמים כדי לערבב. ומיד שופכים את הפתרון ג'ל בין הלוחות ג'ל, עוזב כ 1 ס מ בין החלק העליון של החלק ג'ל פתרון והחלק התחתון של השיניים מסרק על הג'ל הערימה.
   2. בעדינות פיפטה אתנול 100% על החלק העליון של הג'ל פתרון לשלב הג'ל.
      הערה: אם הג'ל אינו מוגדר בתוך 15 דקות, פתרון APS טריים צריך להיעשות ו/או TEMED החדש אמור לשמש.
   3. אחרי הג'ל יש polymerized (הממשק בין הג'ל האתנול יהיו גלויות, לא תזוז בעת הג'ל נמצא. בכיוון השני), לשפוך אתנול, כתם עם נייר סופג.
3. יוצקים את הג'ל הערימה.
   1. להוסיף 25 μL של 10% APS לפתרון ג'ל הערמה, מוסיפים 5 μL של TEMED, ואז קאפ ' היפוך ' כדי לערבב באותו אופן כמו הג'ל פתרון. יוצקים את הפתרון ג'ל על גבי הג'ל פתרון עד הרווח בין הלוחות מתמלא לגמרי והכנס מסרק 10-. טוב.
      הערה: כאשר מוכן לשמש, להסיר את המסרק של הג'ל ולשטוף את בארות מים, מוודא כי הבארות הם ישר בלא הפרעה על ידי ג'ל. לפחות כמה ימים ניתן לאחסן את הג'ל עם המסרק במקום 4 ° C.

4. בידוד של ממברנות תילקואיד גולמי של תרד עלים

הערה: כל השלבים צריכה להתבצע על קרח באמצעות מאגרי וציוד מראש צוננת. תאורה עמומה מומלץ גם. בהתאם שיקול דעת של הנסיין התהליכים הביולוגיים שנבחנה, מעכבי פרוטאז ו/או פוספטאז צריך להתווסף טרי TMK מאגרי לפני המגון.

1. לגמרי homogenize תרד עלים במאגר TMK עם מהמגן דאונס זכוכית.
   הערה: כ 1-2 מ של מאגר מספיקה בדרך כלל עלה תרד קטנים. בדרך כלל, עלה תרד תינוק יחיד יכול לספק מספיק חומר כדי לטעון כמה בארות על ג'ל מיני 1.5 מ מ.
2. לסנן את homogenate עלים גולמי כדי להסיר את הלכלוך לא מסיסים.
   1. כדי להפוך פשוטה התקן סינון, לחתוך משימה עדינה לנגב במחצית ומקפלים אותו לרבעים. לארוז את המחיקה המשימה העדינה לתוך החלק התחתון של מזרק חד פעמיות 5 מ"ל, טרום רטוב המחיקה באמצעות מאגר TMK.
   2. להשתמש על הבוכנה מזרק לחץ עודף מאגר מחוץ המחיקה המשימה העדינה ולהיות בטוח כי המסנן לנגב נלחץ היטב לתחתית של המזרק לאחר הבוכנה מוסר.
   3. Pipette את homogenate עלה במרכז המסנן לנגב ולהשתמש הבוכנה כדי לעבור את homogenate דרך המסנן. לאסוף את homogenate המסוננות בשפופרת צנטרפוגה 1.5 mL.
3. Centrifuge את homogenate ב 5,000 x g 10 דקות ב 4° C כדי הצניפה חומר לא מסיסים, כולל תילקואיד ממברנות. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 1 מ"ל TMK המאגר.
4. לנרמל את הכמות של כלורופיל בכל מדגם על ידי התאמת הנפח של כל מדגם תילקואיד resuspended כך כל מדגם מכיל את אותו הסכום הכולל של כלורופיל, כמתואר להלן.
   הערה: זה יאפשר כל דגימה להיות solubilized באותו אמצעי אחסון של סבון, ממזער את השתנות ב solubilization עקב הבדלים בהיקף גלולה.
   1. כדי לחלץ כלורופיל כל דגימה של ממברנות תילקואיד resuspended, לקחת את μL 50 aliquot בשפופרת microcentrifuge 1.5 mL ולהוסיף μL 950 של מתנול אליו. קאפ הצינור ומערבבים על ידי היפוך מספר פעמים.
   2. Centrifuge את תמצית כלורופיל/מתנול ב g 10,000 x 10 דקות הצניפה זירז חלבונים.
   3. לקבוע את ריכוז כלורופיל הפיגמנט המכיל תגובת שיקוע על פי הסיכונים ואח. ²³. את ספיגת הקרינה-652 ולאחר 665 ננומטר ספקטרופוטומטרים באמצעות cuvette של 1 ס מ. לקבוע ריכוז כלורופיל בכנרת הכולל באמצעות המשוואה הבאה:
      Chls + b (μg/mL) = 22.12 (Abs 652 ננומטר) + 2.71 (Abs 665 ננומטר)
   4. באמצעות מדידות ריכוז כלורופיל כמדריך, להסיר ולמחוק לאמצעי אחסון של כל דגימה, לפי הצורך, כך כל שפופרת מכיל את אותו הסכום הכולל של כלורופיל.
5. מחדש הצניפה תילקואיד ממברנות על ידי צנטריפוגה-g x 5,000 עבור 10 דקות להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע. הקפד להסיר כל תגובת שיקוע מבלי כ רפה בעברית מכל בגדר.

5. solubilization של ממברנות תילקואיד כשהעמיסו על ג'לים מקורי

1. להפשיר את aliquot של TMK 30% גליצרול דטרגנט פתרון (SB), היפוך מספר פעמים כדי לערבב. . לשמור את זה על קרח.
2. להמיס בגדר תילקואיד על-ידי הוספת נפח מתאים של SB לתת ריכוז כלורופיל של 1 מ"ג/מ"ל.
   הערה: ריכוז זו היא נקודת מוצא את התנאים solubilization אופטימלית, אשר צריכה להיקבע מדעית. ריכוז כלורופיל יש לשמור אותו הדבר בין דגימות כדי לאפשר השוואות חוקי להתבצע.
3. פיפטה למעלה ולמטה שוב ושוב בעת היותו הקפידו להימנע קצף של המדגם. לשמור על הקרח כדי לאפשר תילקואיד דגימות solubilize.
   הערה: Solubilize במשך 10 דקות לפחות. Solubilization הזמן צריך להיות מספיק זמן כי ההבדל בזמן solubilization בין דגימות ממוזער.
   דוגמה: אם 3 דקות נדרשים solubilize כל דוגמאות, אז כ-30 דקות מותר עבור solubilization.
4. צנטריפוגה thylakoids solubilized ב 10,000 g x-4 ° C עד הצניפה חומרים לא מסיסים.
   הערה: Solubilized דגימות תילקואיד יציבים על קרח במשך שעות, אך אחסון ב-70 מעלות צלזיוס יש להימנע, ככל מחזורים ההקפאה-הפשרה עלולה לגרום לאובדן של להקות megacomplex.

6. הפרדת תילקואיד Solubilized חלבונים על ידי אלקטרופורזה בג'ל מקורי

1. טען את solubilized תילקואיד supernatant מוכן בשלב 5.4 ישירות על גבי הג'ל מקורי שהוכן קודם לכן. עבור ג'ל 1.5 מ מ, טען μL 15 של תילקואיד solubilized לכל טוב.
2. הפעל את ג'ל ירוק יליד בעצם באותו אופן כמו ג'לים מרחביות-דף משתמש 1 x הפעלת מאגר. להפעיל את הג'ל ב- 100 וולט ומניחים את הטנק כולו ג'ל על קרח רטוב משך זמן ההפעלה כדי להמתיק חימום התנגדות של הג'ל.
   הערה: הג'ל צריך לדרוש כשעתיים הפיגמנט חינם בחזית ההעברה להגיע התחתון של הג'ל (איור 1).

7. כריתה של להקות תילקואיד מתחם מקורי ג'ל ירוק

הערה: Excising הלהקה מסוים ריבית הג'ל יש צורך לאפשר את הלהקה כדי להציב בו הנתיב של קרן וכדי למנוע קרינה פלואורסצנטית תועה מן מתחמי הסמוך נאסף.

1. הסר את הג'ל אלקטרופורזה תא ולשטוף הפעלת מאגר מצלחות ג'ל עם מים מזוקקים. הסר את לוחית העליון של הג'ל ולשטוף את הג'ל עם מים מזוקקים.
2. לשמור את הג'ל על צלחת זכוכית התחתון ומניחים את ג'ל ואת צלחת על קרח. כאשר אינו בשימוש, לשמור את הג'ל בחושך, עוטפים בניילון נצמד כדי למנוע את זה ממנו להתייבש.
3. עם הג'ל שנותרו בצלחת זכוכית, לסלק כל הלהקה עניין כשאתה מוכן לניתוח TCSPC. בלו להקות נקיה עם סכין חדה או גילוח ונדאג כי הלהקה נכרת מכיל שום חומר הלהקה משחיתה.

8. אוסף של ספקטרום קרינה פלואורסצנטית מצב יציב בטמפרטורת החדר

1. עבור כל קומפלקס זה ינותחו על ידי TCSPC, ספקטרום קרינה פלואורסצנטית בטמפרטורת החדר נלקח בין 600 ל-800 ננומטר באמצעות ספקטרומטר של זריחה.
   הערה: אורך הגל עירור המשמש לאיסוף ספקטרום נרחב זה להתאים את אורך הגל המשמש TCSPC.

9. TCSPC של להקות ג'ל ירוק

הערה: עיין איור 2 לקבלת תיאור של ההתקנה TCSPC.

1. כריך הפרוסה ג'ל בין שתי שקופיות מיקרוסקופ זכוכית. השתמש המסיכה קלטת, מניחים בקצה אחד של אחת מהשקופיות מיקרוסקופ ומקופל מעל מספר פעמים, כדי ליצור מפרידי כך השקופיות יכולים להיות מוחזקים ביחד בחוזקה ללא דחיסה הפרוסה ג'ל.
   הערה: פעולה זו תיצור נתיב עבור קרן הלייזר לעבור בין השקופיות למיקרוסקופ ובאמצעות הפרוסה ג'ל.
2. להוסיף כמות קטנה של מים הפרוסה ג'ל בקצה של השקופיות זכוכית כדי ליצור ממשק חלקה תפחית פיזור האות.
3. . המלחציים השקופית הג'ל/כריך בנתיב קרן כך הקורה מכה הפרוסה ג'ל דרך הקצה הפתוח של הצלחות, המאפשר פליטת קרינה פלואורסצנטית להיות דרך הצד של שקופיות זכוכית שבו הג'ל דחוקה, בניצב לנתיב קרן
   הערה: אורך הגל עירור בשימוש יהיה תלוי בניסוי. אורך גל של 435 nm יעוררו הן כלורופיל a ו- b כלורופיל, בעוד 465 nm מעדיפים יעוררו כלורופיל b. במקרה זה, 435 nm שימש הגל עירור.
4. לאסוף נקודות נתונים הכולל 10,000 במרווחי זמן קבועים על פני ספקטרום הפליטה פלורסצנטיות עבור כל קומפלקס. לדוגמה, איסוף נתונים כל 10 ננומטר, החל ב 680 ננומטר עד השפך 750 ננומטר.
   הערה: להכין להקות ג'ל מרובים עבור כל קומפלקס שילמדו כך הדגימה טריים זמין בכל מקרה שבו photobleaching מונע אות מספקת אוסף.

10. TCSPC (ניתוח נתונים)

1. עבור מתחם הנתון, לנרמל קודם שיא הגובה של כל עקומה דעיכה עבור אורכי גל כל הנאספים.
   הערה: שלב זה לא הכרחי לבנייה של DAS אך מאפשר עקומות דעיכה בשכבות, בהשוואה באופן חזותי אחד עם השני כמו בדיקה ראשונה של הנתונים.
2. זנב-match כל עקומה דעיכה ספקטרום קרינה פלואורסצנטית מצב יציב של המתחם כמתואר להלן.
   1. בחר timepoint לאחר מכן האות דעיכה יש שכובים, בדרך כלל לאחר מבצע איתחול.
   2. עבור כל אורך גל, לנרמל את עקומת דעיכה כך עוצמת האות ב timepoint שנבחר הוא שווה הערך של הספקטרום פלורסצנטיות מצב יציב-גל הזה (דהיינו, הערכים של כל אורכי גל ביחד timepoint הנבחר ליצור מחדש את ספקטרום קרינה פלואורסצנטית מצב יציב).
3. לבנות דעיכה-עמית ספקטרה (DAS) מ. עקומות דעיכה מתאימים-הזנב, כמתואר להלן.
   1. שימוש בנתונים נקודות מ. עקומות דעיכה מתאימים-זנב בונים סדרה של חלקות גראפית עוצמת קרינה פלואורסצנטית לעומת גל במרווחי זמן קבועים (למשל, כל 10 ps). לדוגמה, סי-50 ps נבנית על ידי מתכנן את הערך של כל עקומה דעיכה ב ps 50 לעומת אורך הגל.
   2. מכסים את כל ספקטרום קרינת-הקשורים ליצירת מגרש סגנון מפל המציג את הדעיכה של הספקטרום פלורסצנטיות לאורך זמן.

תוצאות

נציג תוצאות אלקטרופורזה בג'ל ירוק מוצגים באיור1. ליין 1 מספק דוגמה של תוצאות אידיאלי עבור בג'ל הירוק של thylakoids תרד, שבו מספר מרבי של להקות ירוק ברורה, חדה גלויים. תוצאות אלה הן במידה מסוימת לא טיפוסיות, בין השאר כי לא כל הלהקות ראיתי ליין 1 הם בדרך כלל הנוכח במד...

Discussion

תילקואיד מוצלח solubilization עם ג'ל יליד לרוץ יביא את הרזולוציה של מספר להקות ירוק ברורים לעין על הג'ל ללא עיוותים משמעותיים או מריחת הלהקות. העמסת את הג'ל, ריכוז גבוה דטרגנט, pH שגוי הדגימה, undissolved חומר, פועל הג'ל מהר מדי או בטמפרטורה גבוהה מדי, ג'ל יציקת באופן לא תקין הם גורמים שעשויים לתרום מתחמי ת?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycine	Sigma	G8898
Tris base	Sigma	#648310
SDS	Sigma	L3771
Decyl Maltoside	Sigma	D7658	n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside
Octyl Glucoside	Sigma	O8001
Acrylamide	BioRad	161-0148	37.5/1 C 40% solution
TEMED	BioRad	161-0800
Ammonium Persulfate	BioRad	161-0700
Magnesium Chloride	Sigma	M2670
Potassium Chloride	Sigma	P9333