Сочетая гистохимические окрашивание и анализа изображений для количественного определения крахмала в яичнике Примордия черешни во время зимней спячки

Резюме

Мы представляем методологии для количественного определения содержания крахмала в яичнике Примордия в черешня (Prunus avium L.) во время зимней спячки с помощью системы анализа изображений в сочетании с гистохимические методы.

Аннотация

Изменения в крахмал в небольших структур связаны с ключевыми событиями во время нескольких процессов развития растений, включая репродуктивной фазы от опыления для оплодотворения и наступлением плодоношения. Однако вариации в крахмала во время дифференциация цветок не известны полностью, главным образом ввиду трудности количественного содержания крахмала в особенно малые структуры Примордия цветок. Здесь мы описываем метод количественного определения крахмала в яичнике Примордия черешни (Prunus avium L.) с помощью системы анализа изображений прилагается к Микроскоп, который позволяет, касающиеся изменений в содержание крахмала с различными фазами покоя с осени до весны. Для этой цели состояние покоя бутоны определяется путем оценки почка роста побегов, переведен в контролируемых условиях в различные моменты в зимнее время. Для количественной оценки крахмала в яичнике Примордия, бутоны последовательно собираются, фиксированной, встроенные в парафин, секционного и витражи с я₂КЛ (калия йодида йод). Подготовка наблюдается под микроскопом и анализируются анализатором изображения, что отличает крахмала от фона. Содержание крахмала значения получаются путем измерения оптической плотности изображения, которое соответствует окрашенных крахмала, учитывая сумму оптической плотности каждого пикселя как оценки содержание крахмала изучал кадра.

Введение

Умеренный древесных многолетних растений адаптироваться к сезоны, модулируя их роста и развития. В то время как они развиваются весной и летом, они перестают расти в течение осени пойти спящие в зимний¹. Хотя состояние покоя позволяет им выжить в низких зимних температур, охлаждения является необходимым условием для надлежащего budburst в весной². Важные последствия покоя в умеренных фруктов производства и лесного хозяйства привели к разнообразные усилия для определения и прогнозирования периода покоя³. В фруктовых деревьев, эмпирических экспериментов, передачи побеги заставляя условий и статистические прогнозы, основанные на данных цветения являются нынешние подходы к определить дату нарушение покоя, которая позволяет исследователям оценить охлаждение требования для каждого сорта. Однако как определить состояние покоя, основанные на биологических процессов остается неясным³.

Цветение в умеренных фруктовые деревья, такие как черешня (Prunus avium L.), происходит один раз в год и длится около недели. Однако цветы начинают различать и развивать около 10 месяцев назад, во время предыдущих летних⁴. Цветок Примордия остановить рост в течение осени оставаться спящие внутри почки в зимний период. В этот период каждый сорт необходимо накапливать конкретное требование охлаждения для надлежащего цветения⁴. Несмотря на отсутствие фенологическими изменениями в почки зимой цветок Примордия физиологически активны во время покоя, и накопление охлаждения температуры был недавно связан с динамика накопления крахмала или уменьшить в рамках клеток зачаток яичника предлагая новый подход для определения покоя⁵. Однако малый размер и расположение яичников зачаток требуют специальной методологии.

Крахмал является основным хранения углеводов в видов древесных растений⁶. Таким образом изменения в крахмал были связаны с физиологической активности цветок ткани, которые нужно углеводов для поддержки их развития^7,8. Также различные ключевые события в ходе репродуктивного процесса связаны с вариациями в содержание крахмала в разных цветочной структур, таких как пыльников мейоз⁹, рост пыльцы трубы через стиль или яйцеклетку оплодотворение¹⁰. Гистохимические методы позволяют выявлять крахмала в каждой конкретной ткани цветок Примордия во время покоя. Однако трудность остается в количественном определении что крахмала, чтобы после его шаблон накопления/уменьшение времени или сравнения крахмала контента среди тканей, сортов или лет. Это объясняется небольшое количество ткани для аналитических методов¹¹. В качестве альтернативы анализ изображений, связанных с микроскопии¹² позволяет количественная оценка крахмала в очень малых образцов тканей растений¹³.

Подходы, сочетающие анализ микроскопии и изображения были использованы для количественного определения содержания различных компонентов в тканях растений, например, callose¹⁴,¹⁵пробирок, или крахмала¹⁶, измеряя размер области, окрашенные конкретными пятна. Для крахмала, это могут быть легко обнаружены, используя иодид калия йод (I₂KI) реакции¹⁷. Этот метод является весьма специфический; Я₂ки встраивается в рамках слоистые структуры крахмала зерна и образует темно синий или красновато коричневый цвет, в зависимости от амилоза содержание крахмала¹⁸. Разделы, окрашенных с я пятно ки₂Показать адекватные контраст между крахмала и фон ткани, позволяя недвусмысленное крахмала обнаружения и последующего количественной системы анализа изображений¹⁹. Хотя эта краска не является стехиометрическим, накопление йода пропорциональна длина молекулы крахмала, которые могут весьма различаться¹⁷. Таким образом размер окрашенные области, выраженный в виде количество пикселей не может точно отражать содержание крахмала, поскольку высокая различия в содержание крахмала можно найти между полями с окрашенных областей аналогичного размера. В качестве альтернативы содержание крахмала может оцениваться путем измерения оптической плотности окрашенных гранул на черно-белых изображений, полученных с микроскопом, как сообщалось в различных тканях абрикосовое^{8,13 , 19},²⁰авокадо^10,и оливковых²¹.

Здесь мы описываем методологии, которая сочетает в себе экспериментального определения состояния покоя с количественного определения содержания крахмала в зачаток ткани яичника с осени до весны в вишни, предлагая новый инструмент для понимания и прогнозирования покоя, основанный на изучении биологических механизмов связана с покоя.

протокол

1. покоя решимость и растительных материалов коллекции

1. Образец бутоны на местах. Покоя исследования долгосрочных экспериментов и требуют взрослых деревьев достаточно большой для сбора бутоны и стреляет всю зиму без ущерба для развития деревьев во время следующей весной. Специальные Орчард управления может потребоваться в зависимости от системы подготовки; Таким образом Обрезка может быть менее серьезными, чем для целей производства фруктов.
   1. Каждую неделю, с начала осени до начала распускания, собирать и весят 10 бутонов.
   2. Исправьте бутоны, помещая их в 10-мл стеклянной трубки с крышкой и Замочите образцы в фиксирующие растворе этанола/уксусной кислоты (3:1) для по крайней мере 24 часа при 4 ° C. Затем отбросить фиксатором и добавьте 75% этанола, щедро, обеспечение того, что она охватывает образцы. Образцы могут быть сохранены в этом растворе на 4 ° C до использования.
      Примечание: Инфильтрации вакуум может использоваться для удаления пузырьков воздуха внутри бутона и предотвратить их от плавающих. Это облегчает проникновение фиксатором в тканях, но могут повредить структуру тканей. Старайтесь избегать его, если нет необходимости.
2. Побеги в поле образец.
   1. Каждую неделю, с начала осени до начала распускания, принять три побеги 15-30 см в длину и 5 мм в диаметре, содержащие по крайней мере 10 цветочные бутоны. Разместите их на водянистыми флористов пены в камере роста на 22 ± 1 ° C с 12 h света фотопериода.
   2. После 10 дней в камере роста выбрать и весят 10 бутонов из побегов.
3. Оценки роста Бад и определить состояние покоя. Периода отбора проб должен корректироваться с условиями расположения. В условиях фруктовый сад (Сарагоса, Испания, 41 ° 44'30 "N, 0 ° 47'00" W и 220 м над уровнем моря), с 30 ноября до конца февраля или начале марта была проведена выборки побегов.
   1. Еженедельно оцените ответ бутоны подходит роста условий палаты, с начала осени до budburst весной, сравнивая вес 10 бутонов, взял из поля.
   2. Если есть никаких различий или эти различия являются менее 30%, считают, что почки не выполнили их охлаждения требования и endodormant²². Если различия более чем на 30%, считают, что почки выполнили их охлаждения требования и ecodormant²².

2. завод подготовка для квантификации крахмала

1. Выберите около шести фиксированных почки от каждой выборки Дата (см. шаг 1.1). В зависимости от сорта каждый цветок бутон черешни содержит до пяти Примордия цветок.
   1. Удалить внешние бутон весы и поместите бутон на часовщик стекло с 75% этанола, чтобы предотвратить его от высыхания.
   2. Вскрыть бутон и извлекать по крайней мере один цветок зачаток за Бад с помощью щипцов точности и офтальмологических скальпеля под стереоскопическим микроскопом. Первобытная цветок может быть сохранено в 10-мл стеклянной трубки с 75% этанола на 4 ° C, или немедленно приступить к следующему шагу.
2. Обезвоживает образцы в серии третичный бутиловый спирт.
   1. Замените 75% этанола раствор 10 мл 75%, третичный бутиловый спирт (TBA) щедро образцы и проинкубируйте 1,5 ч. Пипетка Пастера может быть полезным для отмены решения.
   2. Повторите шаг 2.2.1, добавив TBA с ростом концентрации (85%, 95% и 100% v/v; и 3 x с чистой TBA) в сушильной печи при 30 ° C с вытяжной вентиляции, так как чисто TBA crystalizes при комнатной температуре (< 20 ° C) и весьма нестабильной и токсичных. Если та crystalizes с образцом, он бы повредить ткани.
3. Внедрите образцы в парафин¹⁸.
   1. Расплава парафина, вводя парафин жемчуг в сушильной печи при 60 ° C с вытяжной за предыдущий день. Парафин жемчуг может быть также растаял на плитой, но убедитесь, что парафин жидкий при 60 ° C и не при более высокой температуре, чтобы избежать повреждения тканей.
   2. Замените TBA смесь ТБА и парафинового масла (1:1) и проинкубируйте 24 h внутри сушильной печи при температуре 60 ° C. Затем заменить сочетанием TBA и парафина нефти парафином Чистый расплав и инкубировать в течение 6 часов внутри сушильной печи при температуре 60 ° C. Повторить это 2 x и инкубировать последнего изменения для по крайней мере 4-6 d.
   3. Место каждого образца на небольшой металлический базы плесень на поверхности тепла, встроенные в парафин и темпы внедрения кассеты. Поместите его над холодной поверхностью и удалить блоке после затвердевшим воск.
4. Раздел и увлажняет подготовки.
   1. Подготовить Хаупт клей: растворить 1 g равнина Нокс желатина в 100 мл дистиллированной воды при температуре 30 ° C; Затем добавьте 2 g свободные кристаллов фенола (C₆H₅OH) и 15 мл глицерина. Распространиться на стеклянную вставку с помощью кисти Хаупт клей и добавить каплю 1% раствора формальдегида.
   2. Раздел каждый парафин блок на 10 мкм в вращательное микротома и место разделы на слайд стекла покрытые Хаупт на клей.
   3. Место стекла слайды с разделами на поверхности тепла на 35-40 ° C до полного высыхания; затем переместите слайды стекла в слайд стойку.
   4. Подготовка решения dewax и регидратации. Место 200 мл Histoclear II в три стекла окрашивание блюда, еще один с Histoclear II:ethanol (1:1, v/v) этанола серии (100%, 70%, 40% v/v) и окончательный промыть дистиллированной воды.
   5. DEWAX секции с тремя моет, каждый 5 мин, в Histoclear II и Histoclear II:ethanol (1:1, v/v). Установите решетку слайд внутри стекла окрашивание блюда, обеспечивая, что решение полностью покрывает слайды и затем переместить слайд стойку из одного решения к следующему.
   6. Увлажняет разделах следующей серии 2-мин моет: серия этанола (100%, 70%, 40%, v/v) и окончательный промыть дистиллированной воды. Наконец сухие слайды стекла при комнатной температуре.
5. Пятно разделы¹⁸.
   1. Готовить я пятно ки₂: Растворите 2 г йодида калия (KI) и 0,2 г йода (я₂) в 100 мл дистиллированной воды. Применить капли свежего я₂ки над раздел 5 мин и затем сбросить избыток пятно, поглощая с промокательной бумаги. Быстро переходите к следующему шагу.
   2. Нанесите небольшое падение синтетических монтажа СМИ, место небольшой покровным стеклом на вершине и нажимать. После монтажа СМИ высыхает, наблюдать под микроскопом ярко поле для предварительной оценки завязи крахмала.
      Примечание: Этот шаг не является обязательным, хотя получается лучше контраст между крахмала и фон. Если секция должна использоваться с другими пятна после количественной крахмала, поместите Стекло покровное падение пятно и отбросить избыточные, поглощая с промокательную бумагу (см. 2.5.1). Затем, после крахмала количественной оценки, вымыть, я₂ки пятно с дистиллированной водой и место препараты на огне поверхности на 35-40 ° C до полного высыхания.

3. Количественная оценка содержание крахмала

1. Калибровки оптических условий.
   Примечание: Уровни обнаружения используется анализатором изображения для обнаружения окрашенных крахмала напрямую зависит от условий освещения и увеличение микроскопа; Таким образом исправьте эти условия для подготовки оценки. Адаптировать перестройки, предлагаемый здесь доступен микроскоп и условий освещения.
   1. Настройка диафрагмы диафрагмы на 20 X увеличение и регулировки яркости или силы света.
   2. Убедитесь, что нет фильтров на держатель фильтра и выберите условие ярко поля в микроскопе. Выберите подходящий масштаб (например, 40 X для черешня завязи зачаток).
2. Контроль условий приобретения изображений. Настроить параметры камеры с окрашенных подготовки без ткань через изображения | Приобретение | Предварительный просмотр.
   1. Исправить яркости на 50%, прирост в 1.0 x и гистограммы Индикаторы, гамма значение 1.00 и контраст на 0 - 100, накладки с пределы гистограммы распределения яркости.
   2. Активируйте функцию передержки/недоэкспозицией и отрегулировать время экспозиции на пределе передержки.
   3. Примените функция баланса белого для полного изображения для отображения всех компонентов нейтрального цвета изображения без каких-либо цветовой тон и коррекции затенения на полное изображение для создания образа исправлениями и однородной.
3. Калибровка системы анализа изображений для получения значений элемента управления уровня серого (0, черный; 255, белый) различных оптических плотностей (OD), которые получаются путем значения коэффициента пропускания (T).
   1. Получить изображение окрашенных подготовки без ткани, считается управления белый, и измерить серый уровень черно-белое изображение через мера | Серый мера | Калибровки Грей | Ссылка значение = 0 | Мера | Калибровки | ОК. Это соответствует 100% пропускания; Таким образом, оптическая плотность 0, согласно од = 2 - журнал т.
   2. Получить изображение же подготовки с фильтром 4Н, который уменьшает количество света, 4 x и мера серый уровень черно-белое изображение через меру | Серый мера | Калибровки Грей | Ссылка значение = 0,6 | Мера | Калибровки | ОК. Это соответствует с 25% пропускания; Таким образом, оптическая плотность 0,6, согласно од = 2 - журнал т.
   3. Получить изображение же подготовки без света, считается черный, и измерить серый уровень черно-белое изображение через меру | Серый мера | Калибровки Грей | Ссылка значение = 1 | Мера | Калибровки | ОК. Это соответствует 0% пропускания; Таким образом, оптическая плотность 1, согласно од = 2 - журнал т.
4. Обнаруживает крахмала.
   1. Получить цветное изображение поля для измерения в формате TIFF с разрешением по крайней мере 300 точек на дюйм (dpi).
   2. Создайте двоичный образ, соответствующий области витражи. Установить пороги три цвета (значения в диапазоне 0 - 255 для каждого) до тех пор, пока двоичное изображение точно отражает гранулы окрашенных крахмала, наблюдается, через изображения | Обнаруживать | Выберите пороговые значения красного, синего и зеленого | ОК. Сделать неоднократно визуального сравнения в различных препаратов и тканях настраивать уровни окончательный обнаружения. Хранить и использовать эти уровни для всех препаратов.
   3. Количественно крахмала. Преобразуйте оригинальные цветного изображения в черно-белое изображение с системой анализа изображения. Используйте двоичное изображение как накладывается маска на черно-белое изображение через изображения | Двоичного редактирования. Измерить сумму оптической плотности каждого пикселя под маску через меру | Серый уровень | OK и рассмотреть это значение как содержание крахмала в области измерений.
   4. Повторите шаги 3.4.1 - 3.4.3 в четырех местах Примордия яичников для получения представительной значения содержания крахмала в завязи цветка Примордия.
   5. Повторите шаги 3.4.1 - 3.4.3 и шаг 3.4.5 в разных цветов каждого сбора даты.

Результаты

Покоя исследования требуют определения момента, когда охлаждение требования выполнены. Несмотря на отсутствие фенологическими изменениями в зимний период в полевых условиях (рис. 1а) вишневые деревья не восстановить потенциал роста в подходящих усло?...

Обсуждение

Покоя в древесных многолетних растений представляет четкие последствия в производство фруктов и лесного хозяйства в условиях изменения климата, хотя остается неясным, биологический процесс позади покоя. Покоя исследования можно подойти с различных точек зрения, но исследования, ищет...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Precision scale	Sartorius	CP225D
Stereoscopic microscope	Leica Microsystems	MZ-16
Drying-stove	Memmert	U15
Paraffin Embedding station	Leica Microsystems	EG1140H
Rotatory microtome	Reichert-Jung	1130/Biocut
Microtome blade	Feather	S35	Stainless steel
Bright field microscope	Leica Microsystems	DM2500
Digital Camera	Leica Microsystems	DC-300
Image Analysis System	Leica Microsystems	Quantiment Q550