בידוד של Glomeruli, In Vivo תיוג של חלבונים פני שטח התא Glomerular

Summary

כאן אנו מציגים עבור מאתר ויוו תיוג של חלבונים פני שטח התא glomerular עם ביוטין פרוטוקול. פרוטוקול זה מכיל מידע על אופן perfuse העכבר הכליות, לבודד glomeruli, ולבצע immunoprecipitation אנדוגני של החלבון עניין.

Abstract

פרוטאינוריה נובעת שיבוש המסנן glomerular המורכבת אנדותל fenestrated גלומרולרי במרתף, podocytes עם דיאפרגמות חריץ שלהם. המבנה העדין של המסנן glomerular, במיוחד הסרעפת שסע, מסתמכת על יחסי הגומלין של חלבונים פני שטח התא מגוונות. לומדים אלה חלבונים פני שטח התא כה הוגבלה במבחנה בלימודים או ניתוח היסטולוגית. כאן, אנו מציגים biotinylation מאתר ויוו תיוג שיטה, אשר מאפשר חקר חלבונים פני שטח התא glomerular בתנאים הפיזיולוגיות, pathophysiologic. פרוטוקול זה מכיל מידע על אופן perfuse העכבר הכליות, לבודד glomeruli, ולבצע immunoprecipitation אנדוגני של חלבון עניין. כימות למחצה של שפע פני שטח התא glomerular ונותרות עם שיטה חדשנית זו, נגיש זלוף ביוטין כל החלבונים, ניתן יהיה ללמוד immunoprecipitation. בנוסף, בידוד של glomeruli עם או בלי biotinylation מאפשר עוד ניתוח של glomerular RNA, חלבון, כמו גם תרבית תאים glomerular הראשית (קרי, תרבית תאים של podocyte הראשית).

Introduction

פרוטאינוריה מהווה סימן היכר של פציעה glomerular ומלווה בדרך כלל שיבוש מסנן glomerular¹. המסנן glomerular מורכב של אנדותל fenestrated, גלומרולרי במרתף, podocytes. המבנה המולקולרי העדין של המסנן glomerular היא דינמית מאוד על תאי הדם בבני אדם בשתי הכליות בריאים וחולים^2,3,4,5,6 . אנדוציטוזה של חלבונים פני שטח התא הוכח חיונית להישרדותו של podocytes⁷. Nephrin podocalyxin transmembrane חלבונים לידי ביטוי podocytes בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. Nephrin הוא עמוד השדרה של הסרעפת שסע glomerular, בעוד podocalyxin הוא sialoglycoprotein ציפוי תהליכי רגל משני podocytes^8,9,10. סחר endocytic שהוצג בעבר עבור nephrin ו- podocalyxin^{3,11,12,13,14}.

לפי מיטב ידיעתנו, אנדוציטוזה של חלבונים פני שטח התא לא עוד תואר בתאי האנדותל glomerular בספרות. עם זאת, תאי אנדותל לבטא באופן כללי כל החלבונים הדרושים עבור סוגים שונים של אנדוציטוזה (קרי, אנדוציטוזה clathrin תלוית, תלויי-רפסודה)^15,16. לכן, תאי אנדותל משטח סחר עשויים להילמד בשיטה זו משתמשים, לדוגמה, אנדותל כלי הדם (VE)-קדהרין, מולקולה אדהזיה תאיים (ICAM-2) כמו תא משטח סמן חלבון תאי אנדותל glomerular¹⁷ .

למרבה הצער, יש אין מודל מדויק במבחנה למסנן עדין שלוש שכבות glomerular בתא שבו הדם סחר יכול להילמד. המטרה של שיטה זו היא ובכך ללמוד חלבון glomerular סחר ויוו. בנוסף, פרוטוקול זה מכיל מידע על כיצד לבודד glomeruli, המאפשר ניתוח של glomerular RNA, חלבונים, או תאים. דומה בידוד glomerular טכניקות תוארו על ידי שונים קבוצות^18,19.

בעבר, אנחנו ואחרים השתמשו שמחוץ תיוג של חלבונים פני שטח התא glomerular מאת biotinylation^2,3,4,20,21. עם זאת, בשיטה זו שמחוץ , מבודד glomeruli נחשפו ללחץ מכני, העלולים להשפיע על סחר endocytic. לחלופין, immunofluorescence תיוג של חלבונים פני שטח התא glomerular בהרחבה שימש בספרות^2,20,22. בשיטה זו, עם זאת, ניתן לנתח כמות קטנה של חלבונים בתוך שקופית אחת, כימות של immunofluorescence תמונות קשה לעיתים קרובות.

השיטה הרומן ויוו מציעה כלי אמין ללמוד glomerular תא הדם שפע וסחר במדויק בתוך בריאים וחולים הכליות, זה יכול לשמש כתוספת בדיקות immunofluorescence.

Protocol

עכברים התקבלו כמו גזע ללא צורך במיקור חוץ מתקן טיפול בבעלי חיים מקומיים או מעבדות Janvier בצרפת. החקירות נערכו על פי ההנחיות המפורטות במדריך עבור טיפול, שימוש של חיות מעבדה (ארה ב נבחרת מוסדות של בריאות פרסום מס ' 85-23, תוקן 1996). כל הניסויים בוצעו על פי האישורים מוסדיים הרלוונטיים (ממשלת מדינת LANUV להפנות מספר AZ:84-02.04. 2016.A435).

1. הכנת כלי נגינה, פתרונות וציוד

1. להכנת 1 ליטר של תמיסת מלח פוספט באגירה מלאה בתוספת 1 מ מ מגנזיום כלוריד (MgCl₂) ו- 0.1 מ מ סידן כלורי (₂CaCl) (PBSCM) ולסנן אותו דרך מסנן סטרילי.
2. להתכונן 5 מ של PBSCM סטרילי לכל העכבר זלוף ומניחים אותו על קרח.
3. עבור כל עכבר, להכין 5 מ של PBSCM סטרילית בתוספת 0.5 מ"ג/מ"ל ביוטין.
4. עבור כל עכבר, להכין 5 מ של PBSCM סטרילי, להוסיף 0.8 x 10⁸ beads מגנטי (למשל., 200 µL של⁸ 4 x 10 חרוזים/mL פתרון, ללא רעלני) עבור אמבוליזציה של glomeruli. להכין פתרון זה תחת הספסל התרבות התא כדי לשמור את החרוזים מגנטי סטרילי הצינור המקורי. במקום פתרון זה על קרח.
5. להכין פתרון quenching על-ידי הוספת 100 מ מ גליצין PBSCM (5 מ"ל לכל עכבר) ולשמור אותו בקרח.
6. להפוך את פתרון collagenase (0.378 U/mL collagenase א ב PBSCM סטרילי). לכל עכבר, פיפטה 1 מ"ל של הפתרון collagenase לתוך צינור 2 מ"ל ומניחים אותו על קרח.
7. עבור כביסה, להכין PBSCM סטרילי (ראה שלב 1.1) ב- 50 מל צינור ומניחים אותו על קרח.
8. זלוף, להשתמש משאבת מזרק עם זרם של 2.0 mL/min.
9. להכין מזרק 10 מ"ל עם מחט 21G. מניחים את קצה המחט צנתר ארוכה 20-30 ס מ (הקוטר הפנימי, ID = 0.58 מ מ). לחבר את הקטטר (מזהה 0.58 מ"מ) עם צנתר קצר 10 ס מ (מזהה 0.28 מ מ) חותכים את קצה הקטטר קטנים עקיפה עבור ההכנסה בקלות לתוך העורקים העכבר.
10. להליכי קשירה במהלך הניתוח, חותכים שלושה 5-7 ס מ חוטי משי (4-0 ל- 6-0) לכל העכבר.
11. . לניתוח, להכין 3 מלחציים כירורגי, מספריים כירורגיים 2, פינצטה 2, 2 פינצטה בסדר, מספריים בסדר 1, מטליות. הכינו את ההרדמה (למשל, בקרום הבטן הרדמה קטמין 100 מ"ג/ק"ג משקל גוף, חריגות השירותים הווטרינריים 5 מ"ג/ק"ג משקל גוף).
12. עבור בידוד של glomeruli של שתי כליות, השתמש מסננת תא 100 מיקרומטר, שני צינורות 50 מ ל, תופס מגנט.
13. תתכוננו בחורים פירוק מאגר: 20 מ מ 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate (בחורים); 20 מ מ טריס (hydroxymethyl)-aminomethan (טריס) pH 7.5; sodiumchorlide 50 מ מ (NaCl); sodiumfluoride 50 מ מ (NaF); 15 מ מ נה₄P₂O₇; 0.1 מ מ Ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) pH 8.0; sodiumorthovanadate 2 מ מ; adenosinetriphosphat 2 מ מ (ATP).
14. צנטריפוגות מגניב עד 4 ° C.

2. ניתוח מתחת למיקרוסקופ

1. עזים ומתנגד העכבר (למשל, עם חריגות קטמין/השירותים הווטרינריים intraperitoneally, ראה שלב 1.11). לבצע את הבדיקה הבוהן-קמצוץ לאשר הרדמה. ראויה.
2. לחטא הצד הבטני של העכבר עם אלכוהול איזופרופיל 70%.
3. לבצע חתך החציוני דרך העור מן האגן לעצם החזה ולהסיר את העור fascia בטן באמצעות פינצטה. לחתוך את העור משני הצדדים באמצע הבטן עם מספריים כירורגיים.
4. שינוי כלי ניתוח. להחיל חתך החציוני של מצאתי שלפוחית השתן דרך השכבה שריר הבטן, לחלק את אותם ארבעת הרבעים באמצעות פינצטה ומספריים כירורגי. לצרף את העליונות בצד שני עם התפסים כלפי הצוואר של העכבר עם שני תופסנים כירורגי.
   הערה: הבטן עכשיו נפתח.
5. לשים איברים הקרביים הצידה עם מקלון סטרילי, לחתוך רצועה ולשננו-הסרעפת עם מספריים משובחים.
6. להכין מצדו (עם משי חוט 4-0 ל- 6-0) סביב העורקים צינתור עורקי כליות על הגובה של בלוטת יותרת הכליה עם פינצטה בסדר שני. להדק את מצדו של אבי העורקים proximal לבטל זרימת הדם עם פינצטה.
7. חינם העורקים דיסטלי fascia, שומן, רקמות אחרות והכן של מצדו סביב עורק מצע המעי/העליון ולשננו הגולגולת של העורקים הכליות באמצעות פינצטה כירורגית משובחים.
8. להכין מצדו (עם משי חוט 4-0 ל- 6-0) סביב העורקים דיסטלי של העורקים כליות, מלחציים הנבוב העליון של אבי העורקים בשיא ההסתעפות.
9. לחתוך חור קטן לתוך העורקים דיסטלי העורקים כליות כך החור הוא מחצית מהקוטר של אבי העורקים. מכניסים את הצנתר העורקים ותקן אותה באמצעות הקשירה מוכנה.
   זהירות: יש להימנע בועות במערכת זלוף כדי למנוע. תסחיף אוויר.
10. נתחיל זלוף PBSCM קר כקרח בספיקה של 2 mL/min.
11. לחתוך חור לווריד כליות ברמה של העורקים כליות עם מספריים כירורגיים בסדר והדק את מצדו סביב העורקים הכבד, מצע המעי העליון.
    הערה: הכליות צריך לפנות חיוור לאחר הפעלת את זלוף.

3. Biotinylation in Vivo

1. שינוי המזרק בועה-חופשית כדי PBSCM קר כקרח בתוספת 0.5 מ"ג/מ"ל ביוטין עבור משטח labelling, והוא perfuse כליות 5 מ ל קצב הזרימה של 2 mL/min.
   הערה: לערבב את הפתרונות PBSCM (למשל, על-ידי הפעלת הצינורות 50 מ ל) בעדינות כדי למנוע יצירת בועות בתוך הפתרון. לאחר השאיפה של הפתרון בתוך המזרק, לפנות את כל בועות או אוויר מן המזרק. להשתמש בצינורית תוספת של (21 גרם) על המזרק כדי למלא את החלל ב הצינורית המחוברת למערכת קטטר. לבסוף, לתחוב את המזרק לתוך הצינורית עם הצנתר ללא בועות.
2. לשנות את המזרק ללא בועות PBSCM קר כקרח בתוספת 100 מ מ גליצין להרוות glomeruli, perfuse עם 5 מ ל- זרם של 2 mL/min.
3. שינוי המזרק בועה-חופשית כדי PBSCM קר כקרח בתוספת 200 μL מגנטי חרוזים/mL, perfuse כליות ב 2 mL/min.
   הערה: על פני השטח כליות, אמבוליזציה של glomeruli עם חום beads מגנטי יהיה גלוי.

4. בידוד של Glomeruli מ שתי כליות

1. להסיר כליות ב hilum ולהסיר את הקפסולה. מניחים את הכליות על הקרח ב-15 מיליליטר PBSCM בצלחת תרבות תא 10 ס מ. המתת חסד את העכבר עם נקע בצוואר הרחם תחת הרדמה לאחר לקצור את הכליות. ההליכים זלוף ובבית האחרון כ 20-22 דקות.
2. לחתוך הכליות לחתיכות הקטן ביותר האפשרי עם להב כפול-קצה חדש. להזיז את הרקמה לתוך צינור 2 מ"ל עם 1 מ ל collagenase א (ראה שלב 1.6), תקציר ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לפני ואחרי תהליך העיכול, מערבבים בעדינות עם μL 1000 לחתוך פיפטה.
3. יש לשטוף את הרקמה מתעכל דרך מסננת 100 μm התא באמצעות PBSCM קר כקרח. להשתמש בעדינות את התא-במגרדת מינצ את השוקת הרקמה הנותרת מסננת התא, לשטוף אותו עם PBSCM קר כקרח לאחר מכן את הנפח הכולל של 50 מ.
4. Centrifuge את המתלים ב 4 ° C g 500 x 5 דק. להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר עם מעט פחות מ- 1.5 מ ל PBSCM קפואים בזמן vortexing בגדר. לאחר מכן, מכניסים את המתלים glomerular צינור 2 מ"ל.

5. כביסה

1. השתמש הנדפק מגנט למשוך glomeruli לצד אחד. המתן 1 דקות לפני glomeruli עברו לכיוון המגנט.
2. הסר את תגובת שיקוע עם פיפטה μL 1000 בעוד הצינור 2 מ"ל נשאר בהתפסן מגנט. במהלך השטיפה הראשונה והשניה צעדים (ראה שלב 5.3), 250 μL שרידי supernatant בצינור כדי להימנע מאובדן glomeruli. בצע הליך זה במהירות כדי להימנע לתת מבנים צינורי לשקוע לתחתית הצינור.
   הערה: ההליך כביסה מעמד אחרת.
3. להסיר את הצינור 2 מ"ל מגנט התופס ולהוסיף 1 מ"ל של PBSCM, פיפטה למעלה ולמטה (חשוב מאוד), אז מערבולת.
4. תחזיר את הצינור לתוך הנדפק מגנט ולהתחיל מחדש עם צעד 5.2.
5. חזור על השלבים כביסה עד טוהר glomeruli הגיעה 90%. בשביל זה, לבחון aliquot הנציגה של תגובת שיקוע תחת מיקרוסקופ (40-100 X).
   הערה: Glomeruli יופיעו כמבני עגול המכיל beads מגנטי חום. מבנים מאורכים שברי צינורי הינם חינם beads מגנטי להופיע כנקודות סיבוב חום. שאריות תאים עשויים להופיע כמבני מגושם.
6. אם טוהר הגיעה, הערכה הרוזן glomeruli על ידי המסת glomeruli ב 1 מ"ל של PBSCM. לאחר ערבוב, של aliquot של 10 μL ואין ספור glomeruli מתחת למיקרוסקופ. לחשב את מספר glomeruli עם המשוואה הבאה: המספר הסופי של glomeruli = מספר glomeruli ב 10 μL aliquot x 100.
7. הבידוד מוצלח של glomeruli מוביל מגוון glomeruli 10,000-40,000.

6. חלבון חילוץ ו- Immunoprecipitation (IP)

1. Glomeruli לאסוף על ידי צנטריפוגה ב 4 ° C-g x 6800 עבור 5 דק. להסיר את תגובת שיקוע תוך שימוש תופס מגנט, resuspend בגדר במאגר פירוק כקרח (למשל., 30,000 glomeruli ב- 300 μL; חברים, ראה שלב 1.11). Homogenize את הדגימות עם רקמות מהמגן במהירות הגבוהה ביותר ב-30 s ואת lyse אותם על קרח למשך 30 דקות.
2. מסירים חומרים לא מסיסים על ידי צנטריפוגה ב 15,000 g x במשך 30 דקות על 4 מעלות צלזיוס. Pipette את תגובת שיקוע הכולל את התא lysate לתוך צינור 1.5 mL החדש. להתעלם בגדר.
3. למדוד את ריכוז חלבון תגובת שיקוע על-ידי שימוש של bicinchoninic (BCA)-המבוסס על שיטת ההוראות של היצרן. פירוק מוצלחת של 30,000 glomeruli התשואות על כמות חלבון glomerular של 700-1, 000 µg/mL. להתאים כמויות חלבון שווה עם פירוק מאגר.
4. . קח את aliquot של 10% מהנפח הכולל עבור glomerular lysate ולהוסיף 2 x Laemmli + dithiothreithol (DTT) לפני הדגירה למשך 5 דקות ב 95 ° C.
5. עבור ה-IP, דגירה שאר lysate עם חרוזים agarose streptavidin בין לילה-4 מעלות צלזיוס על שייקר תקורה.
6. צנטריפוגה agarose חרוזים ב 1000 x g למשך 3 דקות ב 4 ° C, להסיר את תגובת שיקוע והוסף μL 800 פירוק מאגר לשטוף את החרוזים עבור איגוד חלבון לא ספציפי.
7. חזור על לשטוף את 3 פעמים, להסיר את תגובת שיקוע לחלוטין.
8. להוסיף 30 μL של 2 x Laemmli + DTT, דגירה ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
9. טען את lysate ואת ה-IP הגששים-מרחביות 10% ג'ל ולהפעיל את הג'ל מרחביות 70 V למשך 30 דקות, ואז בגיל 20 אמא לכל ג'ל ה 1.5 לאחר מכן, למחוק את הג'ל על 2 h ב- 200 mA על קרום ניטרוצלולוזה.
10. לחסום את הקרום ניטרוצלולוזה בן לילה ב 4 ° C עם 5% אלבומין שור (BSA) ב שטיפת מאגר.
11. דגירה הקרום עם הנוגדן עניין בן לילה ב 4 º C. לשטוף עם שטיפה מאגר 3 פעמים במשך 5 דקות על מטרף, דגירה הקרום עם הנוגדן משני מתויג HRP לשעה בטמפרטורת החדר. חזור על השלב כביסה.
12. דמיינו את lysate, immunoprecipitation רגשים על הקרום באמצעות סוכן chemiluminescent סופר רזולוציה עם מצלמת CCD.

תוצאות

כדי לבודד glomeruli באופן מדויק, יש צורך perfuse מאתר הכליות עם PBSCM קודם. זלוף עם PBSCM פונה הכליות חיוור (איור 1א'). אמבוליזציה של glomeruli עם חרוזים מגנטי יהיה גלוי כנקודות חום על פני כליות (איור 1B). בידוד של glomeruli עם התפסן מגנט עשוי להראו...

Discussion

השיטה הציג מאפשר בידוד מוצלחת של glomeruli לחקור glomerular RNA או החלבון. בנוסף, ניתן לבצע תרביות תאים glomerular הראשית glomeruli מבודד. אם ביוטין מוחל לפני glomerular בידוד, תיוג של חלבונים פני שטח התא glomerular יכולה להתבצע. בשיטה זו, אין ויוו glomerular תא הדם סחר יכול להילמד, כימות למחצה של חלבון שפע אפשרית. השלבים ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Motic SMZ168 BL	Motic	SMZ168BL	microscope for mouse surgery
KL1500LCD	Pulch and Lorenz microscopy	150500	light for mouse surgery
Rompun (Xylazin) 2%	Bayer	PZN:01320422	anesthesia
Microfederschere	Braun, Aesculap	FD100R	fine scissors, for cut into the aorta
Durotip Feine Scheren	Braun, Aesculap	BC210R	for abdominal cut
Anatomische Pinzette	Braun, Aesculap	BD215R	for surgery until the abdomen is opened
Präparierklemme	Aesculap	BJ008R	for surgery
Seraflex	Serag Wiessner	IC108000	silk thread
Ketamine 10%	Medistar		anesthesia
Rompun (Xylazin) 2%	Bayer		anesthesia
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm	Portex	800/100/100	Catheter
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm	Portex	800/100/200	Catheter
Harvard apparatus 11 Plus	Harvard Apparatus	70-2209	syringe pump
EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin	Thermo Scientific	21335	biotin
Dynabeads Untouched Mouse T-cells	Invitrogen	11413D	to embolize glomeruli
Collagenase A	Roche	10103578001	to digest kidney tissue
DynaMag-2	Invitrogen	123.21D	Magnet catcher
100µm cell stainer	Greiner-bio	542000	for glomerular isolation
Axiovert 40 CFL	Zeiss	non available	to confirm glomerular purity
TissueRuptor	Quiagen	9002755	Tissue homogenizer
CHAPS	Sigma-Aldrich	C3023	for lysis buffer
Tris-HCL	Sigma-Aldrich	T5941	for lysis buffer
NaCl	VWR chemicals	27810295	for lysis buffer
NaF	Sigma-Aldrich	201154	for lysis buffer
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134	for lysis buffer
ATP	Sigma-Aldrich	34369-07-8	for lysis buffer
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	Follow the manufacturer's instructions
nephrin antibody	Progen	GP-N2	for westernblot
Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody	R&D Systems	AF15556-SP	for westernblot
Streptavidin Agarose Resin	Thermo Scientific	20347	for immunoprecipitation
Protein A sepharose CL-4B	GE Healthcare	17096303	for immunoprecipitation
polyclonal rabbit anti-p57 antibody	SCBT	sc-8298	for Immunohistochemistry
mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74	Sigma-Aldrich	A2228	Western blot loading control
rabbit anti-p44/42	cell signalling	4695	for westernblot
Pierce High sensitivity streptavidin-HRP	Thermo Scientific	21130	for westernblot
polyclonal mouse ICAM-2 antibody	R&D Systems	AF774	for westernblot
polyclonal mouse anti-VE-cadherin	R&D Systems	AF1002	for westernblot