Trennung von Spinat Thylakoidmembran Proteinkomplexe durch Native grün Gelelektrophorese und Band Charakterisierung mittels Time-Correlated Single Photon Counting

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur solubilisiert Thylakoidmembran komplexe durch Native grün Gelelektrophorese getrennt. Grüne Gel Bänder zeichnen sich danach durch Zeit korreliert Single Photon Counting (TCSPC) und grundlegenden Schritte für die Datenanalyse werden zur Verfügung gestellt.

Zusammenfassung

Die Licht-Reaktionen der Photosynthese werden durch eine Reihe von pigmentierten Proteinkomplexe in die Thylakoidmembran Membranen durchgeführt. Die Stöchiometrie und Organisation dieser komplexe ist sehr dynamisch an langen und kurzen Zeitskalen durch Prozesse, die Photosynthese an sich verändernde Umweltbedingungen anpassen (d.h. nicht-photochemische abschrecken, Statusübergänge, und die langfristige Antwort). In der Vergangenheit diese Prozesse haben spektroskopisch im Hinblick auf Veränderungen im Chlorophyllfluoreszenz beschrieben, und Spektroskopie bleibt eine wichtige Methode zur Überwachung der photosynthetischen Parameter. Es gibt eine begrenzte Anzahl von Möglichkeiten, in denen die zugrunde liegenden komplexen Proteindynamik visualisiert werden können. Hier beschreiben wir eine schnelle und einfache Methode für die hochauflösende Trennung und Visualisierung der Thylakoidmembran komplexe, native grüne Gelelektrophorese. Diese Methode ist gekoppelt mit Zeit korreliert einzelnes Photon counting für detaillierte Charakterisierung der Chlorophyll-Fluoreszenzeigenschaften von Bands, die auf das grüne Gel getrennt.

Einleitung

Photosynthetische Organismen müssen ständig ihre Physiologie an sich verändernde Umweltbedingungen zu maximieren Sie ihre Produktivität und erfolgreich konkurrieren mit Nachbarn¹anpassen. Dies gilt insbesondere für die Maschinen verantwortlich für die Licht-Reaktionen der Photosynthese als Umgebungslicht, die Bedingungen um drei Größenordnungen zwischen Schatten und volle Sonne schwanken können. Umweltfaktoren wie Trockenheit, Kälte oder Hitze-Stress können darüber hinaus die Verfügbarkeit von Kohlendioxid für die Kohlenstoffspeicherung, verringern, die das natürliche Elektron für die Produkte der Licht-Reaktionen Waschbecken. Pflanzen müssen deshalb ernten und Sonnenstrahlung möglichst effizient zu nutzen, unter Beibehaltung der Fähigkeit, überschüssige Lichtenergie wie nötig zu zerstreuen. Während photooxidativen Schäden weiterhin routinemäßig unter allen Lichtverhältnissen^2,3, Fehler zu verwalten aufgenommene Anregungsenergie erfolgreich zu den katastrophalen Zellschäden und zum Tod führen kann auftritt. Verschiedene Anpassungsmechanismen vorhanden, mit die der photosynthetischen Apparat zu Veränderungen der vorherrschenden Umweltbedingungen und vorübergehende Schwankungen (z.B. über lange und kurze Fristen)⁴abgestimmt werden können. Dazu gehören die langfristige Reaktion (LTR) und nicht-photochemische abschrecken (NPQ). NPQ ist selbst als umfassen mindestens drei andere Komponente-Phänomene, einschließlich Statusübergänge (qT), schnell induzierbaren Energie abschrecken (qE) und Photoinhibition (qI)⁵.

Diese Prozesse wurden ursprünglich beobachtet und vor allem in Bezug auf die spektroskopische Phänomene definiert [z. B. NPQ bezieht sich auf einen Tropfen im beobachteten Chlorophyll-Fluoreszenz (abschrecken der Chlorophyll-Fluoreszenz), die nicht durch einen Anstieg der Rate von Photochemie]⁶. Bezeichnet der Begriff "Statusübergänge" ähnlich der beobachteten Veränderungen in der relativen Höhe der Fluoreszenz von PSI und PSII⁷. Während die spektroskopischen Techniken, die Aufzählung dieser Phänomene möglich gemacht haben [insbesondere Puls Amplitude moduliert (PAM) Fluoreszenz-Spektroskopie] und weiterhin ein wichtiges Mittel zur Beobachtung und Zergliederung photosynthetische Prozesse in Vivo, viel der Biochemie ist erforderlich, um die Mechanismen, die diese spektroskopischen Beobachtungen zu erhellen. Staatliche Übergänge zum Beispiel beinhaltet einen Phosphorylierung/Dephosphorylation-Zyklus der LHCII Proteine durch die STN7-Kinase und TAP38/PPH1 Phosphatase, jeweils^8,9,10. Dieser Zyklus stellt die physische Verteilung der LHCII Antenne zwischen die beiden Photosysteme indem Sie einen Teil des LHCII Trimere von PSII auf PSI, verändert dadurch die Absorption Querschnitt der Photosysteme^11,12. Die qE-Komponente des NPQ wandelt schnell überschüssige Anregungsenergie in Wärme durch die Aktionen des Violaxanthin/Zeaxanthin Epoxidierung/de-Epoxidierung Zyklus und die PsbS Protein. Die genaue Rolle des PsbS in diesem Prozess ist noch nicht vollständig verstanden,¹³. Die qI-Komponente von NPQ, Photoinhibition, wird im allgemeinen zugeschrieben, um Schäden an der D1-Protein des PSII. Wiederherstellung der vollen photosynthetischen Kompetenz erfordert einen aufwendige Reparatur-Prozess, beschädigte PSII Photocenters zu beheben. Die PSII Reparatur-Zyklus umfasst die Migration der PSII komplexe granal Stapel, Abbau der Anlagen, Ersatz der beschädigten D1 Proteine, Zusammenbau der PSII komplexe und Bewegung von PSII komplexe zurück in die granal Stapel¹⁴. Die genaue Art des Photoinhibition und PSII lichtbedingten bleibt ein Thema der intensiven Kontrolle¹⁵.

Die Schwierigkeit bei der Untersuchung von Phänomenen wie Zustand übergeht oder PSII Reparatur ergibt sich teilweise aus der Tatsache, dass es nicht eine einfache Möglichkeit, die Mechanik des komplexen biochemischen Systemen zu visualisieren. Der klassische biochemische Ansatz zum Verständnis eines Prozesses ist, zunächst seine Bestandteile zu trennen, so dass sie isoliert charakterisiert werden können. Gebürtige Gelelektrophorese entstand aus der erfolgreichen Bemühungen in den 1980er Jahren zu trennen und zu charakterisieren das Photosystem komplexe aus der Thylakoidmembran Membranen mit mehr präparativen Methoden (nämlich Saccharose-Gradienten-Zentrifugierung und Chromatographie)¹⁶. Die Waschmittel Systeme entwickelt, um sanft die native komplexe aus der Thylakoidmembran Membranen lösen wurden bald elektrophoretischen Trennmethoden, vor allem von Allen und Staehelin¹⁷ angepasst und und Peter und Thornber¹⁸, verursachend zur nativen grünen Gelelektrophorese. Während vertritt nur eine aus einer Vielzahl von Techniken in der experimentellen Arsenal, native Seite eine Reihe von attraktiven Eigenschaften, die es am meisten eingesetzten Methode in der Fotosynthese Forschung haben hat. Native Seite ist relativ schnell und einfach, erfordert wenig Spezialausrüstung, während gleichzeitig hochauflösende Trennung einer großen Anzahl der Thylakoidmembran komplexe. Dies macht native Seite ein praktisches Werkzeug für das Studium der Thylakoidmembran Dynamik und, in Kombination mit standard-Seite in der zweiten Dimension, sowie eine Vielzahl von Waschmittel und Puffer-Systeme, ein vielseitiges System für die Suche und Charakterisierung von neuen Thylakoidmembran komplexe.

Abgesehen davon hatten native grün Gele ein Renommee für sein eine unzuverlässige Technik, vor allem in unerfahrenen Händen, da es einfach ist, bestehend aus fuzzy, schmierig Gele mit wenigen Bands zu schlechten Ergebnissen. Dieses Problem wurde gelöst, unter anderem mit der Einführung des blau-Native Seite¹⁹. Die Verwendung von Coommassie Farbstoff in der BN-Puffersystem macht Protein Trennung robuster. Daher, BN-Seite ist oft ein einfacher und zuverlässiger Technik für ein relativer Neuling einzurichten und bieten hochauflösende Trennungen der Thylakoidmembran komplexe. Aus diesen Gründen ist die BN-Seite die Methode der Wahl für die meisten Arbeiten dieses Feldes geworden. Während BN-Seite in der Regel langsamer ist zu laufen als grüne Gelelektrophorese sein Hauptnachteil ist, dass die Coommassie Farbstoff Färbung mischt sich mit der Identifizierung von schwachen Chlorophyll-haltigen Bands, während auch nachgeschaltete spektroskopische die Charakterisierung ist problematisch.

Die biochemische Informationen bereitgestellt durch native Gele und 2D SDS-PAGE kann erheblich gestärkt werden, wenn Sie mit Daten aus spektroskopischen Techniken kombiniert. Unabhängig von dem System beschäftigt, ist ein zentrales Problem bei der Verwendung von nativen Gele, um komplexe zu identifizieren, dass die Identifizierung immer angefochten werden kann (d. h. die Proteine in einer Band gefunden konnte immer dar comigrating Anlagen oder Komponenten, eher als einen einzigen physiologisch authentische Komplex). Spektroskopische Charakterisierung biophysikalische informiert über die Pigmente in grüne Gel-Bands und kann verwendet werden, um festzustellen, welche Arten von komplexen sie voraussichtlich enthalten sind. Chlorophyll-Fluoreszenz ist besonders hilfreich in dieser Hinsicht aufgrund der oft dramatisch unterschiedliche Spektren und Fluoreszenz-Lebensdauer, die charakteristisch für verschiedene photosynthetische Pigmente-Protein-komplexe. Während einfache stationäre 77K Fluoreszenz Spektren historisch bestätigt die Identität der native Gel komplexe nützlich gewesen, kann moderne Zeit korreliert einzelnes Photon counting (TCSPC) viel mehr Informationen liefern. TCSPC ermöglicht nicht nur die Charakterisierung der Fluoreszenz-Lebensdauer-komplexe, sondern ermöglicht auch die detaillierte Beschreibung der Energieübertragung zwischen den spektralen Komponenten innerhalb eines Komplexes. Diese Art von Charakterisierung wird zunehmend notwendig, da die Verwendung von verschiedenen einheimischen Gel Systeme breitet sich immer und neuen vermeintlichen komplexe entdeckt werden, die Identifizierung von Proteinkomplexen besser authentifiziert werden und neu biophysikalische Informationen darüber, wie diese komplexe arbeiten.

In diesem Papier stellen wir eine Methode, die diejenigen, die wenig oder keine Erfahrung mit native Gelelektrophorese qualitativ hochwertige Auflösung von nativen Thylakoidmembran komplexe zum Zwecke der Untersuchung der Mechanik der Licht Reaktionen erreicht ermöglicht Photosynthese. Diese Grundtechnik kann dann der Experimentator Ermessen Ergebnisse verbessern oder erweitern Anwendbarkeit auf andere Arten erweitert werden. Wir beschreiben den Prozess für native grüne Gel Bands TCSPC, sowie einige Schritte für die grundlegende Analyse und Darstellung der Daten zur Verfügung gestellt durch die Technik zu unterwerfen. Die Kopplung der gebürtige Gelelektrophorese mit TCSPC Analyse erstreckt sich das Dienstprogramm dieser Gel-Systeme durch Authentifizierung und biophysikalischen Charakterisierung der Proteinkomplexe innerhalb der Bänder. Das grüne Gel System hier beschriebenen basiert auf, die von Allen und Staehelin¹⁷ mit einigen Modifikationen entwickelt und ist identisch mit dem in Schwarz Et al.verwendet. ²⁰. dieses System ist eine von vielen aber hat spezifische Eigenschaften, die nützlich für diese Methode sind. Es ist schnell genug, so dass Thylakoidmembran Isolation, Gelelektrophorese und TCSPC Analyse bequem an einem Tag erfolgen können, mögliche Probleme der Probe Lagerung und Abbau vermieden. Wir finden auch, dass diese Methode in die Hände von unerfahrenen Benutzern, robust und trotzdem einen Ergebnisse, die von Vorgesetzten, je nach dem Grad der Optimierung gut reichen.

Es ist wichtig zu bedenken, die die komplexe visualisiert auf eine native Gel abhängen auf das Waschmittel und Puffer Systemen verwendet, sowie über die Biologie des Organismus untersucht. Verschiedene Reinigungsmittel und Puffer-Systeme bevorzugt verschiedene Arten von komplexen trennen und haben ein bestimmter photosynthetische Organismus verschiedene komplexen von anderen Organismen, von denen nicht, die alle angegebenen keinesfalls anwesend sein wird. Das hier beschriebene System eignet sich besonders für die Untersuchung von PSI Megacomplexes, wie in Schwarz Et al.beschrieben. ²⁰, aber es fällt auf mehr destabilisierenden Ende des Spektrums für Studierende PSII Megacomplexes. Für eine umfassende Studie über die verschiedenen Reinigungsmittel und Puffer-Systeme in der gebürtige Gelelektrophorese der Thylakoidmembran Proteine verwendet empfiehlt es sich, Järvi Et al.zu überprüfen. ²¹ und Rantala Et al. ²².

Protokoll

(1) auf lagerlösungen Vorbereitung für Native grün Gele gießen

1. Bereiten Sie einem 4-fach konzentrierten Pufferlösung zur Beilegung von Gelen, bestehend aus 40 % Glycerin, 200 mM Glycin und 100 mM Tris, pH 8,3 gepuffert.
2. Stacking Gele bestehend aus 40 % Glycerin, 200 mM Glycin und 100 mM Tris gepuffert, pH-Wert von 6,3 bereiten Sie einem 4-fach konzentrierten Pufferlösung vor.
3. Speichern Sie diese Puffer bei 4 ° C das Wachstum von Schimmel zu verhindern.
   Hinweis: Die Puffer sind stabile monatelang bei 4 ° C, Vorbereitung von 100-200 mL jeder Puffer für die fortgesetzte Verwendung empfohlen wird.
4. Bereiten Sie 1 L 10 x laufen Puffer mit 250 mM Tris HCl pH 8,3, 1,92 M Glycin und 1 % SDS. Speichern der 10-fach Puffer auf die Benchtop ausgeführt.

(2) Stammlösung Vorbereitung für Isolation und Solubilisierung der Thylakoids

1. 100 mL TMK Homogenisierung Puffer mit 50 mM Tris-Puffer (pH 7), 10 mM MgCl₂und 10 mM KCl vorzubereiten, und bei 4 ° c lagern
   Hinweis: Dies ist der wichtigste Puffer zur Homogenisierung und Manipulation Thylakoidmembran Proben. Alternativ können konzentrierte Stammlösungen vorbereitet und nach Bedarf (Tris-Puffer, MgCl₂und KCl können leicht auf die Tischplatte gelagert werden, da 1 M konzentriert sich) verdünnt werden.
2. Bereiten Sie Stammlösungen der Thylakoidmembran Solubilisierung Reinigungsmittel, B-Decyl-Maltosid (DM) und n-Octyl B-d-glucosid (OG), durch jedes Reinigungsmittel im TMK Puffer bei 20 % w / v Freeze, bei-20 ° C in 1 mL Aliquote auflösen.
3. Bereiten Sie Thylakoidmembran Solubilisierung Puffer vor (SB), die auch der Probenaufnahme Puffer.
   1. Erstens machen TMK-Glycerin-Puffer durch die Kombination von TMK Puffer 7 ml und 3 ml Glycerin.
   2. 800 μl der TMK-Glycerin-Puffer fügen Sie hinzu, 100 μl der Stammlösung DM und 100 μl der Stammlösung OG. Speichern Sie diese SB-Arbeitslösung, mit DM und 2 % OG 2 %, bei-20 ° C in 1 mL Aliquote eingefroren.
      Hinweis: Jedes aliquoten kann aufgetaut und gefroren, je nach Bedarf.

3. Gießen grüne Mini-Gele für die spätere Verwendung

1. Bereiten Sie separate stapeln und Gel-Lösungen in 15 mL Einweg Reagenzgläsern zu lösen.
   Hinweis: Die Bände vorgesehen sind ausreichend für ein einziges Mini Gel mit 1,5 mm Platte Spacer.
   1. Um die Stapeln Gel-Lösung zu machen, verbinden Sie 1,25 mL 4 x Stapeln Gel-Puffer, 0,5 mL 40 % Acrylamid-Stammlösung (39: 1 C) und 3,25 mL Wasser, 5 mL 4 % Acrylamid in 1 x Stapeln Puffer zu geben. Um die Lösung von Gel machen Lösung kombinieren 1,875 mL 4 x Puffer, 0,94 mL 40 % Acrylamid-Stammlösung (39: 1 C) und 4,7 mL Wasser 7,5 mL 5 % Acrylamid in 1 x Puffer zu lösen geben zu lösen.
2. Gießen Sie die Lösung von Gel.
   1. Die Lösung von Gel-Lösung fügen Sie 50 μL der 10 % Ammonium Bleichen (APS hinzu) dann fügen Sie 10 μl TEMED hinzu, Röhrchen Sie die und invertieren Sie sanft mehrmals zu mischen. Gießen Sie sofort die Gel-Lösung zwischen den Gel-Platten, so dass ca. 1 cm zwischen dem oberen Ende der Lösung von Gel und Unterseite der Kamm Zähne für das Stapeln Gel.
   2. Pipette vorsichtig 100 % Ethanol auf den oberen Teil der Lösung von Gel auf das Gel.
      Hinweis: Wenn das Gel nicht innerhalb von 15 Minuten einstellt, frische APS-Lösung unternommen werden und/oder neue TEMED sollte verwendet werden.
   3. Nachdem das Gel polymerisiert hat (die Schnittstelle zwischen dem Gel und Ethanol werden gut sichtbar und wird nicht verschoben, wenn das Gel gekippt ist), Gießen aus Ethanol und Fleck mit einem saugfähigen Papier.
3. Gießen Sie das stapelnde Gel.
   1. Hinzufügen von 25 μl 10 % APS der stapelnden Gel-Lösung hinzufügen 5 μl TEMED, dann Kappe und Sohle, in der gleichen Weise wie das Auflösen von Gel zu mischen. Gießen Sie die Gel-Lösung auf die Lösung von Gel zu, bis der Raum zwischen den Platten vollständig gefüllt ist, und legen Sie einen 10-Well-Kamm.
      Hinweis: Wenn Sie bereit sind, verwendet werden, entfernen den Kamm aus dem Gel und die Brunnen mit Wasser spülen, dafür sorgen, dass die Brunnen gerade und frei von Gel sind. Das Gel kann mindestens mehrere Tage mit dem Kamm bei 4 ° C aufbewahrt werden.

4. Isolierung von Rohöl Thylakoidmembran Membranen aus Spinat lässt

Hinweis: Alle Schritte auf dem Eis mit vorgekühlt Ausrüstung und Puffer durchgeführt werden. Gedämpftes Licht wird auch empfohlen. Je nach Ermessen der Experimentator und die biologischen Prozesse untersucht sollten Phosphatase und/oder Protease-Inhibitoren frisch TMK Puffer vor der Homogenisierung hinzugefügt werden.

1. Vollständig zu homogenisieren Blattspinat in TMK Puffer mit einem Glas Dounce-Homogenisator.
   Hinweis: Etwa 1 bis 2 mL des Puffers ist normalerweise ausreichend für ein kleines Baby-Spinat-Blatt. Ein einziges Baby Spinat Blatt bieten in der Regel genug Material, um mehrere Brunnen auf einem 1,5 mm Mini Gel zu laden.
2. Filtern Sie die groben Blatt Homogenat um unlösliche Ablagerungen zu entfernen.
   1. Zu einem einfachen Filtergerät, schneiden Sie eine heikle Aufgabe wischen halbieren und Vierteln Falten. Packen Sie die heikle Aufgabe wischen in den unteren Teil einer 5 mL-Einwegspritze und Vornässen Sie wischen mit TMK Puffer.
   2. Verwenden Sie den Spritzenkolben drücken überschüssigen Puffer aus der heiklen Aufgabe wischen und sicher sein, dass die Wipe-Filter fest auf den Boden der Spritze gedrückt wird, nachdem der Kolben entfernt wird.
   3. Pipette die Blatt-Homogenat auf die Mitte des Filters wischen und den Kolben zu verwenden, um das Homogenat durch den Filter übergeben. Sammeln Sie die gefilterten Homogenat in einem 1,5 mL Zentrifugenröhrchen.
3. Zentrifugieren Sie das Homogenat bei 5.000 x g für 10 min bei 4° C zu unlöslichen Material, einschließlich der Thylakoidmembran Membranen Pellets. Den Überstand verwerfen und das Pellet in 1 mL der TMK Puffer Aufschwemmen.
4. Normalisieren Sie die Menge an Chlorophyll in jeder Probe die Lautstärke jeder resuspendierte Thylakoidmembran Probe so angepasst, dass jede Probe den gleichen Gesamtbetrag des Chlorophylls enthält, wie unten beschrieben.
   Hinweis: Dadurch kann jede Probe, die in die gleiche Menge an Waschmittel solubilisiert und Variabilität in der Solubilisierung aufgrund von Unterschieden in Pellet-Volumen minimiert.
   1. Um Chlorophyll von jeder Probe resuspendierte Thylakoidmembran Membranen zu extrahieren, nehmen Sie 50 μL aliquoten in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und fügen Sie 950 μL des Methanols hinzu. Die Röhrchen und durch invertieren mehrmals mischen.
   2. Zentrifugieren des Methanol/Chlorophyll-Extraktes bei 10.000 x g für 10 min bis zum pellet-ausgefällten Proteine.
   3. Bestimmen Sie die Chlorophyllkonzentration des Pigments mit Überstand nach Porra Et Al. ²³. Extinktion Lesungen bei 652 und 665 nm mit einem Spektrophotometer und ein 1 cm-Küvetten zu nehmen. Bestimmen Sie insgesamt Chlorophyllkonzentration unter Verwendung der folgenden Gleichung:
      Chls ein + b (μg/mL) = 22.12 (Abs 652 nm) + 2,71 (Abs 665 nm)
   4. Mit Hilfe von Chlorophyll Konzentrationsmessungen als Leitfaden, entfernen Sie und entsorgen Sie etwas Volumen von jeder Probe, wie nötig, so dass jedes Röhrchen den gleichen Gesamtbetrag des Chlorophylls enthält.
5. Neu pellet Thylakoidmembran Membranen durch Zentrifugation bei 5.000 x g für 10 min. entfernen und entsorgen des Überstands. Achten Sie darauf, alle überstand zu entfernen, ohne Absaugen eines Pellet.

(5) Solubilization der Thylakoidmembran Membranen für die Verladung auf Native Gele

1. Tauen Sie ein Aliquot der TMK 30 % Glycerin Reinigungslösung (SB auf) und invertieren Sie mehrmals zu mischen. Halten Sie es auf dem Eis.
2. Auflösen der Thylakoidmembran Pellet indem man das entsprechende Volumen der SB eine Chlorophyllkonzentration von 1 mg/mL zu geben.
   Hinweis: Diese Konzentration ist ein Ausgangspunkt für die Suche nach der optimalen Solubilisierung Bedingungen, die empirisch ermittelt werden müssen. Die Chlorophyllkonzentration aufzubewahren Gleiches zwischen Proben, um gültige Vergleiche gemacht werden können.
3. Pipette rauf und runter wiederholt, wobei Sie darauf achten, Aufschäumen der Probe. Halten Sie auf dem Eis zu solubilisieren Thylakoidmembran Proben zu ermöglichen.
   Hinweis: Solubilisieren Sie für mindestens 10 Minuten. Solubilisierung Zeit sollte lang genug sein, dass die Solubilisierung zeitliche Differenz zwischen Proben minimiert wird.
   Beispiel: Wenn 3 Minuten erforderlich sind, um alle Proben zu lösen, sollte etwa 30 Minuten für die Solubilisierung erlaubt.
4. Zentrifugieren Sie solubilisiert Thylakoids bei 10.000 x g bei 4 ° C zu unlöslichen Material zu Pellets.
   Hinweis: Solubilisiert Thylakoidmembran Proben sind auf Eis für Stunden stabil, aber Lagerung bei-70 ° C sollte vermieden werden, da Frost-Tau-Wechseln zu einem Verlust von Megacomplex Bands führen können.

6. Trennung von solubilisiert Thylakoidmembran Proteine durch gebürtige Gelelektrophorese

1. Laden Sie die solubilized Thylakoidmembran Überstand in Schritt 5.4 direkt auf das native Gel vorbereitet früher vorbereitet. Laden Sie für ein 1,5 mm Gel 15 μl solubilisiert Thylakoidmembran pro Bohrloch.
2. Führen Sie das native grüne Gel in im Wesentlichen die gleiche Weise wie SDS-PAGE Gelen mit 1 x Puffer laufen. Führen Sie das Gel bei 100 V und platzieren Sie den gesamten Gel Tank auf nassem Eis für die Dauer des Laufes, Ohmsche Heizung des Gels zu mildern.
   Hinweis: Das Gel benötigen ca. 2 Stunden für das kostenlose Pigment Migration vorne an der Unterseite des Gels (Abbildung 1) zu erreichen.

(7) Exzision der Thylakoidmembran Komplex Bands aus heimischen grün Gele

Hinweis: Besteuert bestimmte Band von Interesse aus dem Gel ist erforderlich, damit die Band in den Strahlengang gebracht werden und verhindern, dass streunende Fluoreszenz vom nahe gelegenen Anlagen gesammelt.

1. Entfernen Sie das Gel aus der Elektrophorese Zell- und laufen Puffer aus dem Gel-Platten mit destilliertem Wasser spülen. Entfernen Sie die obere Platte aus dem Gel und spülen Sie das Gel mit destilliertem Wasser ab.
2. Halten Sie das Gel auf der unteren Glasplatte und das Gel und die Platte auf Eis. Wenn nicht in Gebrauch, halten Sie das Gel in die Dunkelheit und decken mit einer Plastikfolie um es vor dem Austrocknen zu verhindern.
3. Mit dem Gel auf die Glasplatte Verbrauchsteuern Sie jedes Band von Interesse, wenn Sie bereit sind für die TCSPC Analyse. Verbrauchsteuern Sie-Bands sauber mit einem scharfen Skalpell oder einer Rasierklinge und sorgen Sie dafür, dass die ausgeschnittene Band keine kontaminierenden Bandmaterial enthält.

(8) Sammlung von Raumtemperatur Steady-State Fluoreszenz Spektren

1. Für jede Anlage, die von TCSPC analysiert wird, wird eine Raumtemperatur-Fluoreszenz-Spektrum zwischen 600 und 800 nm mit einem Fluoreszenz-Spektrometer übernommen.
   Hinweis: Die Erregung Wellenlänge verwendet, um dieses Spektrums sammeln muss für TCSPC verwendete Wellenlänge entsprechen.

9. TCSPC grüne Gel Bands

Hinweis: Finden Sie in Abbildung 2 eine Darstellung des TCSPC Setup.

1. Sandwich-Gel-Scheibe zwischen zwei Glasplatten Mikroskopie. Verwenden Sie Klebeband, platziert an jedem Ende eines Mikroskopie-Folien und gefaltet, mehrere Male, um Abstandhalter zu erstellen, damit die Folien fest zusammengehalten werden können ohne Komprimierung des Gel-Slices.
   Hinweis: Dies erstellt einen Pfad für den Laserstrahl zwischen den Objektträger und durch das Gel Segment übergeben.
2. Gel-Scheibe am Rand der Glas-Folien eine glatte Oberfläche zu erstellen, die Signal-Streuung zu reduzieren, wird fügen Sie eine kleine Menge Wasser hinzu.
3. Klemme die Gel/Folie sandwich im Strahlengang, so dass der Strahl trifft die Gel-Schnitt durch die offene Kante der Platten, so dass Fluoreszenzemission werden durch die Seite der Glas-Folien in dem das Gel eingeklemmt ist, senkrecht zu den Strahlengang.
   Hinweis: Die verwendete Wellenlänge Erregung hängt von dem Experiment. Einer Wellenlänge von 435 nm wird begeistern, Chlorophyll A und Chlorophyll B, während 465 nm wird bevorzugt Chlorophyll B begeistern. In diesem Fall, 435 nm diente als Anregung Wellenlänge.
4. Sammeln Sie 10.000 insgesamt Datenpunkte in regelmäßigen Abständen über die Fluoreszenz Emission Spektrum für jede Anlage. Zum Beispiel sammeln Daten alle 10 nm, beginnend bei 680 nm und endet bei 750 nm.
   Hinweis: Bereiten Sie mehrere Gel-Bänder für jede Anlage untersucht werden, so dass dieser frische Probe zur Verfügung steht, die Immunofluoreszenz angemessene Signal Sammlung verhindert.

10. TCSPC (Datenanalyse)

1. Für einen gegebenen Komplex zuerst normalisieren Sie die Peakhöhe jeder Zerfall-Kurve für alle Wellenlängen gesammelt.
   Hinweis: Dieser Schritt ist nicht erforderlich für den Bau der DAS aber für Zerfall Kurven überlagert und als eine erste Inspektion der Daten visuell miteinander verglichen werden kann.
2. Tail-Match jeder Zerfall Kurve das Steady-State-Fluoreszenz-Spektrum des Komplexes wie unten beschrieben.
   1. Wählen Sie eine Timepoint nach dem Zerfall Signal heraus, in der Regel nach ein paar Nanosekunden abgeflacht hat.
   2. Für jede Wellenlänge normalisieren Verfall Kurve, so dass die Signalintensität in der ausgewählten Timepoint gleich dem Wert der Steady-State-Fluoreszenz-Spektrum bei dieser Wellenlänge ist (d. h. die Werte alle Wellenlängen zusammen an den ausgewählten Timepoint wird die Steady-State-Fluoreszenz-Spektrum neu erstellen).
3. Verfall-Mitarbeiterin Spektren (ZVE) aus den Kurven Rute abgestimmt Verfall zu bauen, wie unten beschrieben.
   1. Verwendung von Daten Punkte aus den Schweif abgestimmt Verfall Kurven konstruieren eine Reihe von Parzellen, die grafische Darstellung Fluoreszenzintensität vs. Wellenlänge in regelmäßigen Zeitabständen (z.B. alle 10 Ps). Zum Beispiel ist DAS an 50 Ps gebaut, durch Auftragen des Wertes jeder Kurve Verfall bei 50 Ps vs. Wellenlänge.
   2. Überlagerung aller den Verfall-assoziierten Spektren einen Wasserfall-Stil-Plot zu erstellen, der den Verfall der Fluoreszenz-Spektrum im Laufe der Zeit anzeigt.

Ergebnisse

Repräsentative Ergebnisse für grüne Gelelektrophorese sind in Abbildung 1dargestellt. Bahn 1 enthält ein Beispiel für optimale Ergebnisse für grüne Gelelektrophorese von Spinat Thylakoids, in denen eine maximale Anzahl an klare, gestochen scharfe grüne Bänder sichtbar sind. Diese Ergebnisse sind teilweise etwas untypisch, weil nicht alle Bands gesehen in Spur 1 normalerweise in einer Probe vorhanden sind. Zusätzliche Probe Bereinigung, in Form von C...

Diskussion

Eine erfolgreiche Thylakoidmembran Solubilisierung und native Gel laufen führt die Auflösung der mehrere deutliche sichtbare grüne Bänder auf dem Gel ohne signifikante Verzerrung oder Verschmieren der Bands. Überlasten das Gel, eine hohe Konzentration Waschmittel, eine falsche Beispiel pH-Wert, ungelösten Material, das Gel zu laufen, zu schnell oder bei zu hohen Temperaturen, und eine unsachgemäß gegossene Gel sind alle Faktoren, die zu schlecht gelöst Thylakoidmembran komplexe beitragen können. Bei gleichzeiti...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycine	Sigma	G8898
Tris base	Sigma	#648310
SDS	Sigma	L3771
Decyl Maltoside	Sigma	D7658	n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside
Octyl Glucoside	Sigma	O8001
Acrylamide	BioRad	161-0148	37.5/1 C 40% solution
TEMED	BioRad	161-0800
Ammonium Persulfate	BioRad	161-0700
Magnesium Chloride	Sigma	M2670
Potassium Chloride	Sigma	P9333