Histochemical boyama ve nişasta yumurtalık Primordia tatlı kiraz kış uyuşukluk sırasında ölçmek için görüntü analizi

Özet

Biz histochemical teknikleri ile kombine bir görüntü analiz sistemi kullanılarak sırasında kış uyuşukluk yumurtalık primordia tatlı kiraz (Prunus avium L.) içinde nişasta içeriğinde ölçmek için bir metodoloji mevcut.

Özet

Nişasta küçük yapılarda üreme aşamaya döllenme ve meyve başlangıcı tozlaşma üzerinden de dahil olmak üzere çeşitli bitki gelişim süreçleri sırasında önemli olaylar ile ilişkili değişikliklerdir. Ancak, nişasta değişimler çiçek farklılaşma sırasında tamamen, çiçek primordia özellikle küçük yapıların nişasta içeriğinde miktarının esas zorluğu nedeniyle bilinmemektedir. Burada, farklı aşamaları ile nişasta içeriğinde değişiklikler ile ilgili sağlar mikroskop bağlı bir görüntü analiz sistemi kullanılarak yumurtalık primordia tatlı kiraz (Prunus avium L.) nişasta miktar için bir yöntemi açıklamak Bahar sonbahardan uyuşukluk. Bu amaçla, bud büyüme için kontrollü şartlar kış zamanında farklı anlarda transfer sürgünlerin değerlendirerek çiçek tomurcukları uyuşukluk durumu belirlenir. Yumurtalık primordia nişasta miktar için çiçek tomurcukları ardışık olarak toplanan, sabit, parafin balmumu içinde gömülü, kesitli ve ben ile lekeli₂Kl (potasyum iyodür-iyot). Ürünleri mikroskop altında gözlenen ve açıkça nişasta kökenli ayıran bir Image analyzer tarafından incelendi. Nişasta içerik değerleri her bir pikselin optik yoğunluk okudu çerçeve nişasta içeriği bir tahmini olarak toplamı dikkate alınarak lekeli nişasta için karşılık gelen görüntü optik yoğunluk ölçerek elde edilir.

Giriş

Ilıman odunsu çok yıllık bitkiler için mevsim onların büyüme ve gelişme oransal uyum. Bahar ve yaz aylarında geliştirirken, Sonbahar Kış¹' uyuyan gitmek sırasında büyüyen durdurmak. Uyuşukluk düşük kış ısılarda hayatta kalmak izin verecek, ancak, tüyler ürpertici bir bahar²uygun bir budburst için ön koşuldur. Uyuşukluk ılıman meyve üretim ve Ormancılık önemli etkileri çeşitli çabalarını belirlemek ve uyuşukluk dönem³tahmin açmıştır. Meyve ağacı türleri, ampirik deneyler koşulları ve çiçekli verilerine dayalı istatistiksel tahminler zorlama için sürgünler aktarma uyuşukluk, tahmin etmek araştırmacılar sağlayan kırılması tarihini belirlemek için güncel yaklaşımları vardır. her çeşidinde için gereksinimleri tüyler ürpertici. Ancak, biyolojik süreçleri dayalı uyuşukluk durumunu belirlemek nasıl belirsiz³kalır.

Tatlı kiraz (Prunus avium L.), gibi ılıman meyve ağaçlarında çiçeklenme yılda bir kez oluşur ve hakkında bir iki hafta sürer. Ancak, çiçekler ve dönüşüm sırasında önceki yaz⁴yaklaşık 10 ay önce geliştirmek için başlatın. Çiçek primordia sonbahar kış aylarında tomurcukları içinde hareketsiz kalır sırasında büyüyen durdurmak. Bu dönemde her çeşidinde uygun çiçekli⁴için belirli bir tüyler ürpertici gereklilik birikir gerekir. Kış aylarında tomurcukları phenological değişiklikler olmamasına rağmen çiçek primordia sırasında uyuşukluk fizyolojik aktif ve sıcaklık soğutma birikimi son zamanlarda nişasta birikimi dinamik ile ilişkili olduğu veya azaltmak Yumurtalık primordium hücrelerde uyuşukluk belirlenmesi⁵için yeni bir yaklaşım sunuyor. Ancak, küçük boyutu ve yumurtalık primordium konumunu özel bir metodoloji gerektirir.

Nişasta odunsu bitki tür⁶büyük depolama karbonhidrat var. Böylece, nişasta değişimler için karbonhidrat onların geliştirme^7,8desteklemek için gereken çiçek dokuların etkinlik fizyolojik ile ilgili olduğu. Üreme sürecinde farklı önemli olaylar da nişasta içeriği Anter mayoz⁹, polen tüplerinin ile stil veya ovule fertilizasyon¹⁰büyüme gibi farklı çiçek yapılarda değişimler ilgilidir. Histochemical teknikleri nişasta tespiti sırasında uyuşukluk çiçek primordia her belirli doku sağlar. Ancak, zorluk birikimi/azaltma onun desen zamana veya nişasta karşılaştırma takiben dokuların, çeşitlerin veya yıl arasında içerik izin vermek o nişasta miktarının kalır. Bu doku için analitik teknikler¹¹kullanılabilir küçük miktarda kaynaklanmaktadır. Alternatif olarak, görüntü analiz mikroskobu¹² ' ye bağlı nişasta miktar bitki doku¹³çok küçük örnekleri sağlar.

Callose¹⁴, mikrotüpler¹⁵, gibi bitki dokularında farklı bileşeninin içeriğini ölçmek veya özel tarafından boyanmış alanının boyutunu ölçerek¹⁶, nişasta için kullanılan mikroskobu ve görüntü analizi birleştirerek yaklaşımlar lekeleri. Nişasta için bu kolayca potasyum iyodür-iyot kullanarak tespit edilebilir (Ben₂KI) tepki¹⁷. Bu yöntem son derece özeldir; Ben₂KI nişasta taneleri Laminer yapısı içinde intercalates ve koyu mavi veya kırmızımsı kahverengi renk, nişasta¹⁸Amiloz içeriğine göre oluşturur. Bölümler ile lekeli₂KI leke nişasta ve bir kesin nişasta algılama ve sonraki miktar görüntü analiz sistemi¹⁹tarafından izin arka plan doku arasında yeterli kontrast göster. Bu boya stokiometrik olmasa da, iyot birikimi son derece¹⁷değişebilir nişasta molekül uzunluğu ile doğru orantılıdır. Böylece, nişasta içeriği yüksek farklılıklar benzer boyutta lekeli alanlar içeren alanlar arasında bulunamadı bu yana piksel sayısı olarak ifade lekeli alanının boyutunu nişasta, içeriğini doğru yansıtmayabilir. Alternatif olarak, nişasta içeriği kayısı^8,13 farklı dokularda bildirilmiştir gibi--dan mikroskop, elde edilen siyah beyaz görüntülerde lekeli granül optik yoğunluk ölçme tarafından değerlendirilecek ^{, 19}, avokado^10,20ve zeytin²¹.

Burada, anlayış ve tahmin için yeni bir araç sunuyor nişasta içeriği yumurtalık primordium doku tatlı kiraz, Bahar sonbahardan miktar uyuşukluk durum deneysel belirlenmesi birleştiren bir metodoloji açıklamak biyolojik mekanizmaları çalışmaya dayanarak uyuşukluk ve uyuşukluk ile bağlantılı.

Protokol

1. uyuşukluk belirlenmesi ve bitki malzeme toplama

1. Çiçek tomurcukları alanında örnek. Uyuşukluk çalışmalar uzun süreli deneyler ve yetişkin tomurcukları toplamak için yeterince büyük ağaçlar ve ağaçlar geliştirme önümüzdeki bahar aylarında ödün vermeden bütün kış vuruyor gerektirir. Özel meyve bahçesi yönetimi eğitim sistemine bağlı olarak gerekli olabilir; Böylece, budama meyve üretim amaçları için daha az şiddetli olabilir.
   1. Her hafta, bud sonu, başlangıcı kadar Sonbahar başlangıcı toplamak ve 10 çiçek tomurcukları ağırlık.
   2. Bir kap ile 10 mL cam tüp içine yerleştirerek çiçek tomurcukları gidermek ve etanol/Asetik asit (3:1) için en az 24 Saat 4 ° C'de bir sabitleştirici çözümde örnekleri emmek Sonra sabitleştirici atmak ve % 75 etanol, cömertçe örnekleri gelebilmektedir sağlanması ekleyin. Örnekleri 4 ° C'de Bu çözümde kullanmak kadar korunmuş.
      Not: Vakum infiltrasyon tomurcuk içinde hava kabarcıkları kaldırmak ve onları yüzen gelen engellemek için kullanılabilir. Bu sabitleştirici penetrasyon dokuları içine kolaylaştırır ancak yapısı dokuları zarar verebilir. Eğer gerekli değil önlemek için deneyin.
2. Sürgünler alanında örnek.
   1. Her hafta, 15-30 cm uzunluğunda ve 5 mm çapında, en az 10 çiçek tomurcukları içeren üç sürgünler bud sonu, başlangıcı kadar Sonbahar başlangıcı almak. Onları suya batırılmış çiçekçi köpük 22 ± 1 ° C 12 h hafif photoperiod da adlı bir büyüme odasında yerleştirin.
   2. 10 gün içinde büyüme odası sonra al ve 10 çiçek tomurcukları sürgün tartın.
3. Bud büyüme değerlendirmek ve uyuşukluk durumunu belirlemek. Konumu koşulları için ayarlanacak örnekleme süresi vardır. Orchard koşullarında (Zaragoza, İspanya, 41 ° 44'30 "N, 0 ° 47'00" W ve deniz seviyesinden 220 m), sürgünlerin örnekleme 30 Kasım Şubat sonu ya da Mart başında kadar üzerinden gerçekleştirilmiştir.
   1. Haftalık çiçek tomurcukları yanıt odası, uygun büyüme koşullarına kadar budburst Bahar, sonbahar başlangıcından itibaren alanından aldım 10 tomurcukları ağırlık karşılaştırarak değerlendirin.
   2. Hiçbir farkı yoktur veya daha az % 30 bu farklılıklar vardır, tomurcuklar tüyler ürpertici gereksinimlerini yerine değil ve endodormant²²vardır düşünün. Farklılıklar daha--dan %30, tomurcuklar tüyler ürpertici gereksinimlerini yerine getirdim ve ecodormant²²düşünün.

2. bitki nişasta miktar malzeme hazırlığı

1. Her örnekleme gelen Select altı sabit tomurcukları (bkz. Adım 1.1) Tarih. Çeşitlerin bağlı olarak, her tatlı kiraz çiçek tomurcuk beş çiçek primordia içerir.
   1. Dış bud ölçekler çıkarın ve tomurcuk kurumasını önlemek için % 75 etanol ile saatçi'nın camına yerleştirin.
   2. Tomurcuk teşrih ve hassas forseps yardımıyla ve stereoskopik mikroskop altında Oftalmolojik bir neşter ile bud başına en az bir çiçek primordium ayıklayın. Çiçek primordium bir 10 mL cam tüp 4 ° C'de % 75 etanol ile korunmuş veya hemen sonraki adıma geçin.
2. Tersiyer Bütil alkol serisi örneklerinde kurutmak.
   1. % 75 etanol çözüm 10 mL % 75 Tersiyer Bütil alkol (TBA) 1,5 saat için kuluçkaya ve cömertçe örnekleri kapağı değiştirin. Pasteur pipet çözüm atmak yararlı olabilir.
   2. Saf TBA oda sıcaklığında (< 20 ° C) crystalizes ve çok uçucu ve toksik beri yükselen konsantrasyonlarda (% 85, % 95 ve % 100, v/v; ve saf TBA ile 3 x) ile TBA ekleme 2.2.1, 30 ° c ile hava emme, kurutma fırın içinde adımları yineleyin. TBA ile örnek crystalizes durumunda dokulara zarar.
3. Parafin¹⁸' örnekleri katıştır.
   1. Parafin ile hava ayıklama önceki gün 60 ° C'de kurutma fırın içinde parafin inci tanıtarak eritebilir. Parafin inci de bir ocağın üzerinde erimiş olabilir, ama Sıvı parafin 60 ° C'de ve doku hasarı önlemek için daha yüksek bir sıcaklık, olduğundan emin olun.
   2. TBA TBA ve parafin yağı (1:1) karışımı ile değiştirin ve 60 ° C'de kurutma fırın içinde 24 h için kuluçkaya O zaman, TBA karışımı eski yerine koymak ve parafin yağı ile saf parafin eritin ve 60 ° C'de kurutma fırın içinde en az 6 h için kuluçkaya Tekrar 2 x ve en az 4-6 d için son değişikliği kuluçkaya.
   3. Her örnek üzerinde küçük bir metal temel kalıp ısı yüzey üzerinde yerleştirin parafin ve gömme kaset hızı gömülü. Soğuk bir yüzeye yerleştirin ve balmumu katılaşmış bir kez blok çıkarın.
4. Bölüm ve hazırlıklar rehydrate.
   1. Haupt'ın yapıştırıcı hazırlamak: düz Knox jelatin 30 ° C'de; distile su 100 ml 1 g dağıtılması sonra 2 g fenol gevşek kristaller (C₆H₅OH) ve 15 mL gliserol ekleyin. Bir fırça ile bir cam slayt Haupt'ın yapıştırıcı yayılmış ve % 1 formaldehit çözüm bir damla ekleyin.
   2. Her parafin 10 µm çevirme microtome, blok ve cam slayt üzerine bölümleri yer bölümü Haupt'ın yapıştırıcı ile kaplı.
   3. Cam slaytlar bölümleri ile 35-40 ° c ısı yüzey kuru kadar yerleştirin; sonra cam slaytları bir slayt raf taşıyın.
   4. Dewax ve rehydration çözümleri hazırlayın. Histoclear II 200 mL yer üç yemekleri Cam Boyama, başka bir Histoclear II:ethanol (1:1, v/v) ile bir etanol serisi (% 100, % 70, % 40, v/v) ve son bir distile su yıkama.
   5. Üç yıkar, her 5 dk, Histoclear II ve Histoclear II:ethanol (1:1, v/v) bölümlerle dewax. Cam Boyama yemekleri çözüm tamamen slaytları kapsar sağlanması içinde slayt raf yerleştirin ve sonra slayt raf bir çözümden geçmek.
   6. Bölüm 2-min yıkar aşağıdaki bir dizi tarafından rehydrate: bir etanol serisi (% 100, % 70, % 40, v/v) ve son distile su yıkama. Son olarak, oda sıcaklığında cam slaytlar kuru.
5. Bölüm¹⁸leke.
   1. Hazırlamak₂KI leke: 2 g potasyum iyodür (KI) ve iyot 0.2 g dağıtılması (Ben₂) 100 ml distile su. Bir damla taze uygulama ben₂KI 5 min için bölümler üzerinde ve sonra leke fazlalığı ile Bloting kağıt emerek atın. Hızlı bir şekilde bir sonraki adıma geçin.
   2. Küçük bir damla bir sentetik montaj ortamının uygulama, küçük bir cam üzerine yerleştirin ve sert bastır. Montaj medya kurur sonra yumurtalık nişasta bir ön değerlendirme için alan parlak mikroskopla gözlemlemek.
      Not: nişasta ile arka plan arasında daha iyi bir kontrast elde edilir, ancak bu adım zorunlu değildir. Bölümün diğer lekeleri ile nişasta miktar sonra yeniden kullanılabilir varsa, cam damla leke olarak yerleştirin ve Bloting kağıt ile emerek aşırı atmak (2.5.1 bakınız). Sonra nişasta miktar sonra yıkayın₂KI benim leke distile su ve hazırlıklar bir ateşte 35-40 ° C kadar kuru yüzey yer ile.

3. miktar nişasta içeriği

1. Optik koşullar kalibre.
   Not: Image analyzer tarafından lekeli nişasta algılamak için kullanılan algılama düzeyleri ışık koşulları ve mikroskop büyütme üzerinde doğrudan bağlı olan; Böylece, bu koşullar için tüm hazırlıklar değerlendirildi düzeltmek. Burada mevcut mikroskop ve ışık koşulları için önerilen ayar uyum.
   1. Diyafram diyafram 20 X büyütme ve Parlaklık kontrolü veya ışık yoğunluğunu ayarlayın.
   2. Filtre tutucu filtre olduğundan emin olun ve mikroskobu parlak alan koşulunu seçin. (Örneğin, 40 X tatlı kiraz yumurtalık primordium için) uygun bir büyütme düzeyini seçin.
2. Görüntü edinme koşulları kontrol. Kamera ayarlarını doku ile görüntü olmadan lekeli bir hazırlık | Edinme | Ön görünüm.
   1. Parlaklığı % 50, kazanç 1.0'de düzeltmek x ve gamma değeri 1.00 ve kontrast at 0 - çubuk grafik göstergeleri 100, parlaklık dağıtım histogram sınırları ile sıraya.
   2. Dozun/pozlama iþlevini etkinleþtirmek ve overexposure limitte çekim hızı ayarlayın.
   3. Beyaz dengesi fonksiyonu tam görüntü düzeltilmiş ve homojen bir görüntü oluşturmak için herhangi bir renk tonu ve gölgelendirme düzeltme olmadan görüntünün tüm nötr renkli bileşenleri görüntülemek için tam görüntü uygulanır.
3. Geçirgenliği (T) değerleri tarafından elde edilen farklı optik yoğunlukları (OD) gri düzeyi (0, siyah; 255, beyaz) denetim değerlerini elde etmek için görüntü analiz sistemi kalibre.
   1. Denetim beyaz kabul olmadan doku, lekeli bir hazırlık görüntüsünü elde etmek ve siyah beyaz görüntü ile ölçü gri düzeyini ölçmek | Gri ölçü birimi | Gri kalibre | Referans değeri = 0 | Ölçü birimi | Kalibre | Tamam. Bu % 100 geçirgenliği ile karşılık gelir; Böylece, bir optik yoğunluğu 0, OD göre = 2 - T. oturum
   2. 4 ışık miktarını azaltan bir 4N filtresiyle aynı hazırlık görüntüsünü elde x ve ölçü siyah beyaz görüntü ile ölçü gri düzeyi | Gri ölçü birimi | Gri kalibre | Referans değeri 0.6 = | Ölçü birimi | Kalibre | Tamam. Bu bir % 25 geçirgenliği ile karşılık gelir; Böylece, optik bir yoğunluğu 0,6, OD göre = 2 - T. oturum
   3. Işık, kabul siyah olmadan aynı hazırlık görüntüsünü elde etmek ve siyah beyaz görüntü ile ölçü gri düzeyini ölçmek | Gri ölçü birimi | Gri kalibre | Referans değeri = 1 | Ölçü birimi | Kalibre | Tamam. Bu bir % 0 geçirgenliği ile karşılık gelir; Böylece, optik bir 1, OD göre yoğunluğu = 2 - T. oturum
4. Nişasta algılamak.
   1. TIFF formatında en az 300 nokta / inç (dpi) çözünürlüğe sahip ölçmek için alan bir renk görüntüsünü elde etmek.
   2. Lekeli alan karşılık gelen ikili bir resim oluşturun. Üç renk eşikleri ayarlamak (değerleri arasında 0 - 255 her biri için) ikili görüntü tam olarak gözlenen üzerinden görüntü lekeli nişasta granülleri yansıtır kadar | Tespit | Kırmızı, mavi ve yeşil eşikleri seçin | Tamam. Çeşitli hazırlıkları ve doku son algılama düzeyleri ayarlamak için tekrar tekrar görsel karşılaştırma yapmak. Depolayın ve bu düzeyleri için tüm hazırlıklar kullanın.
   3. Nişasta ölçmek. Orijinal renk görüntü görüntü analiz sistemi ile siyah beyaz bir görüntü dönüştürmek. İkili resim siyah beyaz görüntü ile görüntü üzerinde üst üste bir maske olarak kullanmak | İkili düzen. Optik yoğunluk maske ile ölçü birimi altında her pikselin toplamı ölçmek | Gri düzeyi | Tamam ve ölçülen alanın nişasta içerik olarak bu değeri göz önünde bulundurun.
   4. 3.4.1 - 3.4.3 dört yerleri yumurtalık primordia çiçek primordia yumurtalık nişasta içeriğinde temsil eden bir değer elde etmek için yineleyin.
   5. Tekrarlamak merdiven 3.4.1 - 3.4.3 ve 3.4.5 her toplama tarihi farklı çiçekler içinde adım.

Sonuçlar

Uyuşukluk çalışmalar ne zaman ürpertici koşulları yerine getirmek an belirlenmesi gerekir. Düşük sıcaklık altında belirli bir süre geçene phenological değişiklikleri alan koşullarında (şekil 1A) kış aylarında olmamasına rağmen uygun koşullarla büyüme kapasitesini kiraz ağaçları geri mi. Sürgünleri Kış saati sırasında kontrollü şartlar Odası (şekil 1B) için normal aktarım çiçek tomurcuk...

Tartışmalar

Her ne kadar uyuşukluk arkasında biyolojik süreci belirsizliğini uyuşukluk içinde odunsu uzun ömürlü meyve üretiminde açık etkileri ve Ormancılık değişen bir iklimde sunar. Uyuşukluk çalışmaları farklı açılardan yaklaştı ama kış uyuşukluk biyolojik bir marker arıyorum araştırma son yılda şiddetlendi. Ancak, ne zaman bir tomurcuk uyuşukluk kırık vardır gösteren kesin bir gösterge bulmak için birçok girişimleri başarısız³olmuştur. Histochemical teknikle...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Precision scale	Sartorius	CP225D
Stereoscopic microscope	Leica Microsystems	MZ-16
Drying-stove	Memmert	U15
Paraffin Embedding station	Leica Microsystems	EG1140H
Rotatory microtome	Reichert-Jung	1130/Biocut
Microtome blade	Feather	S35	Stainless steel
Bright field microscope	Leica Microsystems	DM2500
Digital Camera	Leica Microsystems	DC-300
Image Analysis System	Leica Microsystems	Quantiment Q550