腎糸球体と腎糸球体細胞表面タンパク質の標識体内の分離

要約

ここでマウスの体内でビオチンと腎糸球体細胞表面タンパク質のラベリングのためのプロトコルを提案する.このプロトコルは、マウス腎臓の灌流、腎糸球体に分離および興味の蛋白質の内因性の免疫沈降を実行する方法について説明します。

要約

蛋白尿は糸球体のフィルター窓内皮細胞、糸球体基底膜とスリットにダイアフラムの足で構成されているの中断に起因します。デリケートな糸球体のフィルター、特にスリット ダイヤフラムの構造は、さまざまな細胞表面蛋白質の相互作用に依存しています。これらの細胞の表面蛋白質を勉強ところの in vitro研究や組織学的分析にとどまってきた。標識法は、生理学的および病態生理学的条件下での腎糸球体細胞表面タンパク質の研究を可能にするマウス体内の講演を紹介します。このプロトコルは、マウス腎臓の灌流、腎糸球体に分離および興味の蛋白質の内因性の免疫沈降を実行する方法について説明します。腎糸球体細胞表面豊かな半定量はこの手法とビオチン血流にアクセス可能なすべての蛋白質ですぐに利用できる、免疫沈降法を学ぶことができます。さらに、ビオチン化の有無は糸球体を分離できますさらに主糸球体細胞培養 (つまり、プライマリ ポドサイト細胞培養) と同様、糸球体の RNA とタンパク質の解析であります。

概要

蛋白尿は糸球体傷害の特徴で、通常糸球体のフィルター¹の破壊を伴います。糸球体のフィルターは、穴あきの内皮細胞、糸球体基底膜と足細胞で構成されます。デリケートな糸球体のフィルターの分子構造は非常に動的かつセル表面蛋白質両方健康と病気の腎臓^{2,3,4,5,6 で人身売買の対象}.セル表面蛋白質のエンドサイトーシスは、足⁷の生存のために不可欠であると示されています。ネフリンとポドカリキシン足細胞に発現する膜貫通タンパク質であります。ネフリンはスリット糸球体ダイヤフラムのバックボーン ポドカリキシンはコーティング足^8,9,10の二次足プロセス シアロ糖タンパク質。エンドサイトーシスの人身売買は、ネフリンとポドカリキシン^{3,11,12,13,14}以前示されています。

我々 の知る限り、セル表面蛋白質のエンドサイトーシスまだ記載されていない文献で糸球体の内皮細胞。ところが、血管内皮細胞は、一般にエンドサイトーシス (すなわち、クラスリン依存、いかだ依存エンドサイトーシス)^15,16のさまざまな種類のすべての必要な蛋白質を表現します。したがって、血管内皮 (VE) を使用してこのメソッドを学ぶことができる血管内皮細胞表面の人身売買-カドヘリンおよび細胞の細胞接着分子 (ICAM-2)¹⁷糸球体内皮細胞のマーカー蛋白質の表面.

残念ながら、繊細な糸球体 3 層のフィルター表面蛋白質の売買を検討する、セルの正確な体外モデルはありません。このメソッドの目的は、人身売買生体腎糸球体蛋白を勉強します。さらに、このプロトコルには、糸球体、さらに糸球体の RNA、蛋白質、または細胞の解析を有効にするを分離する方法に関する情報が含まれています。^18,19のテクニックは別によって記述されていると同様の糸球体分離グループの。

以前は、私たちと他の人の使用している前のヴィヴォビオチン化^2,3,4,20,21腎糸球体細胞表面蛋白質の分類します。ただし、この前のヴィヴォメソッドで孤立した糸球体は、エンドサイトーシス人身売買に影響を与える可能性があります機械的ストレスにさらされました。また、腎糸球体細胞表面タンパク質の蛍光標識は広範囲で使用されて文学^2,20,22。この方法では、しかし、少数の蛋白質だけを 1 つのスライド内で分析できる、蛍光画像の定量は困難です。

この新しい体内法腎糸球体細胞表面蛋白質豊かさと人身売買で正確に健康と病気、腎臓を勉強する信頼性の高いツールを提供しています、蛍光抗体テストへの追加として使用できます。

プロトコル

マウスは、ローカル動物のケア施設やフランスでジャンビエ ラボから社内品種として得られました。ケアと実験動物の使用 (米国国家機関の健康出版 85-23 号、1996 の改正のため、ガイドに記載されているガイドラインに従って、調査を行った。関連機関の承認に従ってすべての動物実験を行った (州政府 LANUV 参照番号 AZ:84-02.04。2016.A435)。

1. 商品、ソリューション、および装置の準備

1. (MgCl₂) 塩化マグネシウム 1 mM と 0.1 mM 塩化カルシウム (CaCl₂) 添加リン酸緩衝生理食塩水 1 L を準備 (PBSCM) および滅菌フィルターをフィルター処理します。
2. 灌流のマウスごと滅菌 PBSCM 5 mL を準備し、氷の上に置きます。
3. 各マウスの 0.5 mg/mL ビオチンを添加した滅菌 PBSCM 5 mL を準備します。
4. 各マウス滅菌 PBSCM 5 mL を準備し、10⁸磁気ビーズ × 0.8 を追加 (e.g。、200 μ l 前処理なし、4 × 10 の⁸ビーズ/mL の溶液の) 糸球体の塞栓術の。オリジナル チューブ滅菌の磁気ビーズを保つためにセル文化ベンチの下このソリューションを準備します。氷の上には、このソリューションを配置します。
5. 100 mM グリシンを PBSCM (マウスあたり 5 mL) に追加することによって焼入ソリューションを準備し、氷の上にそれを維持します。
6. コラゲナーゼの解決 (0.378 U/mL 中のコラゲナーゼ A 滅菌 PBSCM) を確認します。マウスあたり 2 mL チューブにコラゲナーゼ溶液 1 mL をピペット、氷の上に置きます。
7. 洗浄、滅菌 PBSCM を準備 (手順 1.1 参照) 50 mL のチューブし、氷の上に置きます。
8. 灌流、2.0 mL/min の流量とシリンジ ポンプを使用します。
9. 21 G 針、10 mL シリンジを準備します。針の先端が、20-30 cm の長いカテーテル (内径、ID = 0.58 mm)。カテーテルを接続 (ID 0.58 mm) 10 cm 短いカテーテル (0.28 mm ID) と小さいカテーテルの先端をマウス大動脈に簡単挿入するため斜めカットします。
10. 手術中に手順の合字、マウスごとに 3 つの 5-7 cm シルク スレッド (6 - 0 4-0) をカットします。
11. 手術のため 3 用クランプ、2 外科はさみ、ピンセット 2、2 高級ピンセット、1 高級シザー、綿棒を準備します。(例えば、腹腔内麻酔のケタミン 100 mg/kg 体重とキシラジン 5 mg/kg 体重) 麻酔を準備します。
12. 2 つの腎臓の糸球体の分離、100 μ m の細胞ストレーナー、2 つの 50 ml チューブ、マグネット キャッチャーを使用します。
13. チャップスの換散バッファーの準備: 20 mM 3 [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate (チャップス);20 mM トリス (ヒドロキシメチル)-aminomethan (トリス) pH 7.5;50 mM sodiumchorlide (NaCl);50 mM sodiumfluoride (NaF);15 mM Na₄P₂O₇;0.1 mM エチレンジアミン四酸 (EDTA) pH 8.0;2 mM の sodiumorthovanadate。2 mM adenosinetriphosphat (ATP)。
14. クールなの遠心分離機 4 ° C

2. 顕微鏡下での手術

1. マウスの麻酔 (例えばケタミン ・ キシラジンと腹腔内、手順 1.11 参照)。適切な麻酔を確認するつま先ピンチ テストを実行します。
2. 70% イソプロピル アルコール液をマウスの腹部の側面を消毒します。
3. 胸骨に骨盤から皮膚を通してメディアン カットを実行し、ピンセットを使用して腹部の筋膜から皮膚を削除します。腹部の真ん中、両側手術ハサミで皮膚をカットします。
4. 手術器具を変更します。剣から腹部の筋肉層を通して膀胱にメディアン カットを適用、ピンセット、手術用のはさみを使用して 4 つの象限に分けてください。上の 2 つの脇のマウスの首の方向に 2 つ用クランプとクランプ付します。
   注: 腹部が今開かれます。
5. 滅菌綿棒で取って内臓を入れて、高級ハサミ肝横隔膜靭帯をカットします。
6. 2 つの高級ピンセットで副腎の高さに腎動脈の近位大動脈の周り (6 - 0 絹糸 4-0) で結紮を準備します。ピンセットで血流を廃止する近位大動脈結紮を締めます。
7. 無料の筋膜、脂肪、および他の組織から遠位の大動脈、微細手術用ピンセットを用いた腎動脈の頭蓋の肝/上腸間膜動脈周囲の結紮を準備します。
8. 腎動脈の遠位腹部大動脈周囲 (6 - 0 絹糸 4-0) で結紮を準備し、クランプ下大静脈と大動脈分岐部の高さで。
9. 小さな穴にカット大動脈遠位腎動脈大動脈の直径の半分穴があるので。大動脈にカテーテルを入れ、合字の準備でそれを修正します。
   注意: は、空気塞栓を防ぐために灌流システムの泡を避けるため。
10. 灌流を 2 mL/min の流速で冷えた PBSCM に始まります。
11. 微細手術用はさみで腎動脈のレベルで腎静脈に穴をカットし、肝および腸間膜動脈を結紮を締めます。
    注: 腎臓は灌流を開始した後淡いに向ける必要があります。

3生体内でビオチン化。

1. 変更バブル無料の冷たい PBSCM を注射器は、ラベリング、表面のビオチンは 0.5 mg/mL を添加した、2 mL/min の流量で 5 mL と腎臓の灌流します。
   注: ミックス (例えば、 50 mL のチューブを回して) PBSCM ソリューション ソリューション内の泡の形成を避けるために優しく。シリンジ内溶液の吸引後、シリンジから空気や泡を避難します。カテーテル システムに接続されているカニューレのスペースを埋めるための注射器で余分なカニューレ (21 G) を使用します。最後に、泡なしカテーテル、カニューレに注射器を付けなさい。
2. 無気泡シリンジを糸球体を消すし、2 mL/min の流量で 5 ml を灌流する 100 mM グリシンを添加した氷の PBSCM に変更します。
3. 変更バブル無料の冷たい PBSCM をシリンジ 200 μ L 磁気ビーズ/mL を添加した、2 mL/分で腎臓の灌流します。
   注: 腎臓表面に茶色の磁気ビーズと糸球体の塞栓術、表示されます。

4. 糸球体 2 つの腎臓からの分離

1. 門で腎臓、カプセルを取り外します。10 cm の細胞培養皿の PBSCM の 15 mL の氷に腎臓を配置します。腎臓を収穫後麻酔下頚部転位とマウスを安楽死させます。手術および灌流の手順の最後約 20-22 分。
2. 粉々 にカット腎臓、最小可能な新しいダブル エッジ刃を持つ。コラゲナーゼ A の 1 ml 2 mL チューブに組織を移動 (ステップ 1.6 参照) と 37 ° C, 30 分のダイジェスト。前に、消化後に、軽く 1000 μ L ピペットをカット ミックスします。
3. 冷たい PBSCM を使用して 100 μ m 携帯こし器を通って消化組織をすすいでください。優しく細胞スクレーパーを使用して、残り組織トラフ セル ストレーナーをミンチし、50 mL の容量にその後冷えた PBSCM でそれをすすいでください。
4. 4 ° C 500 x グラムの懸濁液を遠心分離機 5 分、上清を除去し、ボルテックス ペレット中の冷たい PBSCM 1.5 mL 弱でペレットを再懸濁します。その後、糸球体の懸濁液を新しい 2 mL チューブに入れます。

5. 洗浄

1. マグネット キャッチャーを使用して、1 つの側面に糸球体を抽出します。糸球体の磁石に向かって移動している前に 1 分間待ちます。
2. マグネット キャッチャーに 2 mL 管したまま 1000 μ L ピペットで上澄みを削除します。最初と 2 番目の洗濯中にステップは糸球体の損失を避けるために管のままに清の 250 μ L を (ステップ 5.3 を参照)。この手順では、すぐにチューブの底に沈む管状構造をさせることを避けるため。
   注: 洗濯手順長く持続するそれ以外の場合。
3. マグネット キャッチャーから 2 mL チューブを外し、PBSCM、(非常に重要)、その後上下のピペット 1 mL を加える渦。
4. マグネット キャッチャーにチューブを戻すし、5.2 でやり直します。
5. 糸球体の純度が 90% に達するまでは、洗浄のステップを繰り返します。これは、顕微鏡 (40 〜 100 倍) で清の代表的な因数を調べてください。
   注: 糸球体は、茶色の磁気ビーズを含むラウンド構造として表示されます。細長い構造は鋼管のフラグメントあり無料磁気ビーズは、茶色の丸い点として表示されます。かさばる構造体として細胞の残骸があります。
6. 純度に達した場合は、1 ml PBSCM の球体を溶解することにより糸球体の数を見積もります。混合した後、10 μ L の因数を取り出して顕微鏡下で糸球体をカウントします。次の式により糸球体の数を計算する: 最終的な糸球体数 = 10 μ L 分注 x 100 で糸球体の数。
7. 糸球体の分離を成功させるは、10,000-40,000 の球体の範囲に します。

6 蛋白質の抽出と免役沈降法 (IP)

1. 6800 x g で 5 分間で 4 ° C で遠心分離によって収集糸球体マグネット キャッチャーを使用しながら上澄みを除去し、冷たい換散バッファーでペレットを再懸濁します (e.g、300 μ l; 30,000 糸球体。チャップスを 1.11 の手順を参照)。30 の最高速度で組織ホモジナイザーを用いたサンプルを均質化 s させ、30 分間氷の上にそれらを分離します。
2. 4 ° C で 30 分間 15,000 × g で遠心分離によっての不溶性物質を削除します。ピペットの上清を新しい 1.5 mL チューブに lysate のセルが含まれます。ペレットを破棄します。
3. ビシンコニン (BCA) を使用して、上清のタンパク質濃度の測定-製造元の指示に従って手法します。700-1,000 μ g/mL の糸球体蛋白量に 30,000 糸球体の成功溶解をもたらします。換散バッファーと同じ蛋白質量を調整します。
4. 糸球体の総体積の 10% の因数を取るライセート、95 ° C で塩化物イオン + 5 分間インキュベーションする前に dithiothreithol (DTT) x 2 を追加
5. IP、頭上式シェーカーで 4 ° C で一晩ストレプトアビジン アガロース ビーズ ライセートの残りの部分を孵化させなさい。
6. アガロース ビーズ 4 ° C で 3 分間 1000 × g で遠心、上清を削除し、非特異的タンパク質結合のビーズを洗浄する換散バッファーの 800 μ L を追加します。
7. 3 回、洗浄を繰り返し、上清を完全に削除します。
8. 塩化物イオン + DTT × 2 の 30 μ L を追加し、95 ° C、5 分で孵化させなさい。
9. ライセートを読み込むと IP プローブ 10 %sds のゲルし 70 V、30 分間で 20 で SDS のゲルを実行 1.5 h. のためのゲルあたり mA はその後、200 で 2 h のためのゲルをしみニトロセルロース膜に mA。
10. 洗浄液に一晩 5% ウシ血清アルブミン (BSA) で 4 ° C で硝酸セルロースの膜をブロックします。
11. 4 ° C で一晩興味の抗体を持つ膜をインキュベートします。シェーカー上で 5 分間 3 回バッファーを洗浄洗浄し、室温で 1 h の HRP 標識二次抗体と膜を孵化させなさい。洗浄手順を繰り返します。
12. ライセートを視覚化し、CCD カメラで超解像化学発光剤を用いて、膜プローブを免疫沈降.

結果

糸球体を正確に分離するには、最初 PBSCM とマウスの腎臓を灌流する必要は。PBSCM による血液灌流腎淡 (図 1A) になります。磁気ビーズと糸球体の塞栓術、腎臓の表面 (図 1B) に茶色のドットとして表示されます。マグネット キャッチャーで糸球体の分離は、(図 1C) ...

ディスカッション

提案手法により糸球体糸球体 RNA か蛋白質を調査するための分離を成功させる。さらに、プライマリの腎糸球体細胞文化は分離の腎糸球体から実行できます。ビオチンは、糸球体の分離の前に適用されます、腎糸球体細胞表面蛋白質の分類が実行できます。この方法では、体内の腎糸球体細胞表面タンパク質輸送を学ぶことができると蛋白質量の半定量が可能です。腎糸球体細胞の表?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Motic SMZ168 BL	Motic	SMZ168BL	microscope for mouse surgery
KL1500LCD	Pulch and Lorenz microscopy	150500	light for mouse surgery
Rompun (Xylazin) 2%	Bayer	PZN:01320422	anesthesia
Microfederschere	Braun, Aesculap	FD100R	fine scissors, for cut into the aorta
Durotip Feine Scheren	Braun, Aesculap	BC210R	for abdominal cut
Anatomische Pinzette	Braun, Aesculap	BD215R	for surgery until the abdomen is opened
Präparierklemme	Aesculap	BJ008R	for surgery
Seraflex	Serag Wiessner	IC108000	silk thread
Ketamine 10%	Medistar		anesthesia
Rompun (Xylazin) 2%	Bayer		anesthesia
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm	Portex	800/100/100	Catheter
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm	Portex	800/100/200	Catheter
Harvard apparatus 11 Plus	Harvard Apparatus	70-2209	syringe pump
EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin	Thermo Scientific	21335	biotin
Dynabeads Untouched Mouse T-cells	Invitrogen	11413D	to embolize glomeruli
Collagenase A	Roche	10103578001	to digest kidney tissue
DynaMag-2	Invitrogen	123.21D	Magnet catcher
100µm cell stainer	Greiner-bio	542000	for glomerular isolation
Axiovert 40 CFL	Zeiss	non available	to confirm glomerular purity
TissueRuptor	Quiagen	9002755	Tissue homogenizer
CHAPS	Sigma-Aldrich	C3023	for lysis buffer
Tris-HCL	Sigma-Aldrich	T5941	for lysis buffer
NaCl	VWR chemicals	27810295	for lysis buffer
NaF	Sigma-Aldrich	201154	for lysis buffer
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134	for lysis buffer
ATP	Sigma-Aldrich	34369-07-8	for lysis buffer
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	Follow the manufacturer's instructions
nephrin antibody	Progen	GP-N2	for westernblot
Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody	R&D Systems	AF15556-SP	for westernblot
Streptavidin Agarose Resin	Thermo Scientific	20347	for immunoprecipitation
Protein A sepharose CL-4B	GE Healthcare	17096303	for immunoprecipitation
polyclonal rabbit anti-p57 antibody	SCBT	sc-8298	for Immunohistochemistry
mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74	Sigma-Aldrich	A2228	Western blot loading control
rabbit anti-p44/42	cell signalling	4695	for westernblot
Pierce High sensitivity streptavidin-HRP	Thermo Scientific	21130	for westernblot
polyclonal mouse ICAM-2 antibody	R&D Systems	AF774	for westernblot
polyclonal mouse anti-VE-cadherin	R&D Systems	AF1002	for westernblot