Ispanak Thylakoid Protein kompleksleri yerli yeşil Jel Elektroforez ve grup Time-Correlated tek foton sayma kullanarak karakterizasyonu tarafından ayrılması

Özet

Burada çözündürüldükten thylakoid kompleksleri tarafından yerel Yeşil Jel Elektroforez ayırmak için bir iletişim kuralı mevcut. Yeşil Jel bantları daha sonra zaman korelasyon tek foton sayma (TCSPC tarafından) karakterizedir ve veri analizi için temel adımlar sağlanır.

Özet

Fotosentez ışık reaksiyonları thylakoid membranlarda pigmentli protein kompleksleri bir dizi tarafından yapılmaktadır. Stoichiometry ve bu komplekslerin organizasyon son derece dinamik hem uzun hem de kısa süre ölçekler fotosentez için değişen çevre koşullarına uyum süreçleri nedeniyle (Yani, fotokimyasal sigara Şoklama, durum geçişlerini ve uzun vadeli yanıt). Tarihsel olarak, bu işlemler spectroscopically değişiklikler açısından Klorofil Floresans tarif edilmistir ve Spektroskopi fotosentetik parametreleri izlemek için hayati bir yöntem kalır. Sınırlı birkaç temel protein karmaşık dinamiklerini görüntülenmeyecektir yolu vardır. Burada yüksek çözünürlüklü ayrılık ve thylakoid kompleksleri, yerel Yeşil Jel Elektroforez görselleştirme için hızlı ve basit bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem tek foton ilişkili süre bantları üzerinde yeşil jel ayrılmış Klorofil Floresans özelliklerini detaylı karakterizasyonu için sayma ile birleştirilmiştir.

Giriş

Fotosentetik canlılar sürekli değişen çevre koşullarına verimliliği maksimize etmek ve başarıyla komşular¹ile rekabet için onların Fizyoloji ayarlamanız gerekir. Bu makine ortam ışığı koşulları tarafından üç büyüklük gölgeler ve tam güneş ışığı altında arasında dalgalanma olarak fotosentez, ışık reaksiyonları için sorumlu özellikle doğrudur. Ayrıca, kuraklık, soğuk veya sıcak stres gibi çevresel faktörler karbon dioksit doğal elektron lavabom ışık reaksiyonları ürünler için karbon fiksasyonu için kullanılabilirliğini azaltabilir. Bitki gerekir, bu nedenle, hasat ve güneş radyasyonu gerektiği gibi aşırı ışık enerjisini dağıtmak yeteneği koruyarak mümkün olduğunca verimli bir şekilde kullanmak. Photooxidative hasar hala düzenli olarak tüm ışık koşullarında²altında^,3, başarısızlık yönetmek için absorbe uyarma enerji başarıyla felaket hücre hasarı ve ölüme yol açabilir sırasında oluşur. Birkaç adaptif mekanizmaların hakim çevre koşulları değişiklikler ve geçici dalgalanmalar (Yani, kısa ve uzun timescales üzerinden)⁴şekilde ayarlanmış fotosentetik aparatı izin yok. Bu uzun vadeli yanıt (soldan sağa) ve olmayan fotokimyasal Şoklama (NPQ) içerir. NPQ kendisi durum geçişlerini (qT), hızla indüklenebilir enerji su verme (qE) ve photoinhibition (qI)⁵de dahil olmak üzere en az üç bileşen olayları kapsayacak şekilde kabul olduğunu.

Bu işlemler aslında gözlenen ve büyük ölçüde spektroskopik olayları açısından tanımlanan [Örneğin, NPQ anlamına gelir bir damla oranı artış nedeniyle değil (Klorofil Floresans Şoklama) gözlenen Klorofil Floresans içinde photochemistry]⁶. "Durum geçişlerini" benzer şekilde gözlenen için bir terimdir floresans PSI ve PSII⁷göreli miktarını değiştirin. Süre bu olayların numaralandırma mümkün kılmıştır spektroskopik teknikleri [özellikle, darbe genlik modülasyonlu (PAM) floresans spektroskopisi] ve gözlemleyerek ve fotosentetik süreçleri içinde dissekan için hayati bir araç olmaya devam Vivo, büyük bir biyokimya spektroskopik bu gözlemler temel mekanizmaları aydınlatmak için gereklidir. Devlet geçişler, örneğin, LHCII protein fosforilasyon/dephosphorylation döngüsünü STN7 kinaz ve TAP38/PPH1 fosfataz, sırasıyla^8,9,10içerir. Bu döngü LHCII anten hareket ettirerek LHCII trimers bir bölümünü PSII böylece emme değiştirerek PSI için iki photosystems arasında fiziksel dağıtım ayarlar kesit photosystems^11,12. NPQ qE bileşeni hızla ısı violaxanthin/zeaksantin epoxidation/de-epoxidation döngüsü ve PsbS protein eylemlerle aşırı uyarma enerji dönüştürür. Tam PsbS bu süreçte hareketsiz değil tam olarak¹³anlaşılmış roldür. NPQ, photoinhibition, qI bileşeni genellikle PSII D1 protein zarar atfedilir. Restorasyon tam fotosentetik yeterlilik bozuk PSII photocenters düzeltmek için bir ayrıntılı onarım işlemi gerektirir. PSII onarım döngüsü PSII kompleksleri granal yığınları, kompleksleri sökülmesi, değişimi hasarlı D1 proteinlerin, yeniden birleştirilmesinden PSII kompleksleri ve PSII kompleksleri hareketi granal yığınları¹⁴içine geri dışarı geçiş içerir. Photoinhibition ve PSII duyarlilik kesin yapısını bir konu yoğun İnceleme¹⁵kalır.

Olayları devlet gibi eğitim zorluk geçişler veya PSII onarım kısmen karmaşık biyokimyasal sistemlerin mekaniği görselleştirmek için bir basit yolu olduğu gerçeğini doğar. Bir süreci anlamak için klasik biyokimyasal yaklaşım onlar yalıtım modunda karakterize edilebilir böylece önce bileşenlerinin ayırmaktır. Yerel jel elektroforez başarılı çalışmalar ayrı ve thylakoid membran ile daha fazla partiye hazırlık Yöntemleri (yani sükroz degrade Santrifüjü ve Kromatografi)¹⁶üzerinden photosystem kompleksleri karakterize 1980'lerde ortaya çıktı. Yavaşça solubilize thylakoid membran üzerinden yerel kompleksleri için geliştirilen deterjan sistemleri yakında en önemlisi Allen ve Staehelin¹⁷ tarafından elektroforetik ayrımı yöntemleri için uyarlandı ve ve sebebiyet veren Peter ve Thornber¹⁸, yerli yeşil Jel Elektroforez için. Çeşitli teknikler deneysel cephanelik, yerel sayfa dışında temsil eden tek kişi fotosentez araştırmalarda yaygın olarak çalışan bir yöntem yapmış çekici özellikleri bir dizi varken. Yerel sayfa nispeten hızlı ve basit, aynı anda çok sayıda thylakoid kompleksleri ayrılması yüksek çözünürlüklü sağlarken küçük özel ekipman gerektiren. Bu uygun bir araç için thylakoid dynamics eğitimi ve, ikinci boyutu yanı sıra bulmak ve yeni thylakoid kompleksleri karakterize için çok yönlü bir sistem deterjan ve tampon sistemleri, çeşitli standart sayfa ile birlikte ne zaman yerel sayfa yapar.

Gibi belirsiz, smeary jeller kaç şeritli oluşan kötü sonuçlar üretmek kolay olduğu söyleniyor, güvenilmez bir tekniği, özellikle de deneyimsiz ellerde olduğun için bir itibar yerli yeşil jelleri oldu. Bu sorunu, kısmen, mavi-yerli sayfa¹⁹giriş ile çözüldü. BN tampon sistemi coommassie boya kullanımı protein ayrımı daha sağlam yapar. Bu nedenle, BN-sayfa kez kurmak göreli bir acemi için daha kolay ve daha güvenilir bir teknik ve yüksek çözünürlüklü ayrımları thylakoid kompleksleri, sağlayabilir. Bu nedenlerden dolayı BN SAYFALIK bu alanın çoğu iş için seçim yöntemi haline gelmiştir. BN-sayfa çalıştırmak Yeşil Jel Elektroforez, onun büyük dezavantajı olduğunu genellikle daha yavaş olmakla birlikte coommassie boya boyama aşağı akım yaparken aynı zamanda zayıf bantları, klorofil içeren tanımlaması engelleyen spektroskopik karakterizasyonu sorunlu.

Biyokimyasal bilgilerini yerel jelleri tarafından sağlanan ve 2D SDS-sayfa büyük ölçüde spektroskopik teknikleri verilerle birleştirildiğinde güçlendirilmiş. İstihdam ne olursa olsun, konut projeleri belirlemek için yerel jeller kullanarak merkezi bir sorun kimliği her zaman meydan okunabilir sistemidir (proteinler bir grupta bulunduYani, her zaman temsil comigrating kompleksleri veya bileşenleri, daha doğrusu tek fizyolojik otantik karmaşık bir). Spektroskopik karakterizasyonu yeşil jel bantlarında pigmentler biyofiziksel Kılavuzu ve konut projeleri ne tür onlar bulunma olasılığı olduğunu belirlemek için kullanılır. Klorofil Floresans bu konuda sık sık önemli ölçüde farklı spectra ve farklı fotosentetik pigment-protein kompleksleri karakteristik floresans ömürleri nedeniyle özellikle yararlıdır. Ise basit kararlı durum 77 K floresans spectra tarihsel olarak yerli jel kompleksleri kimliklerini doğrulayan yararlı olabilirdi, (TCSPC) sayma modern ilişkili süre tek foton çok daha fazla bilgi sağlayabilir. TCSPC sadece floresan ömürleri üzerinde dayalı kompleksleri karakterizasyonu verir, ancak aynı zamanda enerji transferi bir kompleksi içinde spektral bileşenler arasındaki ayrıntılı açıklaması mümkün kılar. Bu tür bir karakterizasyonu olarak çeşitli yerel jel sistemleri yayılır kullanımı giderek gerekli hale geliyor ve daha iyi doğrulanması için protein kompleksleri tanımlamasını sağlayan ve yeni sağlayan yeni sözde kompleksleri keşfedilir Bu komplekslerin nasıl çalıştığı hakkında biyofiziksel bilgi.

Bu yazıda biz bu ışık reaksiyonları mekaniği araştırılması amacıyla yerel thylakoid kompleksleri, yüksek nitelik kararlılık elde etmek için yerel jel elektroforez ile az veya hiç deneyimi olan sağlayan bir yöntem sağlar fotosentez. Bu temel teknik sonra sonuçları geliştirmek veya diğer türler için uygulanabilirlik genişletmek için deneyci'nın takdirine artar olabilir. O zaman TCSPC, temel analiz ve teknik tarafından sağlanan verilerin sunumunu için bazı adımlar olarak yerli yeşil jel bantları tutulmasi için işlemi açıklar. Yerel jel elektroforez TCSPC analizi ile bağlantı yardımcı programı bu jel sistemlerinin protein kompleksleri bantları içindeki malzemelerin kimlik doğrulaması ve biyofiziksel sağlayarak genişletir. Burada açıklanan yeşil jel sistemi Allen ve Staehelin¹⁷ bazı değişikliklerle tarafından geliştirilen ve Schwarz ve arkiçinde kullanılan ile aynı temel alır. ²⁰. bu sistem birçok biridir ancak için bu yöntem yararlıdır belirli özelliklere sahiptir. Thylakoid yalıtım, Jel Elektroforez ve TCSPC Analizi uygun bir günde, olası sorunları örnek depolama ve yıkımı obviating yapılabilir böylece yeterince hızlı. Biz de bu yöntem sonuçları arasında iyi üstün, en iyi duruma getirme derecesine bağlı olarak değişen sağlarken deneyimsiz kullanıcılar, elinde sağlam olduğunu bulmak.

Kullanılan deterjan ve arabellek sistemlerinin yanı sıra soruşturma altında organizma biyolojisi üzerinde yerel bir jel görselleştirildiği kompleksleri bağlı akılda tutulması önemlidir. Farklı deterjan ve tampon sistemleri tercihen kompleksler farklı türde ayırın ve belirli bir fotosentetik organizma farklı kompleksleri gelen tüm bunların altında verilen herhangi bir durum mevcut olacaktır diğer organizmalar olacaktır. Burada açıklanan sistem Schwarz ve arkiçinde açıklandığı gibi özellikle PSI megacomplexes, çalışma için uygundur. ²⁰, ama düşüyor spektrumunun daha destabilizing ucunda PSII megacomplexes eğitim görenler için. Çeşitli deterjan ve tampon sistemleri yerli jel elektroforez thylakoid proteinlerin içinde kullanılan kapsamlı bir çalışma için bu göl ve arkincelemek için tavsiye edilir. ²¹ ve Rantala vd. ²².

Protokol

1. stok çözümleri hazırlık yerli yeşil jelleri dökme için

1. 4 konsantre arabellek çözüm x % 40 gliserol, 200 mM glisin ve 100 mM Tris pH 8.3 arabelleğe oluşan jelleri çözmek için hazır olun.
2. 4 konsantre arabellek çözüm x % 40 gliserol, 200 mM glisin ve 100 mM Tris pH 6.3 arabelleğe oluşan yığın jelleri hazırlamak.
3. Bu arabellekleri 4 ° C'de küf gelişimini önlemek için saklayın.
   Not: 100-200 mL her arabellek hazırlanması için kullanmaya devam etmeniz önerilir böylece arabellekleri 4 ° c, ay boyunca stabildir.
4. 10 250 mM Tris HCl pH 8.3, içeren tampon çalıştıran x 1 L hazırlamak 1.92 M glisin ve % 1 SDS. Arabellek benchtop üzerinde çalışan x 10 saklayın.

2. hisse senedi çözüm hazırlık yalıtım ve Thylakoids Solubilization için

1. TMK homojenizasyon arabelleği 50 mM Tris arabellek (pH 7), 10 mM MgCl₂ve 10 mM KCl içeren 100 mL hazırlamak ve 4 ° C'de depolayın
   Not: Bu homojenizasyon ve thylakoid örnekleri düzenleme için ana arabellek olduğunu. Alternatif olarak, konsantre hisse senedi çözümleri hazırlanan ve gerektiğinde (Tris arabellek, MgCl₂ve 1 M yoğunlaşmaktadır gibi kolayca benchtop üzerinde depolanması KCl can tüm) seyreltilmiş.
2. Thylakoid hisse senedi çözümler her deterjan TMK arabelleği % 20 w / donma v. 1 mL aliquots-20 ° C'de çözülerek solubilization deterjanlar, B-disil maltoside (DM) ve n-Oktil B-d-glucoside (OG), hazır olun.
3. Thylakoid solubilization arabellek (SB), aynı zamanda örnek yükleme arabellek hazırlayın.
   1. İlk olarak, TMK arabelleği 7 mLs ve gliserol 3 mLs birleştirerek olun TMK-gliserol arabellek.
   2. İçin 800 μL TMK-gliserol arabelleği 100 μL DM hisse senedi çözüm ve 100 μL OG hisse senedi çözüm ekleyin. 1 mL aliquots-20 ° C arasında dondurulup % 2 DM ve %2 OG içeren bu SB çalışma çözüm saklayın.
      Not: Her aliquot çözdürülen ve gerektiği gibi refrozen.

3. daha sonra kullanmak üzere yeşil Mini jelleri dökme

1. Ayrı istifleme ve jeli 15 mL tek kullanımlık test tüpleri çözümlerinde çözme hazırlayın.
   Not: sağlanan birimleri 1.5 mm plaka çubukları kullanarak tek bir mini jel için yeterlidir.
   1. Yığın jel çözüm yapmak için 4 x yığın jel arabellek, 0.5 mL % 40 akrilamid stok çözeltisi (39:1 C) ve 3.25 mL su 1 yığın arabellek x 5 mL % 4 akrilamid de vermek için 1,25 mL birleştirir. Çözüm çözme jel yapmak için 4 arabellek, 0,94 mL % 40 akrilamid stok çözeltisi (39:1 C) ve 4.7 mL su 1 arabellek çözme x 7,5 mL % 5 akrilamid vermek için çözümleme x 1,875 mL birleştirir.
2. Çözme jel dökmek.
   1. Çözme jel ekleyin 50 μL % 10 amonyum Persülfat (APS), sonra TEMED 10 μL eklemek, tüp kap ve karıştırmak için birkaç kez yavaşça tersine çevirin. Hemen çözme jel ve alt kısmındaki yığma jel tarak dişleri arasında yaklaşık 1 cm bırakarak jel plakaları arasında jel solüsyonu dökün.
   2. Hafifçe üst düzeye jel çözme jel üzerine % 100 etanol pipet.
      Not: jel 15 dk içinde ayarlı değil, taze APS çözüm yapılmalıdır ve/veya yeni TEMED kullanılmalıdır.
   3. Sonra jel polimerli (jel ve etanol arasında arayüz kolayca görülebilir ve jel sızdırdığında hareket etmez), etanol ve leke bir emici kağıt ile kapalı dökün.
3. Yığın jel dökmek.
   1. 25 eklemek μL % 10 APS yığın jel çözüme eklemek TEMED, 5 μL sonra kap ve çözme jel aynı şekilde karıştırmak için ters çevir. Plakaları arasındaki boşluğu tamamen doldurulana kadar çözme jel üstünde jel solüsyonu dökün ve bir 10-iyi tarak ekleyin.
      Not: kullanılmak üzere hazır olduğunuzda jel tarak kaldırın ve kuyu kuyu düz ve jel tarafından kapatılmamış olduğundan emin yapma suyla durulayın. Jel yerde 4 ° C'de tarak ile en az birkaç gün saklanabilir.

4. ıspanak gelen ham Thylakoid membran izolasyon bırakır

Not: Tüm adımları önceden soğutulmuş ekipman ve arabellekleri kullanarak buza yürütülmesi gereken. Loş ışık da önerilir. Deneyci'nın takdirine bağlı olarak ve biyolojik süreçlerin altında eğitim bağlı olarak, proteaz ve/veya fosfataz inhibitörleri TMK arabellekleri homojenizasyon önce taze eklenmelidir.

1. Tamamen ıspanak yaprakları TMK arabellekte bir cam Dounce homogenizer ile homojenize.
   Not: Normalde bir küçük bebek ıspanak yaprağı için yaklaşık 1-2 mL arabelleği yeterlidir. Bir tek bebek ıspanak yaprağı genellikle 1.5 mm mini jel birkaç wells yüklemek için yeterli malzeme sağlar.
2. Çözünmez enkaz kaldırmak için ham yaprak homogenate filtre.
   1. Basit bir yapmak için filtreleme aygıtı, hassas bir görev kesilmiş yarısında silin ve dört eşit parçaya katlayın. Hassas görev silme 5 mL tek kullanımlık şırınga dibine paketi ve TMK arabelleği ile silin önceden ıslak.
   2. Şırınga pistonu aşırı arabellek yetersiz hassas görev silme tuşuna basın ve pistonu kaldırıldıktan sonra Temizleme işlemi filtre şırınga altına sıkıca basılı olduğundan emin olmak için kullanın.
   3. Yaprak homogenate Temizleme işlemi filtre ortasına üzerine pipette ve pistonu homogenate filtreden geçmek için kullanın. Filtre uygulanmış homogenate 1,5 mL santrifüj tüpü içinde toplamak.
3. Homogenate 5000 x g 4 ° C'de çözünmez malzeme thylakoid membranlar dahil olmak üzere, cips için 10 dk de santrifüj kapasitesi. Süpernatant atın ve Pelet TMK arabellek 1 mL resuspend.
4. Her örnek içinde Klorofil miktarı böylece klorofil, aynı toplam miktarı her örnek içerir her resuspended thylakoid örnek aşağıda açıklandığı gibi sesini tarafından normalleştirmek.
   Not: Bu aynı birimin deterjan çözündürüldükten her örnek sağlayacak ve değişkenlik solubilization Pelet birim farklılıkları nedeniyle en aza indirir.
   1. Klorofil resuspended thylakoid membranlar her örnekten ayıklamak için 50 μL 1.5 mL microcentrifuge tüpte aliquot almak ve metanol 950 μL da ekleyin. Tüp kap ve birkaç kez ters çevirme karıştırın.
   2. Metanol/klorofil özü 10.000 x g zarlarını proteinler cips için 10 dakika için de santrifüj kapasitesi.
   3. Porra ve arkgöre süpernatant içeren pigment klorofil konsantrasyonu belirlemek. ²³. 652 ve 665 nm bir spektrofotometre ve 1 cm küvet kullanarak absorbans okumalar alıp. Aşağıdaki denklemi kullanarak toplam klorofil konsantrasyonu belirlemek:
      Chls bir + b (μg/mL) = 22,12 (Abs 652 nm) + 2.71 (Abs 665 nm)
   4. Klorofil konsantrasyon ölçümleri bir kılavuz olarak kullanarak, kaldırmak ve böylece her tüpün klorofil aynı toplam miktarı içerir gerektiğinde, her örnek bazı birimden atın.
5. Yeniden thylakoid membranlar tarafından Santrifüjü 5000 x g 10 dk. çıkarmak için de cips ve süpernatant atın. Tüm süpernatant Pelet hiçbirini aspirating olmadan kaldırmak için dikkatli olun.

5. solubilization yerli jelleri üzerine yükleme için Thylakoid membranlar

1. TMK % 30 gliserol deterjan solüsyonu (SB) bir aliquot çözülme ve karıştırmak için birkaç kez tersine çevirin. Buz üstünde tutun.
2. Thylakoid Pelet SB klorofil konsantrasyonu 1 mg/ml vermek için uygun hacmi ekleyerek geçiyoruz.
   Not: Bu konsantrasyon ampirik olarak belirlenmelidir koşullarına en uygun solubilization bulmak için bir başlangıç noktasıdır. Klorofil konsantrasyon geçerli karşılaştırmaların yapılmasına olanak örnekleri arasında aynı tutulmalıdır.
3. Yukarı ve aşağı üst üste örnek renginde solma önlemek dikkatli olurken pipet. Thylakoid örnekleri solubilize izin vermek için buz üzerinde tutun.
   Not: en az 10 dakika Solubilize. Solubilization zaman solubilization zaman örnekleri arasındaki farkı en aza indirgemek yeterince uzun olmalıdır.
   Örnek: 3 dakika tüm örneklerini solubilize gerekiyorsa, sonra yaklaşık 30 dakika solubilization için izin verilmelidir.
4. Çözündürüldükten thylakoids 4 ° C'de çözünmez malzeme cips için 10.000 x g, santrifüj kapasitesi.
   Not: Çözündürüldükten thylakoid örnekleri buz üzerinde saatlerce sabit, ama donma-çözülme döngüsü megacomplex bantları kaybına neden olabileceğinden depolama-70 ° C'de kaçınılmalıdır.

6. çözündürüldükten Thylakoid proteinler tarafından yerel jel elektroforez ayrılması

1. Solubilized thylakoid süpernatant daha önceden hazırlanmış adımda 5,4 doğrudan yerel jel üzerine hazırlanan yükleyin. 1.5 mm jel için çözündürüldükten thylakoid iyi başına 15 μL yükleyin.
2. Yerli yeşil jöle 1 tampon çalıştıran x kullanarak SDS-sayfa jelleri temelde aynı şekilde çalışır. Jel 100 V çalıştırın ve tüm jel tankı jel rezistif Isıtma azaltmak için çalışma süresi için ıslak buza koyun.
   Not: Jel yaklaşık 2 saat ücretsiz pigment jel (Şekil 1) alt ulaşmak için geçiş ön için istemeniz gerekir.

7. eksizyon Thylakoid karmaşık gruplarından gelen yerli yeşil jelleri

Not: jel dan ilgi belirli Grup bilincin band ışın yolu yerleştirilmesine ve yakındaki kompleksleri gelen sokak floresans toplanan gelen önlemek için izin vermek gereklidir.

1. Jel Elektroforez hücre ve arabellek jel plakaları kapalı distile su ile çalışan durulama kaldırın. Üst plaka jel kaldırmak ve jel distile su ile durulayın.
2. Jel alt cam plaka üzerinde tutun ve jel ve plaka buza koyun. Kullanılmadığı zaman jel karanlıkta bırakın ve kurumasını önlemek için plastik bir şal ile kaplayın.
3. Cam tabakta kalan jel ile ilgi TCSPC analiz için hazır olduğunda her grubun tüketim. Gruplar bir keskin bistüri veya jilet ile temiz bir şekilde tüketim ve eksize grup bulaşıcı hiçbir grup malzeme içeren ilgilen.

8. oda sıcaklığında kararlı durum floresans Spectra koleksiyonu

1. TCSPC tarafından analiz edilecek her karmaşık, oda sıcaklığında floresans spektrum Floresans Spektrometre kullanılarak 600 ve 800 nm arasında alınır.
   Not: Bu yelpazenin toplamak için kullanılan uyarma dalga dalga boyu TCSPC için kullanılan aynı olmalıdır.

9. TCSPC yeşil jel bantları

Not: TCSPC kurulum bir tasviri için Şekil 2 ' ye bakın.

1. İki cam mikroskobu slayda jel dilim sandviç. Maskeleme bandı, mikroskobu slaytlardan birini her ucunda yerleştirilir ve slaytları birlikte sıkıca jel dilim sıkıştırmadan tutulabilen çubukları oluşturmak için üzerinde birkaç kez katlanıp kullanın.
   Not: Bu lazer ışını mikroskobu slaytlar arasında ve jel dilim üzerinden geçmek için bir yol oluşturur.
2. Su küçük bir miktar sinyal saçılma azaltacaktır pürüzsüz bir arabirim oluşturmak için cam slaytlar kenarında jel dilim ekleyin.
3. Jel/slayt sandviç ışın yolundaki kiriş içinde jel sandviç olduğunu, cam slaytlar yan tarafından ışın yolu dikey olmak floresan emisyon izin plakaları, Açık kenar üzerinden jel dilim vurur böylece kelepçe.
   Not: kullanılan uyarma dalga boyu deney üzerinde bağlıdır. Bir dalga boyu 435 nm heyecanlandırmak klorofil a ve 465 süre klorofil b nm tercihen klorofil b heyecanlandırmak. Bu durumda, 435 nm uyarma dalga boyu kullanıldı.
4. Her karmaşık floresans emisyon yelpazesinde düzenli aralıklarla 10.000 toplam veri puan toplamak. Örneğin, veri toplamak her 10 nm, başlangıç 680 nm ve son 750 nm.
   Not: birden fazla jel bantları photobleaching yeterli sinyal koleksiyonu engeller durumunda, o taze örnek kullanılabilir olacak şekilde belirlenmesi her kompleks için hazırlayın.

10. TCSPC (veri analizi)

1. Belirli bir karmaşık, ilk toplanan tüm dalga boyları için her bozunma eğrisi pik yüksekliği normalleştirmek.
   Not: Bu adım DAS yapımı için gerekli değildir ancak overlaid ve görsel olarak bir başka ilk incelenmesi veri göre çürüme eğrileri sağlar.
2. Kuyruk-her bozunma eğrisi aşağıda açıklandığı gibi karmaşık kararlı duruma floresans yelpazede maç.
   1. Sonra çürüme sinyal, genellikle birkaç nanosaniye sonra dümdüz bir timepoint seçin.
   2. Seçili timepoint sinyal yoğunlukta kararlı duruma floresans spektrum bu dalgaboyu, değerine eşit olması için her dalga boyu, bozunma eğrisi normalize (Yani, tüm dalgaboyu seçili timepoint birlikte değerleri kararlı duruma floresans spektrum yeniden oluşturur).
3. Kuyruk eşlemeli çürüme eğriler üzerinden çürümesi-ortak spectra (DAS) aşağıda açıklandığı gibi oluşturun.
   1. Verileri kullanarak kuyruk eşlemeli çürüme eğri noktaları araziler floresan yoğunluğu vs. dalga boyu düzenli zaman aralıklarında grafik bir dizi oluşturun (Örneğin, her 10 ps). Örneğin, 50 ps DAS dalga boyu vs 50 ps, her çürüme eğri oluşturacak değerini komplo tarafından inşa edilmiştir.
   2. Tüm zaman içinde floresans spektrum çürüme gösterir bir şelale stili çizim oluşturma çürüme ilişkili spectra yerleşimi.

Sonuçlar

Yeşil Jel Elektroforez için temsilcisi sonuçları Şekil 1' de sunulmuştur. 1 yolu için ıspanak thylakoids, net, keskin yeşil grup en büyük bir dizi görünür olan Yeşil Jel Elektroforez için ideal sonuçları gösteren bir örnek sağlar. Hepsi 1 şeride gördünüz gruplar belirli bir örneğinde normalde mevcut değildir çünkü bu sonuçlar kısmen biraz atipik vardır. Ek örnek Temizleme, thylakoid solubilization ve degrade jel elektroforez...

Tartışmalar

Başarılı thylakoid solubilization ve yerel jel çalıştırmak birden çok farklı görünür yeşil bantlar üzerinde önemli bozulma olmadan jel çözümlenmesi veya grupları bulaşması neden olur. Jel aşırı yüksek bir deterjan konsantrasyon, bir yanlış örnek pH çok hızlı veya çok yüksek bir ısıda, jel çalıştıran malzeme, undissolved ve uygun olmayan şekilde döktü bir jel kötü çözülmüş thylakoid kompleksleri için katkıda bulunabilir tüm faktörler vardır. Jel kendisi şartları en i...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycine	Sigma	G8898
Tris base	Sigma	#648310
SDS	Sigma	L3771
Decyl Maltoside	Sigma	D7658	n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside
Octyl Glucoside	Sigma	O8001
Acrylamide	BioRad	161-0148	37.5/1 C 40% solution
TEMED	BioRad	161-0800
Ammonium Persulfate	BioRad	161-0700
Magnesium Chloride	Sigma	M2670
Potassium Chloride	Sigma	P9333