שילוב של צביעת פתולוגיה וניתוח התמונה לכמת עמילן ב Primordia השחלה של דובדבן מתוק במהלך החורף תרדמה

Summary

אנו מציגים מתודולוגיה לכמת את תכולת עמילן primordia שחלה בדובדבן מתוק (שקד avium ל') במהלך החורף תרדמה באמצעות מערכת ניתוח תמונה בשילוב עם טכניקות מעבדה הומנית.

Abstract

שינויים עמילן במבנים קטנים הם קשורים אירועי מפתח במהלך מספר תהליכים פיתוחיים צמח, כולל השלב הרבייה של האבקה הפריה, תחילת fruiting. עם זאת, בווריאציות עמילן במהלך התמיינות פרח לא לגמרי ידועים, בעיקר בשל הקושי לכמת את תכולת עמילן המבנים קטן במיוחד של primordia הפרחים. כאן, אנו מתארים שיטה כימות של עמילן ב primordia השחלה של דובדבן מתוק (שקד avium ל') באמצעות מערכת ניתוח התמונה המצורפת המיקרוסקופ, אשר מאפשר הנוגעות לשינויים בתוכן עמילן עם השלבים השונים של תרדמה האביב. למטרה זו, המצב תרדמה של ניצני פרחים נקבעת לפי הערכת את הצמיחה ניצן של נצרי הועבר תנאים מבוקרים ברגעים שונים בזמן חורף. עבור כימות של עמילן ב primordia השחלה, ניצני פרחים ברצף שנאספו, קבוע, המוטבעות פרפין, למחלקה, מוכתם אני₂Kl (אשלגן יודיד-יוד). ההכנות שנצפו תחת המיקרוסקופ, נותחו על ידי מנתח התמונה בבירור שיבדיל עמילן מהרקע. ערכי תוכן עמילן מתקבלים על ידי מדידת צפיפות אופטית של התמונה התואם העמילן מוכתם, בהתחשב סכום הצפיפות האופטית של כל פיקסל כמו אומדן של עמילן תוכן של מסגרת למד.

Introduction

צמחים רב שנתיים וודי ממוזג להסתגל העונות על ידי להתכוונן וההתפתחות שלהם. בעוד הם מפתחים במהלך האביב והקיץ, הם מפסיקים לגדול במהלך הסתיו ללכת רדום בחורף¹. למרות תרדמה מאפשר להם לשרוד בטמפרטורות נמוכות בחורף, מצמרר הוא תנאי הכרחי budburst נאות אביב². ההשלכות חשוב של תרדמה ייצור פירות ממוזג, יערנות הובילו מאמצים מגוונות כדי לקבוע ולחזות את תקופת תרדמה³. במינים עץ פרי, ניסויים אמפיריים העברת נצרי לכפות תנאים ותחזיות סטטיסטי המבוסס על נתונים של פריחה הם לגישות כדי לקבוע את התאריך של שבירת תרדמה, אשר מאפשר לחוקרים להעריך דרישות עבור כל לדבורי מצמרר. עם זאת, כיצד לקבוע את מצב תרדמה המבוססת על תהליכים ביולוגיים נשאר לא ברור³.

פורחים עצי פרי ממוזג, כגון דובדבן מתוק (שקד avium ל'), מתרחש פעם בשנה ונמשך שבועיים לערך. עם זאת, פרחים מתחיל להבדיל ולפתח כ 10 חודשים קודם לכן, במהלך הקיץ הקודם⁴. פרח primordia מפסיקים לגדול במהלך הסתיו להישאר רדום בתוך הניצנים בחורף. על תקופה זו, כל לדבורי צריך לצבור דרישה מצמררת במיוחד עבור פריחה נאותה⁴. למרות העדר phenological לשינויים הניצנים בחורף, פרח primordia פעילים מבחינה פיזיולוגית בתקופת תרדמה, ההצטברות של מצמרר טמפרטורות שויכה לאחרונה הדינמיקה של הצטברות עמילן או להקטין בתוך התאים של ראשית השחלה, מציעים גישה חדשה עבור תרדמה נחישות⁵. עם זאת, גודלו הקטן ואת המיקום של ראשית השחלה דורשים מתודולוגיה מיוחד.

עמילן הוא הפחמימות אחסון מרכזיים וודי צמח מינים⁶. לפיכך, שינויים עמילן קשורות לפעילות הפיזיולוגית של הרקמות פרח, אשר זקוקים לפחמימות לתמיכה שלהם פיתוח^7,8. אירועים מרכזיים שונים במהלך תהליך הרבייה קשורים גם וריאציות בתוכן עמילן במבנים פרחים שונים, כגון מיוזה בצרכן⁹, הגידול של הצינורות אבקה דרך סגנון או ביצית הפריה¹⁰. טכניקות פתולוגיה לאפשר הגילוי של עמילן ברקמה מסוימת כל של primordia פרח בתקופת תרדמה. עם זאת, הקושי נשאר לכימות הזה עמילן כדי לאפשר בעקבות דפוס שלו הצטברות/ירידה לאורך זמן או השוואת העמילן תוכן בין רקמות, הזנים או שנים. זאת בשל הכמות הקטנה של רקמה זמין עבור שיטות אנליטיות¹¹. כחלופה, ניתוח תמונות מקושר מיקרוסקופ¹² מאפשר כימות של העמילן קטנה מאוד דגימות של רקמות הצמח¹³.

גישות שילוב מיקרוסקופ וניתוח התמונה שימשו כדי לכמת את התוכן של מרכיבים שונים ברקמות הצמח, כגון callose¹⁴, microtubes¹⁵, או עמילן¹⁶, על ידי מדידת הגודל של אזור צבוע על ידי ספציפי כתמים. עבור עמילן, זה ניתן בקלות להבחין באמצעות אשלגן יודיד-יוד (אני₂קי) תגובה¹⁷. שיטה זו היא מאוד ספציפית; אני₂קי intercalates בתוך המבנה למינריות של גרגרי עמילן וצורות כחול או חום-אדמדם בצבע כהה, בהתאם לתוכן עמילוז עמילן¹⁸. סעיפים מוכתמים אני₂קי הכתם להציג ניגודיות הולמת בין עמילן הרקמה רקע, המאפשר זיהוי עמילן חד-משמעית של כימות עוקבות מערכת ניתוח תמונה¹⁹. למרות צבע זו אינה stoichiometric, ההצטברות של יוד הוא יחסי האורך של מולקולת עמילן, אשר יכול להשתנות מאוד¹⁷. לפיכך, גודל האזור המוכתם לבטא את מספר הפיקסלים אינן משקפות בהכרח במדויק את תכולת עמילן, מאז ההבדלים גבוהה בתוכן עמילן יכול להימצא בין שדות עם האזורים המוכתמים גודל דומה. כחלופה, תכולת עמילן יכול להיות מוערך על ידי מדידת צפיפות אופטית גרגרי מוכתם על תמונות בשחור-לבן המתקבל המיקרוסקופ, כפי שדווח ברקמות שונות משמש^{8,13 , 19}, אבוקדו^10,20וזית²¹.

כאן, אנו מתארים מתודולוגיה המשלבת הקביעה ניסיוני של תרדמה מצב עם כימות של עמילן בתוכן רקמת השחלה ראשית האביב, דובדבן מתוק, ומציע כלי חדש הבנה, חיזוי של תרדמה המבוסס על חקר המנגנונים הביולוגיים קשורות תרדמה.

Protocol

1. תרדמה נחישות ואיסוף חומרים צמח

1. לטעום את ניצני פרחים בשדה. תרדמה מחקרים ניסויים ארוכי טווח, דרוש מבוגר עצים גדול מספיק כדי לאסוף את ניצנים ויורה כל החורף מבלי להתפשר על התפתחות העצים במהלך האביב הבא. בניהול הפרדס מיוחד יכול להידרש, בהתאם מערכת הדרכה; לפיכך, גיזום עשוי להיות חמור פחות מאשר למטרות ייצור פירות.
   1. בכל שבוע, מתחילת הסתיו ועד תחילת חופשת באד, לאסוף, שוקלת 10 פרוח ניצנים.
   2. לתקן את ניצני פרחים על-ידי הצבתם לתוך צינור זכוכית 10-mL עם כובע ומשרים את הדגימות בפתרון לשבועיים של חומצה אצטית/אתנול (3:1) לפחות 24 שעות-4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, למחוק את מקבע ולהוסיף 75% אתנול, בנדיבות להבטיח שזה מכסה את הדגימות. יכול להיות שמור את הדגימות בפתרון זה ב 4 ° C עד השימוש.
      הערה: חדירת אבק יכול לשמש כדי להסיר בועות אוויר בתוך הניצן ולמנוע מהם צף. זה מקל על החדירה של מקבע לרקמות אך עלול לגרום נזק מבנה הרקמות. תנסה להמנע מזה אם לא הכרחי.
2. לטעום את נצרי בשטח.
   1. בכל שבוע, מתחילת הסתיו ועד תחילת חופשת באד, לקחת שלושה נצרי של 15-30 ס"מ אורך ו 5 מ מ קוטר, המכיל לפחות 10 ניצני פרחים, כל. מניחים אותם על פרחים ספוגי מים קצף בתוך תא הצמיחה ב 22 ± 1 ° C עם photoperiod אור 12 שעות.
   2. לאחר 10 ימים בבית הבליעה צמיחה, לבחור, שוקלת 10 פרוח ניצנים של נצרי.
3. להעריך את הצמיחה ניצן, לקבוע את מצב תרדמה. תקופת הדגימה חייב להיות מותאם לתנאים של המיקום. בתנאים הפרדס (סרגוסה, ספרד, 41 ° 44'30 "N 0 ° 47'00" W ו- 220 מ' מעל פני הים), הדוגמאות של נצרי בוצע מתוך 30 נובמבר עד סוף פברואר או תחילת מרץ.
   1. מדי שבוע להעריך את התגובה של פקעי לתנאי גידול מתאימים לחדר, מתחילת הסתיו ועד budburst באביב, מהשוואת המשקל של ניצנים 10 בחרה מהשדה.
   2. אם אין הבדלים או הבדלים אלה הם פחות מ- 30%, שקול הניצנים לא מילאו אחר דרישות מצמררת שלהם והם endodormant²². אם ההבדלים הם יותר מ 30%, שקול הניצנים כבר מילאת את דרישות מצמררת שלהם והם ecodormant²².

2. הצמח הכנה גשמי על כימות עמילן

1. בחר ניצנים קבוע בערך שש מן הדגימה כל תאריך (ראה שלב 1.1). תלוי הזנים, כל פרוח ניצן הדובדבן המתוקות מכיל עד חמישה פרחים primordia.
   1. להסיר את הקשקשים החיצוניים באד ומניחים את הניצן על הזכוכית של שען עם 75% אתנול כדי למנוע את זה ממנו להתייבש.
   2. לנתח את הניצן ולחלץ ראשית פרח אחד לפחות לכל ניצן עם העזרה של דיוק מלקחיים ואזמל ophthalmologic תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי. ראשית פרח יכול להיות שמור שפופרת זכוכית 10-mL עם 75% אתנול ב 4 ° C, או פנה/י מיד לשלב הבא.
2. מייבשים את הדגימות בסדרה אלכוהול בוטיל שלישוני.
   1. החלף את הפתרון אתנול 75% 10 מ"ל של 75% אלכוהול בוטיל שלישוני (יפורסם בהמשך) בנדיבות לכסות את הדגימות ואת תקופת דגירה אותם של 1.5 h. פיפטה פסטר יכול להיות שימושי למחוק את הפתרון.
   2. חזור על שלב 2.2.1, הוספת תאריך יפורסם עם ריכוזים העולה (85%-95%, 100%, וי/v; ו- 3 x עם יפורסם טהור) לתוך תנור ייבוש ב 30 ° C עם אוויר החילוץ, מאז יפורסם טהור crystalizes בטמפרטורת החדר (< 20 ° C), הוא תנודתי מאוד רעילים. אם יפורסם crystalizes עם הדגימה, זה היה פוגע ברקמות.
3. להטביע את הדגימות פרפין¹⁸.
   1. ממיסים הפרפין תציגו את הפנינים פרפין בתנור ייבוש ב 60 מעלות צלזיוס עם שאיבת אוויר ביום הקודם. הפנינים פרפין ניתן להמיס גם על גזייה, אך ודא פרפין נוזלי ב 60 מעלות צלזיוס ולא על טמפרטורה גבוהה יותר, כדי למנוע נזק לרקמות.
   2. להחליף את יפורסם עם שילוב של יפורסם ושמן פרפין (1:1), תקופת דגירה של 24 שעות בתוך תנור ייבוש ב 60 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להחליף את התמהיל של יפורסם, שמן פראפין עם טהור ממיסים פראפין, תקופת דגירה של פחות 6 שעות בתוך תנור ייבוש ב 60 מעלות צלזיוס. לחזור על זה 2 x דגירה השינוי האחרון לפחות 4-6 יח.
   3. במקום כל דגימה על תבנית בסיס מתכת קטן מעל משטח חום, מוטבע פרפין, ועל קצב בקלטת ההטבעה. . שימו אותה על משטח קר, להסיר את החסימה לאחר השעווה פני השטח למוצק.
4. סעיף, נתרענן ההכנות.
   1. הכינו דבק של האפט: להמיס 1 גר' ג'לטין נוקס רגיל ב- 100 מ של מים מזוקקים ב 30 מעלות צלזיוס; לאחר מכן, להוסיף 2 g של פנול גבישי חופשי (או₅₆H. C) ו-15 מיליליטר גליצרול. מורחים דבק של האפט על שקופית מזכוכית עם מברשת, להוסיף טיפה של פתרון פורמלדהיד ' 1% '.
   2. סעיף פרפין כל לחסום-10 מיקרומטר ב מיקרוטום על כל ההזמנות ולמקם את הסעיפים על גבי השקופית זכוכית מכוסה דבק של האפט.
   3. מיקום בשקופיות זכוכית עם הסעיפים מעל משטח חום ב 35-40 ° C עד יבש; לאחר מכן, להעביר את השקופיות זכוכית מתלה שקופיות.
   4. הכינו את dewax ופתרונות התייבשות. במקום 200 מ של Histoclear השני שלוש מנות צביעת זכוכית, עוד אחד עם Histoclear II:ethanol (1:1, וי/v), סדרות אתנול (100%, 70%, 40%, וי/v), ואת מכונת שטיפת מים מזוקקים הסופי.
   5. Dewax הסעיפים עם שלושה שוטף, כל 5 דקות, Histoclear II, Histoclear II:ethanol (1:1, וי/v). למקם ארון התקשורת שקופיות בתוך הכלים צביעת זכוכית, המבטיח כי הפתרון מכסה לחלוטין את השקופיות,,, מעבר המתלה שקופיות של פתרון אחד לשני.
   6. נתרענן הסעיפים לפי הסדרה הבאה ממכוני 2-מין: סדרות אתנול (100%, 70%, 40%, וי/v) ו מכונת שטיפת מים מזוקקים הסופי. לבסוף, יבש בשקופיות זכוכית בטמפרטורת החדר.
5. כתם סעיפים¹⁸.
   1. להכין לי כתם קי₂: להמיס דור 2 של אשלגן יודיד (KI) ו- 0.2 גר' יוד (אני₂) ב- 100 מ של מים מזוקקים. להחיל טיפה של טרי אני₂קי מעל section(s) במשך 5 דקות, ואז למחוק את העודפים של כתם ע י קליטת אותו עם נייר סופג. במהירות להמשיך לשלב הבא.
   2. החל טיפה קטנה של תקשורת הרכבה סינתטי, במקום כוסית כיסוי עליון ולאחר ללחוץ חזק. ברגע שהתקשורת הרכבה מתייבש, להתבונן במיקרוסקופ שדה בהיר עבור הערכה ראשונית של העמילן השחלה.
      הערה: השלב זה אינו חובה, למרות קונטרסט טוב יותר בין העמילן ואת הרקע מתקבל. אם המקטע חוזר עם כתמים אחרים לאחר עמילן כמת, הצב את מכסה הזכוכית על הירידה של כתם ולמחוק את העודפים ע י קליטת אותו עם נייר סופג (ראה 2.5.1). לאחר מכן, לאחר כימות עמילן, לשטוף החוצה את₂קי כתם עם מים מזוקקים והמקום ההכנות מעל חום פני השטח ב 35-40 ° C עד יבש.

3. כימות של תכולת עמילן

1. כיילו את התנאים אופטי.
   הערה: רמות איתור המשמשים במנתח התמונה כדי לזהות את העמילן מוכתם תלויים ישירות לתנאי תאורה ואת ההגדלה של המיקרוסקופ; לפיכך, לתקן תנאים אלה עבור כל ההכנות מוערכים. להתאים את ההתאמה הציע כאן המיקרוסקופ הזמינים ואת לתנאי תאורה.
   1. התאם את הסרעפת צמצם בקו ה-20 X ההגדלה ואת בקרת הבהירות או עוצמת אור.
   2. ודא כי ישנם אין מסננים את המחזיק מסנן ולאחר בחר תנאי שדה בהיר במיקרוסקופ. בחר הגדלה מתאימה (למשל, 40 X עבור הדובדבן המתוקות השחלה ראשית).
2. בקרת תנאי רכישת התמונה. התאם את הגדרות המצלמה עם הכנה מוכתם ללא רקמה באמצעות תמונה | רכישה | נוף קדם.
   1. לתקן את הבהירות ב-50%, הרווח ב- 1.0 x ו האינדיקטורים היסטוגרמה הגאמא לערך 1.00, הניגוד-0 - 100, להתיישר עם המגבלות של ההיסטוגרמה הפצה בהירות.
   2. להפעיל את הפונקציה חשיפת יתר/מצילום ולהתאים את זמן החשיפה על גבול חשיפת יתר.
   3. להחיל את הפונקציה איזון לבן על התמונה המלאה כדי להציג את כל הרכיבים בצבע נייטרלי של התמונה ללא שום נימה צבע ותיקון הצללה על התמונה המלאה כדי ליצור תמונה מתוקנת ולא הומוגנית.
3. כיילו את מערכת ניתוח התמונה כדי להשיג את ערכי בקרה של רמת האפור (0, שחור; 255, לבן) של צפיפויות אופטיים שונים (OD) שמושגות על-ידי הערכים להדמיה (T).
   1. לקבל תמונה של הכנה מוכתם בלי רקמות, נחשב שליטה לבן, וכך למדוד רמת האפור של תמונת שחור-לבן ויה מידה | אפור מידה | לכייל גריי | הפניה ערך = 0 | מדד | לכייל | טוב. זה תואם עם להדמיה 100%; לפיכך, צפיפות אופטית של 0, על-פי יתר = 2 - כניסה טי
   2. רוכשים תמונה של הכנת אותו עם מסנן 4N, אשר מפחית את כמות האור 4 x ומדד רמת האפור של תמונת שחור-לבן ויה מידה | אפור מידה | לכייל גריי | הפניה ערך = 0.6 | מדד | לכייל | טוב. זה תואם עם להדמיה 25%; לפיכך, צפיפות אופטית של 0.6, על-פי יתר = 2 - כניסה טי
   3. רוכשים תמונה של הכנת אותו בלי אור, נחשב שחור, וכך למדוד רמת האפור של תמונת שחור-לבן ויה מידה | אפור מידה | לכייל גריי | הפניה ערך = 1 | מדד | לכייל | טוב. זה תואם עם להדמיה 0%; לפיכך, צפיפות אופטית של 1, על-פי יתר = 2 - כניסה טי
4. לזהות עמילן.
   1. רוכשים תמונה צבעונית של השדה כדי למדוד את הקובץ בתבנית TIFF ברזולוציה לפחות 300 נקודות לאינץ ' (dpi).
   2. ליצור תמונה בינארית המתאים לאזור צבעונית. להגדיר את גדלי סף של צבע שלוש (ערכים בין 0 - 255 עבור כל אחד) עד התמונה הבינארית משקף בדיוק את גרגרי עמילן מוכתם שנצפו, דרך תמונה | זיהוי | בחר את הסף של אדום, כחול וירוק | טוב. השוואות שוב ושוב חזותיים שונים ההכנות ואת רקמות כדי לכוונן את רמות זיהוי גמר. לאחסן ולהשתמש רמות אלה עבור כל ההכנות.
   3. לכמת את העמילן. להמיר את התמונה המקורית של צבע תמונה שחור-לבן עם מערכת ניתוח התמונה. להשתמש בתמונה בינאריים כמו מסכה-גבי על תמונת שחור-לבן ויה תמונה | בינארי ערוך. למדוד את סכום הצפיפות האופטית של כל פיקסל תחת המסכה באמצעות מידה | גריי רמת | טוב ולשקול ערך זה כתוכן עמילן בשטח נמדד.
   4. חזור על שלבים 3.4.1 - 3.4.3 בארבעה מקומות השחלה primordia כדי לקבל ערך נציג של התוכן עמילן בשחלה של פרח primordia.
   5. חזור על שלבים 3.4.1 - 3.4.3. וצעד ' ר 3.4.5 בפרחים שונים של כל תאריך איסוף

תוצאות

תרדמה מחקרים דורשות קביעת רגע מתי התקיימו הדרישות מצמררת. למרות העדר phenological שינויים במהלך החורף בתנאים שדה (איור 1 א'), עצי הדובדבן משחזר את הקיבולת של גדילה בתנאים מתאימים עד שהם עוברים תקופה מסוימת תחת בטמפרטורות נמוכות. ההעברה הרגילה של נצרי לתא תנאים מ?...

Discussion

תרדמה של וודי למלחמת ששת הימים מציג השלכות ברורות בייצור פירות, יערנות באקלים שינוי, למרות תהליך ביולוגי מאחורי תרדמה עדיין לא ברור. תרדמה מחקרים ניתן לצפות דרך נקודות מבט שונות, אך המחקר מחפש סמן ביולוגי החורף תרדמה החריפה בשנים האחרונות. עם זאת, רוב ניסיונות למצוא את מחוון חד-משמעית מראה ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Precision scale	Sartorius	CP225D
Stereoscopic microscope	Leica Microsystems	MZ-16
Drying-stove	Memmert	U15
Paraffin Embedding station	Leica Microsystems	EG1140H
Rotatory microtome	Reichert-Jung	1130/Biocut
Microtome blade	Feather	S35	Stainless steel
Bright field microscope	Leica Microsystems	DM2500
Digital Camera	Leica Microsystems	DC-300
Image Analysis System	Leica Microsystems	Quantiment Q550