Combinando la macchiatura istochimica e l'analisi di immagine per quantificare amido nei primordi dell'ovaia del ciliegio dolce durante la dormienza invernale

Riepilogo

Vi presentiamo una metodologia per quantificare il contenuto di amido nei primordi dell'ovaia in ciliegio dolce (Prunus avium L.) durante la dormienza invernale utilizzando un sistema di analisi di immagine combinato con tecniche istochimiche.

Abstract

Cambiamenti in amido in piccole strutture sono associati con gli eventi chiave durante diversi processi di sviluppo della pianta, compresa la fase riproduttiva da impollinazione fecondazione e l'inizio di fruttificazione. Tuttavia, variazioni di amido durante la differenziazione a fiore non sono completamente noti, principalmente a causa della difficoltà di quantificare il contenuto di amido nelle strutture particolarmente piccole dei primordi del fiore. Qui, descriviamo un metodo per la quantificazione dell'amido nei primordi dell'ovaia del ciliegio dolce (Prunus avium L.) utilizzando un sistema di analisi di immagine collegato al microscopio, che permette riguardanti i cambiamenti nel contenuto di amido con le diverse fasi di dormienza dall'autunno alla primavera. Per questo scopo, lo stato di dormienza di boccioli di fiori è determinato valutando la crescita del germoglio di germogli trasferito a condizioni controllate in diversi momenti nel periodo invernale. Per la quantificazione dell'amido nei primordi ovaia, boccioli di fiori sono in sequenza raccolti, corretti, incorporati in paraffina, sezionati e macchiati con I₂Kl (ioduro di potassio-iodio). Preparazioni sono osservati al microscopio e analizzati da un analizzatore di immagine che distingue chiaramente amido dallo sfondo. Valori del contenuto di amido si ottengono misurando la densità ottica dell'immagine che corrisponde all'amido macchiato, considerando la somma della densità ottica di ogni pixel come una stima del contenuto di amido del telaio studiato.

Introduzione

Piante perenni legnose temperate adattano alle stagioni, modulando la loro crescita e sviluppo. Mentre si sviluppano durante la primavera e l'estate, smettere di crescere durante l'autunno per andare dormente in inverno¹. Anche se dormienza permette loro di sopravvivere alle basse temperature invernali, agghiacciante è un prerequisito per un corretto budburst in primavera². Le importanti implicazioni di dormienza in produzione frutticola temperato e silvicoltura hanno portato a diversi sforzi per determinare e prevedere il periodo di dormienza³. Arboree da frutto, esperimenti empirici trasferimento germogli per imporre condizioni e statistiche stime basate sui dati della fioritura sono attuali approcci per determinare la data della rottura di dormienza, che permette ai ricercatori di stimare il requisiti per ogni cultivar di refrigerazione. Tuttavia, come determinare lo stato di dormienza basato su processi biologici rimane poco chiaro³.

Fioritura di alberi da frutto temperato, come sweet cherry (Prunus avium L.), si verifica una volta all'anno e dura circa due settimane. Tuttavia, i fiori cominciano a differenziare e sviluppare circa 10 mesi prima, durante l' estate precedente⁴. Primordia fiore smettere di crescere durante l'autunno per rimanere dormienti all'interno i germogli durante l'inverno. In questo periodo, ogni cultivar deve accumulare un particolare requisito agghiacciante per corretta fioritura⁴. Nonostante la mancanza di cambiamenti fenologici nei germogli durante l'inverno, primordia fiore è fisiologicamente attivi durante la dormienza, e l'accumulo di temperature di refrigerazione è stata recentemente associata con la dinamica di accumulo di amido o diminuire all'interno delle cellule del primordio dell'ovaia, che offre un nuovo approccio per dormienza determinazione⁵. Tuttavia, le piccole dimensioni e la posizione del primordio ovaia richiedono una metodologia speciale.

L'amido è il carboidrato di memoria principale in pianta legnosa specie⁶. Così, le modifiche in amido hanno riguardate l'attività fisiologica dei tessuti fiore, che hanno bisogno di carboidrati per sostenere il loro sviluppo^7,8. Diversi eventi chiavi durante il processo riproduttivo sono anche legati alla variazioni nel contenuto di amido in diverse strutture floreali, come ad esempio antera meiosi⁹, la crescita dei tubi polline attraverso la fecondazione stile o ovulo¹⁰. Tecniche istochimiche consentono la rilevazione dell'amido in ogni tessuto particolare dei primordi fiore durante la dormienza. Tuttavia, la difficoltà rimane nel quantificare tale amido per consentire in seguito il modello di accumulazione/diminuire nel tempo o confrontando l'amido contenuto tra tessuti, cultivar o anni. Ciò è dovuto la piccola quantità di tessuto disponibile per le tecniche analitiche¹¹. In alternativa, analisi dell'immagine legata a microscopia¹² permette la quantificazione dell'amido molto piccoli campioni di tessuto di pianta¹³.

Approcci che combina analisi di microscopia e immagine sono stati usati per quantificare il contenuto di diversi componenti nei tessuti vegetali, come ad esempio callosio¹⁴, microprovette¹⁵, o fecola¹⁶, misurando le dimensioni della zona tinta da specifici macchie. Per amido, può essere facilmente individuata usando lo ioduro di potassio-iodio (ho₂KI) reazione¹⁷. Questo metodo è altamente specifico; Ho₂KI si intercala all'interno della struttura laminare di granuli di amido e forma un colore blu o marrone-rossastro scuro, a seconda del contenuto di amilosio dell' amido¹⁸. Le sezioni colorate con I₂macchia KI Visualizza adeguato contrasto tra amido e il tessuto di fondo, permettendo una diagnosi inequivocabile di amido e la successiva quantificazione tramite il sistema di analisi immagine¹⁹. Sebbene questo colorante non è stechiometrico, l'accumulo di iodio è proporzionale alla lunghezza della molecola dell'amido, che può variare altamente¹⁷. Così, la dimensione della zona macchiata espressa come il numero di pixel potrebbe non riflettere accuratamente il contenuto di amido, poiché alte differenze nel contenuto di amido potrebbero essere trovate tra i campi con aree macchiate di dimensioni simili. In alternativa, il contenuto di amido può essere valutato misurando la densità ottica dei granuli colorati su bianche e nero immagini ottenute dal microscopio, come è stato segnalato in diversi tessuti in albicocca^{8,13 , 19}, avocado^10,20e ulivi²¹.

Qui, descriviamo una metodologia che combina la determinazione sperimentale di stato di dormienza con la quantificazione del contenuto di amido nel tessuto del primordio ovaia dall'autunno alla primavera in ciliegio dolce, che offre un nuovo strumento per la comprensione e la previsione di dormienza basata sullo studio dei meccanismi biologici collegati con dormienza.

Protocollo

1. dormienza determinazione e pianta raccolta materiale

1. Assaggiare i boccioli dei fiori nel campo. Studi di dormienza sono esperimenti a lungo termine e richiedono adulto alberi abbastanza grande per raccogliere gemme e spara tutto l'inverno senza compromettere lo sviluppo degli alberi durante la prossima primavera. Gestione del frutteto speciale potrebbe essere necessaria a seconda del sistema di formazione; quindi, la potatura può essere meno severa che a fini di produzione di frutta.
   1. Ogni settimana, dall'inizio dell'autunno fino all'inizio del germogliamento, raccogliere e pesano 10 boccioli di fiori.
   2. Difficoltà i boccioli dei fiori inserendoli in una provetta di vetro da 10 mL con tappo e i campioni in ammollo in una soluzione fissante di etanolo/acido acetico (3:1) per almeno 24 ore a 4 ° C. Scartare il fissativo, quindi aggiungere 75% etanolo, generosamente assicurando che copre i campioni. I campioni possono essere conservati in questa soluzione a 4 ° C fino all'utilizzo.
      Nota: L'infiltrazione vuoto utilizzabile per rimuovere le bolle d'aria all'interno della gemma e impedire loro di galleggiare. Questo facilita la penetrazione del fissativo nei tessuti, ma poteva danneggiare la struttura dei tessuti. Cercate di evitarlo se non necessario.
2. Assaggiare i germogli nel campo.
   1. Ogni settimana, dall'inizio dell'autunno fino all'inizio del germogliamento, prendere tre germogli di 15-30 cm di lunghezza e 5 mm di diametro, contenente almeno 10 boccioli di fiori. Mettetele su fiorista impregnati d'acqua schiuma in una camera di crescita a 22 ± 1 ° C con un fotoperiodo di 12 h luce.
   2. Dopo 10 giorni nella camera di crescita, scegliere e pesare 10 boccioli di fiori dai germogli.
3. Valutare la crescita del germoglio e determinare lo stato di dormienza. Il periodo di campionamento deve essere adattato alle condizioni del luogo. Nelle condizioni di frutteto (Saragozza, Spagna, 41 ° 44'30 "N, 0 ° 47'00" W e 220 m sul livello del mare), il campionamento dei germogli è stato effettuato dal 30 novembre fino alla fine di febbraio o inizio marzo.
   1. Settimanale valutare la risposta di boccioli di fiori per le condizioni di crescita adatto della camera, dall'inizio dell'autunno fino al budburst in primavera, confrontando il peso delle 10 gemme raccolte dal campo.
   2. Se non ci sono differenze o tali differenze sono meno del 30%, considera che le gemme non hanno rispettato i loro requisiti agghiacciante e sono endodormant²². Se le differenze sono più del 30%, considera che i germogli hanno soddisfatto le loro esigenze agghiacciante e sono ecodormant²².

2. pianta preparazione materiale per la quantificazione di amido

1. Selezionare circa sei gemme fissi da ogni campionamento datano (Vedi punto 1.1). A seconda della cultivar, ogni germoglio di fiore di ciliegio dolce contiene fino a cinque primordia di fiore.
   1. Rimuovere le squame esterne bud e posizionare la gemma sul vetro di un orologiaio con etanolo al 75% per evitare che si secchino.
   2. Sezionare il germoglio ed estrarre almeno un primordio di fiore a gemma con l'aiuto di pinze di precisione e un bisturi oftalmologico sotto un microscopio stereoscopico. Il primordio fiore può essere conservato in un tubo di vetro da 10 mL con etanolo di 75% a 4 ° C, o procedere immediatamente alla fase successiva.
2. Disidratare i campioni in una serie di alcool butilico terziario.
   1. Sostituire la soluzione di etanolo di 75% con 10 mL di 75% alcool butilico terziario (TBA) generosamente coprire i campioni e li Incubare per 1,5 h. Una pipetta Pasteur può essere utile per eliminare la soluzione.
   2. Ripetere il passaggio 2.2.1, aggiungendo TBA con aumento della concentrazione (100%, 85% e 95% v/v; e 3x con puro TBA) in una stufa di essiccazione a 30 ° C con estrazione dell'aria, poiché puro TBA crystalizes a temperatura ambiente (< 20 ° C) ed è molto volatile e tossico. Se TBA crystalizes con il campione, esso potrebbe danneggiare i tessuti.
3. Incorporare i campioni in paraffina¹⁸.
   1. Fate sciogliere la paraffina introducendo le perle di paraffina nella stufa essiccazione a 60 ° C con estrazione dell'aria del giorno precedente. Le perle di paraffina possono essere anche fuso su una piastra riscaldante, ma assicurano che la paraffina liquida sia a 60 ° C e non a una temperatura più elevata, per evitare danni ai tessuti.
   2. Sostituire il TBA con un mix di olio di paraffina e TBA (1:1) e incubare per 24 h all'interno di una stufa di essiccazione a 60 ° C. Quindi, sostituire il mix di TBA e olio di paraffina con puro sciogliere la paraffina e incubare per almeno 6 ore all'interno di una stufa di essiccazione a 60 ° C. Ripetere 2x e incubare l'ultimo cambiamento per almeno 4-6 d.
   3. Ogni campione viene posto su un piccolo stampo base metallo su una superficie di calore, embedded in cera di paraffina e passo la cassetta incasso. Posto sopra una superficie fredda e rimuovere il blocco una volta che la cera si solidifica.
4. Sezione e reidratare i preparativi.
   1. Preparare adesivo di Haupt: sciogliere 1 g di gelatina di Knox pianura in 100 mL di acqua distillata a 30 ° C; quindi, aggiungere 2 g di cristalli di fenolo sciolti (C₆H₅OH) e 15 mL di glicerolo. Sviluppa adesivo di Haupt su una lastra di vetro con un pennello e aggiungere una goccia di una soluzione di 1% di formaldeide.
   2. Sezione ogni paraffina bloccare a 10 µm in un microtomo rotatorio e inserire le sezioni su lastra di vetro coperto con adesivo di Haupt.
   3. Posizionare i vetrini con le sezioni su una superficie di calore a 35-40 ° C fino a secco; quindi spostare le diapositive di vetro in un portavetrini.
   4. Preparare le soluzioni dewax e reidratazione. Posto 200 mL di Histoclear II in tre piatti di vetro di colorazione, un altro con Histoclear II:ethanol (1:1, v/v), una serie di etanolo (100%, 70%, 40% v/v) e un lavaggio finale con acqua distillata.
   5. Sparaffinatura le sezioni con tre lavaggi, ogni 5 min, II Histoclear e Histoclear II:ethanol (1:1, v/v). Posizionare il portavetrini all'interno i piatti di vetro-macchiatura, assicurando che la soluzione copre completamente le diapositive e, quindi, spostare il portavetrini da una soluzione a quella successiva.
   6. Reidratare le sezioni dalla seguente serie di lavaggi 2 min: una serie di etanolo (100%, 70%, 40% v/v) e un lavaggio finale con acqua distillata. Infine, asciugare i vetrini a temperatura ambiente.
5. Macchia le sezioni¹⁸.
   1. Preparare I₂KI colorazione: sciogliere 2 g di ioduro di potassio (KI) e 0,2 g di iodio (ho₂) in 100 mL di acqua distillata. Applicare una goccia di fresco ho₂KI sopra le sezioni per 5 min e, quindi, eliminare l'eccesso di macchia assorbendo con una carta assorbente. Rapidamente, procedere al passaggio successivo.
   2. Applicare una piccola goccia di un supporto di montaggio sintetico, posto un piccolo bicchiere di copertura sulla parte superiore e premere con forza. Una volta che il supporto di montaggio si asciuga, osservare sotto un microscopio a campo chiaro per una valutazione preliminare dell'amido dell'ovaia.
      Nota: Questo passaggio non è obbligatorio, anche se si ottiene un migliore contrasto tra l'amido e lo sfondo. Se la sezione deve essere riutilizzato con altre macchie dopo quantificazione di amido, posizionare il vetro di copertura sopra la goccia di macchia e scartare l'eccesso assorbendo con una carta assorbente (vedere 2.5.1). Poi, dopo la quantificazione di amido, lavare fuori I₂KI macchia con acqua distillata e posto le preparazioni a fuoco in superficie a 35-40 ° C fino a secco.

3. quantificazione del contenuto di amido

1. Calibrare le condizioni ottiche.
   Nota: I livelli di rilevamento utilizzati dall'analizzatore di immagine per rilevare l'amido macchiato sono direttamente dipendenti da condizioni di luce e l'ingrandimento del microscopio; così, fissare queste condizioni per tutte le preparazioni valutate. Adattare la regolazione qui proposta per il microscopio disponibile e condizioni di luce.
   1. Regolare il diaframma d'apertura al 20 X ingrandimento e il controllo della luminosità o dell'intensità luminosa.
   2. Assicurarsi che non ci siano filtri sul portafiltro e selezionare una condizione di campo chiaro nel microscopio. Selezionare un ingrandimento adatto (per esempio, 40 X per primordio ovaia ciliegio dolce).
2. Controllare le condizioni di acquisizione immagine. Regolare le impostazioni della fotocamera con una preparazione macchiata senza tessuto via immagine | Acquisizione | Pre-view.
   1. Fissare la luminosità al 50%, il guadagno a 1.0 x e gli indicatori di istogramma la gamma valore alla 1.00 e il contrasto a 0 - 100, allineando con i limiti dell'istogramma di distribuzione di luminosità.
   2. Attivare la funzione di sovraesposizione/sottoesposizione e regolare il tempo di esposizione al limite della sovraesposizione.
   3. Applicare la funzione di bilanciamento del bianco per l'immagine completa per visualizzare tutti i componenti di colore neutro dell'immagine senza alcun tono di colore e la correzione dell'ombreggiatura all'immagine completa per creare un'immagine corretta e omogenea.
3. Calibrare il sistema di analisi di immagine per ottenere i valori di controllo del livello grigio (0, nero; 255, bianco) di diverse densità ottica (OD) che si ottengono i valori di trasmittanza (T).
   1. Acquisire un'immagine di una preparazione macchiata senza tessuto, considerato il controllo bianco, e misurare il livello di grigio dell'immagine in bianco e nero via misura | Grigio misura | Calibrare il grigio | Valore di riferimento = 0 | Misura | Calibrare | OK. Ciò corrisponde con una trasmissione di 100%; così, una densità ottica pari a 0, secondo OD = 2 - accedere T.
   2. Acquisire un'immagine della stessa preparazione con un filtro 4N, che riduce la quantità di luce 4 x e misura il livello di grigio dell'immagine in bianco e nero via misura | Grigio misura | Calibrare il grigio | Valore di riferimento = 0,6 | Misura | Calibrare | OK. Ciò corrisponde con una trasmissione di 25%; così, una densità ottica di 0,6, secondo OD = 2 - accedere T.
   3. Acquisire un'immagine della stessa preparazione senza luce, considerato il nero, e misurare il livello di grigio dell'immagine in bianco e nero via misura | Grigio misura | Calibrare il grigio | Valore di riferimento = 1 | Misura | Calibrare | OK. Ciò corrisponde con una trasmittanza di 0%; così, una densità ottica pari a 1, secondo OD = 2 - accedere T.
4. Rilevare l'amido.
   1. Acquisire un'immagine a colori del campo da misurare in formato TIFF con una risoluzione di almeno 300 punti per pollice (dpi).
   2. Creare un'immagine binaria corrispondente alla zona macchiata. Impostare le soglie di tre colori (valori tra 0 - 255 per ciascuno) fino a quando l'immagine binaria riflette esattamente i granuli di amido macchiato osservati, via immagine | Rilevare | Selezionare le soglie di rosso, blu e verde | OK. Fare paragoni ripetutamente visual in varie preparazioni e tessuti con cui ottimizzare i livelli di rilevamento finale. Memorizzare e utilizzare questi livelli per tutte le preparazioni.
   3. Quantificare l'amido. Convertire l'immagine originale a colori in un'immagine in bianco e nero con il sistema di analisi di immagine. Utilizzare l'immagine binaria come una maschera sovrapposta l'immagine in bianco e nero via immagine | Binary modifica. Misurare la somma della densità ottica di ogni pixel sotto la maschera tramite misura | Livello di grigio | OK e considerare questo valore come il contenuto di amido nel campo misurato.
   4. Ripetere i passaggi 3.4.1 - 3.4.3 in quattro luoghi dei primordi dell'ovaia per ottenere un valore rappresentativo del contenuto di amido nell'ovaia dei primordi del fiore.
   5. Ripetere i passaggi 3.4.1 - 3.4.3 e passo 3.4.5 in fiori diversi di ogni data di raccolta.

Risultati

Gli studi di dormienza richiedono la determinazione del momento quando sono soddisfatte le prescrizioni agghiacciante. Nonostante la mancanza di cambiamenti fenologici durante l'inverno in condizioni di campo (Figura 1A), alberi di ciliegio non recuperare la capacità di crescita in condizioni adatte fino a quando non passano un certo periodo a bassa temperatura. Il trasferimento regolare dei germogli in una camera di condizioni controllate (

Discussione

Dormienza in piante legnose perenni presenta chiare implicazioni nella produzione della frutta e della silvicoltura in un clima che cambia, anche se il processo biologico dietro dormienza rimane poco chiaro. Studi di dormienza possono essere affrontati da diversi punti di vista, ma la ricerca alla ricerca di un marcatore biologico per dormienza invernale si è intensificata negli ultimi anni. Tuttavia, la maggior parte dei tentativi di trovare un indicatore inequivocabile risultati quando un germoglio ha rotto la dormien...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Precision scale	Sartorius	CP225D
Stereoscopic microscope	Leica Microsystems	MZ-16
Drying-stove	Memmert	U15
Paraffin Embedding station	Leica Microsystems	EG1140H
Rotatory microtome	Reichert-Jung	1130/Biocut
Microtome blade	Feather	S35	Stainless steel
Bright field microscope	Leica Microsystems	DM2500
Digital Camera	Leica Microsystems	DC-300
Image Analysis System	Leica Microsystems	Quantiment Q550