Time-Correlated 単一光子のカウントを使用してネイティブ グリーン ゲル電気泳動とバンドによってほうれん草チラコイドのタンパク質複合体の分離

要約

ネイティブ グリーン ゲル電気泳動による可溶化されたチラコイドの複合体を分離するためのプロトコルをご紹介します。緑のゲルのバンドが後で時間相関単一光子計数 (ピコ) を特徴と、データ分析のための基本的な手順が提供されます。

要約

光合成の明反応はチラコイド膜の色素タンパク質複合体のシリーズによって遂行されます。長くて光合成環境条件の変化に適応するプロセスにより短い時間スケールの化学量論とこれらの複合体の組織は非常にダイナミックな (すなわち、非光化学消光、状態遷移と長期的な応答)。歴史的に、これらのプロセスで説明されている分光変更の面でクロロフィル蛍光と分光法による光合成パラメーターを監視するための重要な方法に残る。基になるタンパク質の複雑なダイナミクスを視覚化できる方法は限られています。ここでシンプルかつ高速高分解能分離とチラコイド錯体、ネイティブの緑のゲルの電気泳動の可視化法について述べる。このメソッドは、時間相関単一光子計数バンド緑のゲルの分離のクロロフィル蛍光特性の詳細な評価のために結合されています。

概要

光合成生物は常に彼らの生産性を最大化し、隣人¹正常に競う環境条件の変化に自分の生理機能を調整する必要があります。これは周囲の光影と完全な日光の間 3 つの一桁によって変動することが条件として、光合成の明反応に責任がある機械の特に当てはまります。さらに、干ばつ、冷、熱ストレスなどの環境要因は炭素固定、光反応の製品の自然の電子のシンクであるため二酸化炭素の可用性を減らすことができます。植物は、必要があります、したがって、収穫し、必要に応じて余分な光エネルギーを消費する能力を維持しながら日射をできるだけ効率的に活用します。一方、光酸化損傷はまだすべて光の条件^2,3、管理の失敗の下で日常的に発生、吸収励起エネルギーが正常に壊滅的な細胞の損傷と死につながることができます。光合成装置の一般的な環境条件の変化と過渡変動 (すなわち、長くて短いタイム スケールで)⁴の両方を調整することができるいくつかの適応メカニズムが存在します。長期的な応答 (LTR) と非光化学消光 (NPQ) が含まれます。状態遷移 (qT)、急速に誘導エネルギー焼入 (qE)、光阻害 (qI)⁵を含む少なくとも 3 つの他のコンポーネント現象を包含すると考え自体は NPQ です。

これらのプロセス最初の観察・分光現象面で大きく定義 [例えばNPQ を指しますドロップ率の増加によるものではない (クロロフィル蛍光の消光) 観察されたクロロフィル蛍光の光化学]⁶。「状態遷移」という用語は同様に PSI と PSII⁷から蛍光性の相対的な量変化を指します。これらの現象の列挙を可能にした分光学的手法をしながら [特に、パルス振幅変調 (PAM) 蛍光分光法] 観察し、で光合成プロセスを切り裂くのための不可欠な手段であり続けるとvivo、多大な生化学のこれらの分光観測を基になる機構を解明する必要です。状態遷移には、例えば、STN7 キナーゼとホスファターゼ TAP38/PPH1、それぞれ^8,9,10によって LHCII 蛋白質のリン酸化/脱燐酸化のサイクルが含まれます。このサイクルは、PSII から PSI、それによって吸収が変更に LHCII スチレンダイマーの一部を移動して 2 つダメージを与える間 LHCII アンテナの物流を調整しますダメージを与える^11,12の断面図。NPQ の qE コンポーネントは、ビオラキサンチン/ゼアキサンチン エポキシ化/デ-エポキシ化サイクルと PsbS 蛋白質の行動を通して熱に余分な励起エネルギーを急速に変換します。この過程で PsbS の正確な役割はまだ完全に理解した¹³。NPQ、光阻害の qI コンポーネントは一般的に、PSII の D1 タンパク質にダメージを与えるせいにしました。完全光合成能力の回復には、破損した PSII photocenters を修正する精巧な修復プロセスが必要です。PSII 修繕周期には、PSII 錯体、グラナのスタックの複合体の解体、破損した D1 タンパク質の交換、PSII の複合体の再構築とグラナ スタック¹⁴に戻る光化学複合体の動きからの移行が含まれます。PSII 症状や光阻害の正確な性質のまま¹⁵強い精査の主題です。

遷移状態のような現象を研究の難しさや、PSII 修理に起因しない複雑な生化学システムの仕組みを可視化する 1 つの簡単な方法があるという事実の一部。プロセスを理解する古典的な生化学的アプローチは、最初にそのコンポーネントを切り離すことで、単独で特徴付けられます。ネイティブ電気泳動は分離しより多くの分取方法 (すなわちショ糖勾配遠心法とクロマトグラフィー)¹⁶チラコイド膜から光化学系複合体を特徴付けるに 1980 年代の成功した努力から生まれた。優しくチラコイド膜からネイティブの複合体の可溶化開発洗剤システムはアレンと Staehelin¹⁷によって最も顕著に電気泳動分離法すぐに合わせられたとピーターと Thornber¹⁸上昇を与えるネイティブ グリーンにゲルの電気泳動を実行します。さまざまな実験のアーセナルでは、ネイティブのページでテクニックを表す 1 つだけが光合成の研究で広く使用されている方法を作ったそれ魅力的な特性の数。ネイティブのページは比較的高速かつシンプルで、同時に多数のチラコイド錯体の高リゾリューションの分離を提供しながら、少し特殊な装置を必要とします。これはネイティブ ページをチラコイドのダイナミクスを研究するためと、さまざまな洗剤とバッファーのシステムを発見し、新しいチラコイド錯体を特徴付けるのため汎用性の高いシステムと同様に、2 番目の次元の標準ページと組み合わせると便利なツールになります。

ネイティブの緑のジェルと抱えている特に経験の浅い手での信頼性の低い手法であるという評判だが簡単にいくつかのバンドが付いているファジィ、べたつくゲルから成る悪い結果を生成します。この問題は、一部、青ネイティブ ページ¹⁹の導入で解決されました。BN バッファー システムの coommassie 色素の使用は蛋白質の分離をより強固になります。したがって、BN ページを設定する相対的な初心者のための簡単かつより信頼性の高い技術は、しばしば、チラコイド錯体の高解像度版を提供することができます。これらの理由から、BN-PAGE - このフィールドのほとんどの仕事のための選択の方法となっています。BN-PAGE - が一般的にその主な欠点は、緑のゲルの電気泳動よりも実行に時間がかかる coommassie 染料染色も下流ながらかすかなクロロフィルを含むバンドの同定と干渉する分光特性が問題となります。

ネイティブのゲルに生化学的な情報提供し、分光学的手法からのデータと組み合わせると、2次元 SDS ページを大幅強化することができます。採用システムにかかわらず複合体を識別するネイティブのゲルを使用して中心の問題であること識別は、常に挑戦することができます (すなわち、蛋白質バンドで発見可能性があります常に comigrating 複合体またはコンポーネントを表すではなく単一生理学的本格的な複雑なより)。分光法によるキャラクタリゼーションと生物物理について緑のゲルのバンドの色素複合体のどのような種類が含まれている可能性を決定するため使用することができます。クロロフィル蛍光は、しばしば劇的に異なるスペクトルと異なる光合成色素蛋白複合体の特徴である、蛍光寿命のためにこの点で特に便利です。簡単な定常 77 K 蛍光スペクトルを歴史的にネイティブ ゲル複合体の身元を確認するのに役立つされている、現代時間相関単一フォトンカウンティング (ピコ) より多くの情報を提供できます。ピコだけでなく蛍光寿命に基づく複合体の特性がまた可能、複雑なスペクトル成分間のエネルギー移動の詳細な説明になります。特性のこの種は様々 なネイティブ ゲル系スプレッドの使用としてますます必要になっているとより良い認証するタンパク質複合体の同定ができ、新しいを提供する、新しい推定錯体を発見これらの複合体のしくみの生物物理については。

本稿で我々 はネイティブ チラコイド複合体の光反応のメカニズムを検討するための高品質の解像度を達成するためにネイティブ電気泳動とほとんど、あるいは全くの経験を有することができる方法を提供します。光合成。この基本的な方法は、結果を改善または他の種への適用性を拡張する実験者の裁量で拡張できます。我々 は、基本的な分析と技術によって提供されるデータのプレゼンテーションのためのいくつかの手順と同様に、ピコ、ネイティブの緑のゲルのバンドを施すプロセスをについて説明します。ピコによるネイティブ電気泳動のカップリングは、認証およびバンド内タンパク質複合体の生物物理学的特性を提供することによってこれらのゲル系のユーティリティを拡張します。ここで説明した緑色のジェル システムは、いくつかの変更とアレンと Staehelin¹⁷によって開発された、シュワルツらと同じに基づいています。²⁰です。 このシステムは、多くの一つですが、役にこの方法は、特定の機能を備えています。だは十分に急速、チラコイドの単離、ゲルの電気泳動とピコ解析便利なことができます実行されるので、1 日でサンプル ストレージと劣化の潜在的な問題がなくなります。また、このメソッドは、まだ最適化の程度によっては、優れた良いからその範囲の結果を提供しながら、経験の浅いユーザーの手に強力なを見つけます。

調査の下で生物学だけでなく、使用する洗剤とバッファーの両方のシステムでネイティブ ゲル上で可視化複合体依存心に負担することが重要です。洗剤とバッファーの異なるシステムが優先的に複合体のさまざまな種類を分離し、与えられた光合成生物はすべては、与えられた状況下で提示されます、他の生物から別の複合体を持っています。ここで説明したシステムは、シュワルツらで説明されている PSI megacomplexes の研究に特に適しています。²⁰しかしそれ PSII megacomplexes を学習者がスペクトルのより不安定の端にあたります。チラコイドのタンパク質のネイティブ電気泳動で使用される様々 な洗剤とバッファー システムの包括的な研究は、ヤルヴィらを確認することをお勧めします。²¹と Rantalaら²²。

プロトコル

1. 貯蔵液準備、ネイティブの緑のジェルを注入

1. 40% のグリセロール、200 mM と 100 mM Tris バッファー ph 8.3 から成るゲルを解決するため濃縮緩衝液 × 4 を準備します。
2. 40% のグリセロール、200 mM と 100 mM Tris バッファー ph 6.3 から成るスタッキングのゲルの濃縮緩衝液 × 4 を準備します。
3. カビの増殖を防ぐために 4 ° C でこれらのバッファーを格納します。
   注: バッファーが 4 ° C での月の安定したので、100-200 mL の各バッファーの継続的な使用のための準備をお勧めします。
4. 250 mM トリス塩酸 pH 8.3 を含むバッファーを実行する x 10 の 1 L を準備 1.92 M グリシンと 1 %sds。ベンチトップでバッファーを実行する x 10 を格納します。

2. 原液調製分離とチラコイドの可溶化

1. 100 mL の MgCl₂、10 mM と 10 mM KCl、50 mM Tris バッファー (pH 7) を含む TMK 均質化バッファーを準備し、4 ° C で保存
   注: これは均質化とチラコイドのサンプルを操作するメインのバッファーです。また、濃縮原液を作成し、(Tris バッファー、MgCl₂KCl がすべて集中する 1 M 簡単にベンチトップに格納) 必要に応じて希釈します。
2. 1 ml に-20 ° C で TMK バッファー 20 %w/v の凍結で各洗剤を溶解することにより可溶化洗剤、B デシル maltoside (DM) と n-オクチル B-d-グルコシド (OG)、チラコイドの貯蔵液を準備します。
3. チラコイド可溶化バッファー (SB)、これもサンプル読み込みバッファーを準備します。
   1. まず、TMK バッファーの 7 mLs とグリセロールの 3 mLs を組み合わせて作る TMK グリセロール バッファー。
   2. TMK グリセロール バッファーの 800 μ L、DM 原液の 100 μ L と OG 原液の 100 μ L を追加します。1 ml の-20 ° C で凍って 2%、2% の DM の OG を含むこの SB 実用的なソリューションを格納します。
      注: 各因数できます解凍、必要に応じて凍結します。

3. 後で使用できるミニの緑のジェルを注ぐ

1. スタッキングおよび 15 mL 使い捨て試験管でゲル ソリューションを解決する別を準備します。
   メモ: 提供されるボリュームは 1.5 mm 板スペーサーを使用して単一ミニ ゲルに対して十分です。
   1. スタッキングのゲル溶液を作るため、スタッキングのゲルのバッファー、40% アクリルアミド原液 (39:1 C) 0.5 mL と重なりバッファー × 1 で 4% アクリルアミドの 5 mL を与えるために水の 3.25 mL x 4 の 1.25 mL を組み合わせます。解決のゲルを作るためソリューションは 1.875 解決バッファー、40% アクリルアミド原液 (39:1 C) 0.94 mL と 1 バッファーの解決 x 5% アクリルアミドの 7.5 mL を与えるために水の 4.7 mL × 4 mL を組み合わせます。
2. 解決のゲルを注ぎなさい。
   1. 解決のゲル溶液に 10% 過硫酸アンモニウム (AP) の 50 μ L を追加し、TEMED の 10 μ L を追加、キャップ、チューブ、優しく何度かミックスを反転します。すぐに解決のゲルとスタッキングのゲルの櫛歯の下部のトップの間で約 1 cm を残して、ゲル平板間ゲル溶液を注ぐ。
   2. そっとゲルのレベルに解決のゲルの上に 100% エタノールをピペットします。
      注: ゲルは 15 分以内で設定されていない場合新鮮な APS ソリューションをすべきであるおよび/または新しい TEMED を使用する必要があります。
   3. ゲルは重合後 (ゲルとエタノールとの間のインタ フェースが容易に表示され、ゲルを渡したときは移動しません) エタノールとしみを付けなさい吸収紙を注ぐ。
3. スタッキングのゲルを注ぎなさい。
   1. 25 を追加 10% の μ L AP スタッキングのゲル溶液 5 μ L を追加 TEMED のキャップと解決のゲルと同様にミックスする「反転」。10 よく櫛を挿入し、プレートの間の領域が完全に塗りつぶされるまで解決のゲルの上にゲル溶液を注ぐ。
      注: 使用するゲルから櫛を削除し、水と井戸を洗浄する準備ができたら、作って井戸、ストレートとゲルの遮るもののないことを確認。ゲルは、少なくとも数日間 4 ° c の場所で櫛で格納できます。

4. ほうれん草から原油のチラコイド膜の分離の葉します。

注: すべての手順が中古冷蔵機器およびバッファーを使って氷の上実施している必要があります。薄暗い照明の使用をもお勧めします。実験者の裁量、調査の下で生物学的過程によって、均質化する前に TMK バッファーに新鮮のプロテアーゼおよび/または脱燐酸化酵素の阻害剤を追加する必要があります。

1. 完全にガラス Dounce ホモジナイザーを用いた TMK バッファーにほうれん草の葉をホモジナイズしてください。
   注: バッファーの約 1 ~ 2 mL で小さな赤ちゃんホウレンソウ葉に通常十分です。シングル ベビーほうれん草の葉は一般的に 1.5 mm ミニ ゲルの井戸を読み込むのに十分な材料を提供できます。
2. 不溶性の残骸を削除する原油葉磨砕液をフィルター処理します。
   1. 簡単フィルタ リング デバイス、繊細な作業をカットは半分を拭くし、四分の一にそれを折る。5 mL のシリンジの下に繊細なタスク ワイプをパックし、TMK バッファーと中古ウエットします。
   2. シリンジのプランジャーを使用して、繊細なタスク ワイプから余分なバッファーを押しながらワイプ フィルターが注射器の下にピストンを削除した後しっかりと押されていることを確認します。
   3. ワイプ フィルターの中央に葉磨砕液をピペットし、磨砕液をフィルターを通過するプランジャーを使用します。1.5 mL 遠心管にフィルターのホモジネートを収集します。
3. チラコイド膜を含む不溶性材料をペレットへの 4 ° C で 10 分間 5,000 × g でホモジネートを遠心します。上澄みを廃棄し、TMK バッファーの 1 mL にペレットを再懸濁します。
4. 下記のとおり各サンプル同じ総クロロフィル量が含まれるように各再懸濁チラコイド サンプルのボリュームを調整して各サンプルのクロロフィルの量を正常化します。
   注: これは洗剤と同じボリュームで可溶化する各サンプルになります、ペレットの量の違いによる可溶化の変動を最小限に抑えられます。
   1. 再懸濁のチラコイド膜の各サンプルから葉緑素を抽出、1.5 mL 遠心チューブに分注 50 μ L を取るし、メタノールの 950 μ L を加えます。チューブをキャップし、数回の反転でミックスします。
   2. 沈殿したタンパク質をペレットに 10 分間、10,000 × g でメタノール/クロロフィル抽出液を遠心します。
   3. ポラーらによると上清を含む色素のクロロフィル濃度を決定します。²³. 分光光度計と 1 cm キュベットを使用して 652 と 665 nm で吸光度の測定値を取る。次の式を使用して総クロロフィル濃度を決定します。
      クロロフィル、+ b (μ g/mL) = 22.12 (Abs 652 nm) + 2.71 (Abs 665 nm)
   4. ガイドとしてクロロフィル濃度測定を使用して、削除し、各チューブが同じ総クロロフィル量を含むように、必要に応じて、各サンプルからいくつかのボリュームを破棄します。
5. 5,000 x g で 10 分間削除での遠心分離によってチラコイド膜を再ペレット、上澄みを廃棄します。ペレットのいずれかを吸引することがなくすべての上澄みを削除する注意してください。

5. ネイティブ ゲルにロードするためのチラコイド膜の可溶化

1. TMK 30% グリセロール洗剤 (SB) の因数を解凍し、ミックスする数回を反転します。氷の上におきます。
2. 1 mg/mL のクロロフィル濃度を与える SB の適切な量を追加することによってチラコイド ペレットを溶解します。
   注: この濃度は経験的に決定する必要があります最適な可溶化の条件を見つけるための出発点です。有効な比較をできるように、サンプル間で同じクロロフィル濃度が保たれなければなりません。
3. サンプルの泡を避けるために気をつけながら、上下の繰り返しにピペットします。チラコイド サンプルの可溶化を許可するように氷の上を保ちます。
   注: 少なくとも 10 分の可溶化します。可溶化時間は随分サンプルの可溶化時間の差を最小限に抑えるべきです。
   例: 3 分は、すべてのサンプルを可溶化する必要がある場合、約 30 分べきである可溶化のため。
4. 不溶性物質をペレットへの 4 ° C で 10,000 x g で可溶化されたチラコイドを遠心します。
   注: 溶チラコイド サンプルが時間のための氷の上安定しているが、凍結融解サイクルが megacomplex バンドの損失につながることができるため、-70 ° C で保管を避けてください。

6. ネイティブ電気泳動によって, 可溶化チラコイドのタンパク質の分離

1. 以前に調製したネイティブのゲルに直接ステップ 5.4 で可溶化されたチラコイド上清をロードします。1.5 mm ジェル 15 μ L/ウェル, 可溶化チラコイドのロードします。
2. 1 x 連続したバッファーを使用して SDS ページのゲルと本質的に同じ方法でネイティブの緑のゲルを実行します。100 V でゲルを実行し、抵抗加熱ゲルを軽減するために実行中に濡れた氷の上全体ゲルタンクを配置します。
   メモ: ゲルはゲル (図 1) の下部に到達する移行前に無料の顔料の約 2 時間を必要する必要があります。

7. ネイティブの緑のジェルから複雑なチラコイド バンドの切除

注: ゲルからの興味の特定のバンドを常套ビーム光路に配置して近くの複合体からの浮遊の蛍光が収集されているを防ぐためにバンドを許可する必要があります。

1. 電気泳動セルとゲル板オフ バッファーを搭載した蒸留水すすぎからゲルを削除します。ゲルからトップ プレートを削除し、蒸留水でゲルを洗浄します。
2. 底のガラス板上にゲルを保ち、氷のゲルとプレートを配置します。使用しないときは、暗闇の中、ゲルを保持し、乾燥からそれを防ぐためにプラスチック製のラップでカバーします。
3. ガラス板に残ったゲルでピコ分析の準備ができているときの関心の各バンドを切除します。鋭いメスや剃刀の刃をきれいにバンドを消費税し、世話を摘出したバンドにバンドの汚染物質が含まれていないこと。

8. 部屋の温度定常状態の蛍光スペクトルのコレクション

1. ピコによって分析されるそれぞれの複合体は、部屋の温度の蛍光スペクトルは蛍光分光器を用いた 600 と 800 nm の間取得します。
   注: このスペクトルを収集するために使用される励起波長は、ピコの波長を一致しなければなりません。

9. 緑のゲルのバンドのピコ

注: はピコ セットアップの図 2を参照してください。

1. 2 つのガラス顕微鏡スライド ゲルのスライスをサンドイッチします。顕微鏡スライドの 1 つの各端に配置され、スライドをゲルのスライスを圧縮することがなく一緒にしっかりと保持することができますようにスペーサーを作成するいくつかの倍以上を折り、マスキング テープを使用します。
   注: これはゲルのスライスと顕微鏡スライド間を通過するレーザ光のパスを作成します。
2. 信号の散乱を減らす滑らかなインターフェイスを作成するスライド ガラスの端にゲルのスライスに少量の水を追加します。
3. ゲル/スライド サンドイッチ梁パス ビーム ビーム パスに垂直なゲル、挟スライド ガラスの側を通ってする蛍光性の放出を許可するプレートの端がオープンをゲルのスライスを打つようにクランプします。
   注: 使用する励起波長実験に依存します。波長 435 nm が励起クロロフィル a とクロロフィル b 中 465 nm、クロロフィル b をエキサイトして優先的に。この場合は 435 nm が励起波長として使用されました。
4. それぞれの複合体の蛍光発光スペクトル一定の間隔で 10,000 の合計データ ポイントを収集します。たとえば、すべての 10 のデータを収集開始 nm 680 nm で 750 で終わる nm。
   注: は、退色を防ぐ十分な信号収集イベントで、その新鮮なサンプルを使用できるように勉強するごとに複雑な複数のゲルのバンドを準備します。

10. ピコ (データ解析)

1. 与えられた複雑な収集のすべての波長の各減衰曲線のピークの高さをまず正規化します。
   注: この手順は、DAS の建設のため必要はありませんが、減衰曲線のオーバーレイし、データの最初の検査として互いに視覚的に比較することができます。
2. 下記のとおり複合体の定常状態の蛍光スペクトルに各減衰曲線の尾-一致。
   1. 数ナノ秒後通常のうち、平坦化いる減衰信号後 timepoint を選択します。
   2. 各波長の選択した timepoint での信号強度はその波長で定常状態の蛍光スペクトルの値と等しい減衰曲線を正規化する (すなわち、選択した timepoint で一緒にすべての波長の値。再作成されます定常状態の蛍光スペクトル)。
3. 下記のとおり尾一致減衰曲線から崩壊准スペクトル (DAS) を構築します。
   1. データを使用して末尾一致減衰曲線からポイント構築定期間隔で波長の蛍光強度をグラフ プロットのシリーズ (例えば、すべての 10 ps)。たとえば、50 ps で DAS は波長対 50 ps で各減衰曲線の値をプロットすることによって作成されます。
   2. 時間をかけて蛍光スペクトルの減衰を示す滝スタイル プロットを作成する崩壊によるスペクトルのすべてをオーバーレイします。

結果

緑のゲルの電気泳動の代表的な結果は図 1に示した。車線 1 は、ほうれん草のチラコイドは、はっきりした、鋭い緑バンドの最大数が表示されます緑のゲル電気泳動の理想的な結果の例を示します。これらの結果は、幾分非定型の一部レーン 1 で見られるバンドのすべてが通常ある特定のサンプル中に存在。その他のサンプルのクリーンアップ?...

ディスカッション

成功したチラコイドの可溶化とネイティブのゲルを実行は、大幅な歪みのないゲルの複数の明確な表示緑バンドの解像度またはバンドのスミアになります。ゲルをオーバー ロード、高濃縮、不適切なサンプル pH、不溶材料、速すぎるまたは高すぎる温度でゲルを実行して不適切に注がれたゲルが不十分な解決チラコイド錯体に貢献するかもしれないすべての要因。ゲル自体の条件を最適化し...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycine	Sigma	G8898
Tris base	Sigma	#648310
SDS	Sigma	L3771
Decyl Maltoside	Sigma	D7658	n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside
Octyl Glucoside	Sigma	O8001
Acrylamide	BioRad	161-0148	37.5/1 C 40% solution
TEMED	BioRad	161-0800
Ammonium Persulfate	BioRad	161-0700
Magnesium Chloride	Sigma	M2670
Potassium Chloride	Sigma	P9333